蘇會(huì)嵐（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川成都610500）

基于納米金與牛血清白蛋白-碳納米管復(fù)合物修飾的microRNA電化學(xué)傳感器的研究

蘇會(huì)嵐*
（成都醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，四川成都610500）

該文采用納米金和牛血清白蛋白（BSA）-碳納米管固載核酸探針制得高靈敏microRNA電化學(xué)傳感器。首先，使碳納米管在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的BSA中分散，并將其滴涂在玻碳電極上成膜，將識(shí)別探針ssRNA固載到電極表面，制得microRNA電化學(xué)傳感器。采用循環(huán)伏安法對(duì)電極的制備過程及響應(yīng)特性進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該修飾電極對(duì)microRNA電化學(xué)響應(yīng)的濃度線性范圍為0.1～150 nmol/L，檢出限為0.03 nmol/L。該方法具有較高靈敏度、良好的選擇性和穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA的定量分析。

碳納米管；納米金；電化學(xué)傳感器；microRNA

0　引言

MicroRNAs（miRNA，miR）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通常為19～25個(gè)核苷酸，在細(xì)胞的分化、增殖、腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，是當(dāng)前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿之一［1-2］。研究表明，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的疾病標(biāo)志物［3-5］。目前，用于檢測(cè)血清miRNA的方法主要有qRT-PCR、微陣列芯片技術(shù)等［6-7］。然而，這些方法存在成本高、步驟繁瑣、易污染等缺點(diǎn)。而電化學(xué)生物傳感器是將生物識(shí)別作用與電化學(xué)分析技術(shù)結(jié)合在一起的新型生物分析技術(shù)，具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、成本低、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，可望用于miRNA的臨床檢測(cè)。

生物識(shí)別分子的固定化是生物傳感器制備過程中的關(guān)鍵技術(shù)之一，能否保證生物分子的識(shí)別活性關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確程度。生物分子的固定化材料主要有納米材料、有機(jī)高分子材料及其它生物材料。其中，基于碳納米管的復(fù)合納米材料具有比表面積大，導(dǎo)電性能佳的特點(diǎn)，通過在電極表面的有效固載可有效增大電極比表面積，提高電極表面的電子傳輸效率［8-10］?；诖耍撗芯客ㄟ^在電極表面自組裝牛血清白蛋白和碳納米管的復(fù)合物，再通過電沉積法修飾一層納米金，進(jìn)一步固載識(shí)別ssRNA，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)作用實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)miRNA的檢測(cè)。該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，可望應(yīng)用于臨床核酸檢測(cè)中。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

CHI660電化學(xué)工作站 （上海辰華儀器公司），BRANSONIC200超聲清洗儀（德國(guó)），MP230酸度計(jì)（瑞士Mettler-toledo公司），AB204-S電子天平（瑞士Mettler-toledo公司），所有玻璃儀器用k2Cr2O7-H2SO4浸泡，超聲清洗儀超聲，晾干。

miR-21（5'-CAA CAC CAG UCG AUG GGC UGU-3'）、ssRNA（5'-SH-ACA GCC CAU CGA CUG GUG UUG-3'）購于大連寶生物。巰基己烷（HT，96%）、氯金酸、牛血清白蛋白（BSA）購于sigma公司，碳納米管（MWNTs）購于深圳納米港科技有限公司。實(shí)驗(yàn)室用水均為二次去離子水。

1.2miRNA電化學(xué)傳感器的制備

1.2.1BSA-碳納米管復(fù)合物的制備

MWNT使用前，用濃硝酸∶濃硫酸（3∶1）80℃處理5 h，水洗后真空干燥。在3.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的BSA中加入5 mg碳納米管，超聲2 h，既得BSA-MWNTs復(fù)合物。

1.2.2miRNA電化學(xué)傳感器的制備

將玻碳電極（GCE）在1.0，0.3 μm的Al2O3糊中將電極表面拋光成鏡面，用蒸餾水和無水乙醇交替超聲5次，室溫晾干。將10 μL所制得的BSA-MWNTs復(fù)合物滴涂于預(yù)處理好的電極表面，自然晾干后利用電化學(xué)還原HAuCl4的方法在GCE表面沉積上一層納米金，之后將10 μL ssRNA滴涂在修飾電極表面。4°C下放置6 h。最后用HT封閉電極上非特異性吸附位點(diǎn)，即制得miRNA電化學(xué)傳感器。將電極置于4°C的冰箱中保存待用。

