吳先闖，宋衛(wèi)中，宋曉勇，康文藝，侯彥濤，張永州，張曉堅(jiān)，張凌云，盧 紅，劉瑜新

1. 河南大學(xué) 淮河醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475001； 2. 河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開(kāi)封 475004； 3. 河南省醫(yī)藥學(xué)校，河南 開(kāi)封 475003； 4. 鄭州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，鄭州450052

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菝葜體外抗肝癌細(xì)胞活性物質(zhì)篩選

1. 河南大學(xué) 淮河醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475001； 2. 河南大學(xué) 中藥研究所，河南 開(kāi)封 475004； 3. 河南省醫(yī)藥學(xué)校，河南 開(kāi)封 475003； 4. 鄭州大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，鄭州450052

〔目的〕 篩選菝葜抗肝癌細(xì)胞的活性物質(zhì)，為臨床應(yīng)用菝葜輔助治療肝癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！卜椒ā?采用不同工藝制備菝葜提取物，將菝葜提取分離為乙醇粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，利用MTT法檢測(cè)4種物質(zhì)部位對(duì)肝癌細(xì)胞H22、HepG-2、BEL-7402的體外生長(zhǎng)抑制?！步Y(jié)果〕 從菝葜分離提取的4種物質(zhì)部位均有不同程度抗肝癌細(xì)胞活性，其中乙酸乙酯部位抗肝癌細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)，并在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系?！步Y(jié)論〕 乙酸乙酯部位為菝葜主要抗肝癌細(xì)胞活性物質(zhì)。

菝葜；肝癌細(xì)胞；乙醇提取物；乙酸乙酯部位

肝癌是一種十分常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤，其病死率高、危害性大，已經(jīng)位居世界腫瘤性疾病的第 3 位，且有逐年升高的趨勢(shì)[1]。大多數(shù)病例在確診時(shí)肝功能儲(chǔ)備已很差，化療藥的細(xì)胞毒性會(huì)進(jìn)一步損害正常肝細(xì)胞，使肝臟功能進(jìn)一步惡化。因此，尋找和開(kāi)發(fā)高效低毒的抗肝癌藥物具有十分重要的意義。菝葜(SmilaxchinaL.)為百合科菝葜屬植物，又名鐵菱角、金剛藤、王瓜草、金剛樹(shù)，性平，味甘酸，其根、莖、葉均可入藥，尤以根莖入藥最為常見(jiàn)。該中藥收載于《中國(guó)藥典》2015 版一部，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功能[2]。民間常用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛及惡性腫瘤(如食管癌、胃癌、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌等)的治療。菝葜是中醫(yī)臨床治療腫瘤疾患的常用配伍組方藥味。有人[3-6]報(bào)道菝葜的黃酮類、鞣質(zhì)類成分具體外抗肺癌作用，菝葜皂苷及乙酸乙酯提取物具有抗腫瘤作用，菝葜的醋酸乙酯部位在抗炎和抗腫瘤方面有著獨(dú)特的療效[7]。其乙醇提取物的各萃取部位抗肝癌生物活性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。我們采用乙醇提取，經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后得到3個(gè)化學(xué)部位，觀察菝葜乙醇提取液及3個(gè)化學(xué)部位抗肝癌活性，探討菝葜抗肝癌的單一活性部位，從而使有效物質(zhì)富集度高，藥效物質(zhì)相對(duì)明確，藥理活性相對(duì)穩(wěn)定，為進(jìn)一步利用菝葜抗肝癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料

1.1藥材與試劑

中藥菝葜購(gòu)于開(kāi)封市天濟(jì)堂藥店，經(jīng)河南大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)叢悅教授鑒定為百合科植物菝葜(SmilaxchinaL.)的根莖。

RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó) Gibco-BRL 公司)，胎牛血清(天津市源洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，0. 25% 胰蛋白酶(美國(guó) Gibco公司)，二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma-Aldrich 公司) ，3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，美國(guó)Ameresco)。其余試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞株

小鼠肝癌H22細(xì)胞由河南大學(xué)藥學(xué)院提供，體內(nèi)接種傳代保存。人肝癌BEL-7402、H epG2細(xì)胞株(美國(guó) ATCC 公司)，在含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其內(nèi)加入青霉素(100 μmol/L)、鏈霉素(100 μmol/L)，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2.5 g/L胰酶消化傳代。

1.3儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo Forma，日本)；HDL 潔凈臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；UV-2000型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)；LGR16-W 型高速冷凍離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；800 型酶標(biāo)儀(Bio-Tek)；Forma 3110 CO2培養(yǎng)箱；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)；XDS-500D 型倒置熒光顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。

2　方法

2.1供試藥物的制備

取中藥菝葜干燥根莖，分別用10倍量體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇熱回流提取3次，每次提取1 h，過(guò)濾，收集提取液；藥渣再用10倍量體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇熱回流提取3次，每次提取0.5 h，過(guò)濾，收集濾液；將2次不同濃度的乙醇提取液合并，減壓回收溶劑，濃縮至浸膏狀，得菝葜乙醇總提物。用適量熱蒸餾水將菝葜乙醇總提物浸膏進(jìn)行分散，依次用等體積石油醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇萃取3～5次并減壓回收每個(gè)萃取部位溶劑，濃縮后分別得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。

將乙醇總提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位溶解于DMSO，然后用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度，備用。