1.3檢測(cè)方法

利用循環(huán)伏安法（CV）對(duì)電極的制備過程進(jìn)行電極制備過程的表征，參比電極為飽和甘汞電極，Pt電極為對(duì)電極，修飾的玻碳電極為工作電極，電極表征在5 mmol/L K3Fe（CN）6+K4Fe（CN）6+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS（pH=7）溶液中進(jìn)行，循環(huán)伏安法電位區(qū)間為-0.2～0.6 V，掃描速率為50 mV/s。

2　結(jié)果與討論

圖1　電極修飾過程的循環(huán)伏安表征：（a）GCE；（b）GCE/MWNTs-BSA；（c）GCE/MWNTs-BSA/DpAu；（d）GCE/MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA；（e）GCE/MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA/HT；（f）識(shí)別miR-21Fig.1　Cyclic voltammograms of different electrodes：（a）GCE；（b）GCE/MWNTs-BSA；（c）GCE/MWNTs-BSA/ DpAu；（d）GCE/MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA；（e）GCE/ MWNTs-BSA/DpAu/ssRNA/HT；（f）linked miR-21

2.1電極在修飾過程中的電化學(xué)表征

用循環(huán)伏安法研究電極在組裝過程中的電化學(xué)特性，其結(jié)果示于圖1。曲線a是裸電極在鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安表征圖，圖示一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰；將BSA-MWNTs納米復(fù)合膜滴涂于玻碳電極表面后，由于惰性蛋白BSA阻礙電子傳遞，導(dǎo)致峰電流有所降低（曲線b）；利用電化學(xué)還原HAuCl4的方法在修飾電極表面沉積一層納米金，由于DpAu-MWNTs納米復(fù)合膜的形成，增大比表面積的同時(shí)峰電流顯著升高（曲線c）；曲線d是ssRNA固定在電極表面之后的循環(huán)伏安圖，由于核酸分子阻礙電子傳輸，峰電流有所降低；之后用HT封閉非特異性吸附位點(diǎn)，峰電流繼續(xù)降低（曲線e）；最后將修飾好的電極用于結(jié)合目標(biāo)miRNA，生成的核酸復(fù)合物部分堵塞修飾電極表面的電子傳輸通道，致使其響應(yīng)電流進(jìn)一步下降（曲線f）。

圖2　修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖，插圖為峰電流與掃速的關(guān)系曲線Fig.2　Cyclic voltammograms of the modified electrode in the 0.1 mol/L phosphate butter solution at scan rate of （from inner to outer）：10，30，50，80，100，120，140，160，180，200，300 and 350 mV/s；Inset：plot of peak current vs scan rate

圖3　修飾電極在不同pH值下的循環(huán)伏安圖Fig.3　Cyclic voltammograms of the modified electrode in detection solution with different pH

圖4　溫度對(duì)傳感器的影響Fig.4　The effect of incubation temperature on the response of the biosensor

2.2掃描速度對(duì)傳感器響應(yīng)的影響

對(duì)不同掃描速度下電化學(xué)傳感器的循環(huán)伏安曲線進(jìn)行了表征。由圖2可見準(zhǔn)可逆的氧化還原曲線，隨著掃速的變化，氧化峰電流和還原峰電流值都隨之增加，并且和掃速平方根成正比（插圖），說明電極氧化還原受擴(kuò)散過程控制。

2.3實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1pH對(duì)修飾電極的影響

pH對(duì)生物分子的活性有較大影響。在pH從4.0～7.5范圍內(nèi)的PBS中，用循環(huán)伏安法測(cè)試不同pH下修飾電極的循環(huán)伏安曲線 （如圖3），其中當(dāng)pH為7.0時(shí)，氧化還原峰電流均達(dá)到最大值。故該文選擇pH7.0的PBS作為測(cè)試底液。

2.3.2溫度的選擇

溫度是影響生物識(shí)別反應(yīng)的一個(gè)重要因素，該實(shí)驗(yàn)在5～40℃范圍內(nèi)考察了溫度與反應(yīng)信號(hào)的關(guān)系。結(jié)果表明隨著溫度從5～40℃升高，響應(yīng)電流減小，說明生物識(shí)別反應(yīng)的程度逐漸增加。由圖4可知水浴溫度為35℃時(shí)核酸結(jié)合已經(jīng)比較穩(wěn)定。當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速率增加，但溫度過高也會(huì)引起核酸分子變性，減少使用壽命，溫度太低會(huì)使生物識(shí)別作用不夠或作用時(shí)間延長(zhǎng)，不利于電極的穩(wěn)定性。因此綜合考慮選擇水浴溫度為35℃。