2.2供試品對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

小鼠肝癌H22細(xì)胞體內(nèi)接種傳代。人肝癌BEL-7402、HepG-2細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，將復(fù)蘇好的細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、10萬(wàn)U/L的青霉素、100 mg/L的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃、相對(duì)濕度為95%、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。BEL-7402和HepG-2細(xì)胞 3～4 d傳代1次。

取接種腫瘤 7 d 后且生長(zhǎng)良好的H22肝癌腹水型荷瘤小鼠，將其頸椎脫臼處死，在無(wú)菌條件下抽取乳白色腹水，細(xì)胞經(jīng)PBS液洗滌2次(1 000 r/min，5 min)，調(diào)整細(xì)胞數(shù) 5×104個(gè)/mL；同時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2、BEL-7402細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù) 5×104個(gè)/mL。將上述3種細(xì)胞以每孔100 μL接種于96孔板中。培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清液，于上述96孔板中加入不同濃度的待測(cè)樣品液100 μL(使終質(zhì)量濃度分別為10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)，每個(gè)濃度平行6個(gè)復(fù)孔。以0.1%的DMSO作空白于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后除去培養(yǎng)基，加含MTT0.5 g/L的PBS每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后除去孔內(nèi)的液體，加入DMSO每孔10 μL，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上570 nm處測(cè)吸光度A。則

2.3數(shù)據(jù)處理

3　結(jié)果

菝葜提取物對(duì)H22、HepG-2、BEL-7402三種細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與對(duì)照組比較，菝葜乙酸乙酯部位組抑制肝癌細(xì)胞的存活率最強(qiáng)，菝葜乙酸乙酯部位抗肝癌細(xì)胞活性優(yōu)于其乙醇粗提物和石油醚及正丁醇部位，并具計(jì)量效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1　菝葜不同萃取部位對(duì)3種肝癌細(xì)胞增殖抑制的影響

4　討論

菝葜具有多方面的生物活性，

其有效成分具有

抗炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀、免疫抑制、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[8]。我們通過(guò)對(duì)菝葜進(jìn)行乙醇提取，然后利用不同溶劑進(jìn)行萃取，得到菝葜乙醇總提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。選取小鼠肝癌細(xì)胞H22和人肝癌細(xì)胞HepG-2、BEL-7402為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株，采用MTT法測(cè)定菝葜醇提物及各萃取部位對(duì)3種肝癌細(xì)胞的活性影響，比較了菝葜不同部位對(duì)3種肝癌細(xì)胞的抑制活性作用強(qiáng)弱。研究結(jié)果表明，菝葜乙酸乙酯部位對(duì)3種肝癌細(xì)胞抑制活性最強(qiáng)，且在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，說(shuō)明菝葜醇提物的乙酸乙酯部位具有良好的體外抗肝癌細(xì)胞活性，為進(jìn)一步詮釋菝葜治療肝癌的物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Kanda T, Jiang X, Yokosuka O. Androgen receptor signaling in hepatocellular carcinoma and pancreatic cancers[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(28):9229-9236．

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典：一部[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:290.

[3] Wu Lisheng, Wang Xiaojing, Jia Aiqun. Cytotoxic polyphenols against breast tumor cell inSmilaxchinaL.[J]. J Ethnopharmacol, 2010(130):460-464.

[4] 邱千，戴琪，陳樹(shù)和，等. 菝葜體外抗非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞活性物質(zhì)研究[J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥，2014,16(1):12-20.

[5] 徐燕，王海燕，蔣家月，等. 菝葜中的甾體皂苷及其細(xì)胞毒活性[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011,17(11):92-96.

[6] 王濤，王鵬．菝葜乙酸乙酯提取物抗癌活性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 腫瘤基礎(chǔ)及臨床，2007,20(3):234-236.

[7] 趙鐘祥，馮育林，阮金蘭，等. 菝葜化學(xué)成分及其抗氧化活性的研究[J]. 中草藥，2008,39(7):975-977.

[8]羅艷琴，馬云，宋路瑤，等. 菝葜有效成分及其藥理作用研究概述[J]. 中藥材，2013,36(3):502-504.

[責(zé)任編輯李武營(yíng)]

Screening of anti-HCC Components from Rhizomes of Smilax china L. in vitro

1. Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475001, China; 2. The Institute of Traditional Chinese Medicine, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 3. Henan Fharmaceutical School, Henan Kaifeng 475003, China; 4. The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

〔Objective〕To Screen anti-HCC active components from the rhizomes ofSmilaxchinaL. and provide experimental basis for clinical application treatment of liver cancer. 〔Methods〕Ethanol crude extracts, petroleum extracts, ethyl acetate extracts and n-butylalcohol extracts were extracted and separated fromSmilaxchinaL. by using solvent method. The survival rates of H22、HepG-2、BEL-7402 were measured by MTT. 〔Results〕All the extracts had different anti-HCC activities tannins showed the best activity against H22、HepG-2、BEL-7402 cells and presented good dose-effect relationship.〔Conclusion〕Ethyl acetate extracts are the main anti-HCC ingredients of the rhizomes ofSmilaxchinaL.

SmilaxchinaL.; hepatoma carcinoma cell; ethanol crude extracts; ethyl acetate extracts

1672-7606(2016)02-0089-03

2016-02-17

河南省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(144300510019)

吳先闖(1985-)，男，河南開(kāi)封人，碩士，主管藥師，從事臨床藥學(xué)研究工作。

宋曉勇(1972-)，男，河南開(kāi)封人，主任藥師，教授，從事臨床藥學(xué)教學(xué)與科研工作。

R979.1

A