2.3.3孵育時(shí)間的選擇

堿基互補(bǔ)配對(duì)反應(yīng)完成的程度與反應(yīng)時(shí)間有關(guān)，將修飾有核酸分子的電極放入1 nmol/L miR-21溶液中，反應(yīng)不同時(shí)間，用循環(huán)伏安法測(cè)定其響應(yīng)電流的變化，其結(jié)果示于圖5。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)30 min時(shí)，電極上結(jié)合的miR-21達(dá)到飽和，響應(yīng)電流逐漸穩(wěn)定。故實(shí)驗(yàn)過程中選擇的最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min。

圖5　孵育時(shí)間對(duì)傳感器的影響Fig.5　The effect of incubation time on the response of the biosensor

2.4miRNA電化學(xué)傳感器的響應(yīng)特性

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法測(cè)定了修飾電極對(duì)不同濃度miRNA的響應(yīng)特性。當(dāng)溶液中的抗原和電極表面的抗體專一性結(jié)合后，生成的抗原-抗體復(fù)合物堵塞了修飾電極表面的電子傳輸通道，從而致使其響應(yīng)電流下降。CEA抗原的濃度越高，敏感膜上生成的抗原-抗體復(fù)合膜就越多，響應(yīng)電流下降就越明顯。如圖6所示。

圖7為該電極的響應(yīng)曲線。miR-21濃度在0.1～150 nmol/L的范圍內(nèi)該傳感器與峰電流的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為：y= -12.58x+137.41，相關(guān)系數(shù) 0.9951，檢測(cè)限為0.03 nmol/L。

2.5miR-21傳感器的選擇性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性

選擇性研究：在1 nmol/L的miR-21中分別加入了甲胎蛋白、癌胚抗原、牛血清白蛋白、葡萄糖、miR-155，響應(yīng)電流的變化分別為 2.1%，1.9%，3.4%，2.8%，5.1%，表明該傳感器具有良好選擇性。

重現(xiàn)性研究：同時(shí)制備6支電極用于測(cè)定1 nmol/L的miR-21，響應(yīng)結(jié)果顯示，電流變化值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%（n=6），表明該傳感器重現(xiàn)性較好。

穩(wěn)定性研究：將傳感器置于測(cè)試底液中連續(xù)掃描100圈后，其氧化峰電流變化值小于5%，說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

圖6　修飾電極在不同濃度CEA下的循環(huán)伏安圖，從里到外濃度分別為0.1，0.2，0.6，1，5，10，20，40，80，100，120以及150 nmol/LFig.6　Cyclic voltammograms of the modified electrode in concentration of CEA of 0.1，0.2，0.6，1，5，10，20，40，80，100，120 and 150 nmol/L from inner to outer，at scan rate 50 mV/s

圖7　電流響應(yīng)值與miR-21濃度的關(guān)系曲線Fig.7　Linear relationship between the peak current and Cyclic voltammograms of the biosenor in different concentration of miR-21

3　結(jié)論

該文研究了一種快速，簡(jiǎn)單，靈敏的電化學(xué)傳感器。通過電化學(xué)方法沉積納米金可有效固載核酸分子，并結(jié)合導(dǎo)電性能好、比表面積大的MWNTs-BSA復(fù)合物，成功構(gòu)建了高靈敏的miRNA電化學(xué)傳感器。該傳感器具有較低的靈敏度和較寬的線性范圍、步驟簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性和選擇性良好，可望用于miRNA的檢測(cè)中。

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An electrochemical biosensor for microRNA detection based on gold nanoparticles and multi-wall carbon nanotube-BSA composite

Su Hui-lan*
（The department of public health，Chengdu medical college，Chengdu，610500，China）

A highly sensitive amperometric biosensor for the determination of microRNA was developed based on the multilayer，comprised of bovine serum albumin（BSA），multi-wall carbon nanotubes（MWNTs），gold nanoparticles（nano-Au）.First of all，to obtain functional MWNTs by BSA（BSA-MWNTs），the MWNTs were dispersed inω（BSA）=0.25%.After that，based on electrochemical deposition of Au3+onto nano-Au/BSA-MWNTs surface，a functionalized multilayer（DpAu/BSA-MWNTs）modified electrode was fabricated.At last，the immunosensor was prepared after the ssRNA absorbed to the surface of the modified electrode.The stepwise fabrication process of the biosensor was characterized by the cyclic voltammetrys.The results show that the immunosensor present highly sensitivity，and a broader liner response from 0.1～150 nmol/L with a detection limit of 0.03 nmol/L，as well as good stability and selectivity.

MWNTs；nano-Au；immunosensor；microRNA

四川省教育廳科研項(xiàng)目（13ZB0228），成都醫(yī)學(xué)院科技基金項(xiàng)目（CYZ12-004），國(guó)家自然科學(xué)基金（81401757）

*通信聯(lián)系人，Tel:（028）62739576，E-mail:suhuilan1986@163.com