楊成成，李　洋，馬　驕，夏　巧，傅英姿

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

金納米花-人血清白蛋白對色氨酸對映異構(gòu)體的手性識別

楊成成，李洋，馬驕，夏巧，傅英姿*

（西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

將人血清白蛋白（HSA）自組裝于金納米花（AuNFs）修飾的玻碳電極表面，從而構(gòu)建了一個簡單的手性傳感界面，利用方波伏安技術(shù)（SWV）研究了該修飾電極與色氨酸對映異構(gòu)體（D-Trp和L-Trp）的相互作用。實驗結(jié)果表明，當(dāng)D-或L-Trp與手性界面作用后，電極表面電子傳遞受阻，表現(xiàn)為不同的方波響應(yīng)；其中LTrp的峰電流明顯低于D-Trp，峰電流差值達(dá)到123.7μA；峰電流與濃度在1.0×10-6mol/L到5.0×10-3mol/L范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。

手性識別；人血清白蛋白；色氨酸；金納米花

0　引言

手性（chirality）是物質(zhì)與其自身的鏡像不能重合的特性，是自然界和生命體的基本屬性［1］。手性廣泛存在于生命科學(xué)、藥物科學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域，對生命體的活動起到至關(guān)重要的作用。蛋白質(zhì)、DNA、氨基酸、酶等生物分子在生物體內(nèi)構(gòu)成了一個復(fù)雜且龐大的手性系統(tǒng)，其中氨基酸作為生命物質(zhì)的基本單元，不同構(gòu)型的氨基酸在生命科學(xué)和其他相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮著不同的作用［2-3］，如L-氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，而D-氨基酸不僅不參與蛋白質(zhì)的合成，甚至?xí)ι矬w產(chǎn)生生理毒性［4］。L-Trp作為組成蛋白質(zhì)的第二必需氨基酸，既可以決定蛋白質(zhì)的生理活性，又在人和動物的成長和代謝過程中起著不可或缺的作用［5］。當(dāng)人體內(nèi)L-色氨酸的含量過低時可能會導(dǎo)致人體產(chǎn)生焦慮、抑郁等不良反應(yīng)［6-7］。D-色氨酸（D-Trp）雖然不參與蛋白質(zhì)的合成，但它卻是制藥工程中肽類抗生素和免疫抑制劑的重要合成中間體［8］。因此，在生命科學(xué)和制藥工程中，對色氨酸對映異構(gòu)體純度和含量的檢測變得至關(guān)重要［9］。目前為止，多種檢測技術(shù)已被用到色氨酸對映異構(gòu)體的識別和檢測中，如高效液相色譜法［10］、毛細(xì)管電泳法［11］、熒光微量法［12］、化學(xué)發(fā)光法［13］和電化學(xué)方法［14］。其中，由于易操控、成本低、穩(wěn)定性好和靈敏度高的優(yōu)點，電化學(xué)方法已被廣泛用于色氨酸對映異構(gòu)體的識別和檢測［15-16］。

人血清白蛋白（HSA）是由585個氨基酸殘基組成的單鏈蛋白質(zhì)，有3個結(jié)構(gòu)相似的ɑ-螺旋結(jié)構(gòu)域。人血清白蛋白分子中含有17個二硫鍵［17］，可與貴金屬牢固結(jié)合［18］，而且貴金屬納米材料如納米金與之結(jié)合后，由于良好的生物相容性，對蛋白質(zhì)的生物活性也無影響［19］；納米金良好的電子傳遞能力［20］、較高的比表面積［21］等特點在一定程度上可以拓寬蛋白質(zhì)作為手性選擇劑的應(yīng)用范圍。

該實驗中，首先在潔凈的玻碳電極表面電沉積納米金，然后通過Au-S鍵將人血清白蛋白自組裝在電極上，由此構(gòu)建了一種簡單的電化學(xué)手性表面，并將該手性界面用于色氨酸對映異構(gòu)體的選擇性作用研究。

1　實驗部分

1.1試劑和儀器

L-色氨酸（99%）、D-色氨酸（99%）和氯金酸（HAuCl4·4H2O，99.99%）購于阿拉丁試劑公司（中國上海），人血清白蛋白（HSA，98%）購于百靈威試劑公司（中國北京）。工作溶液為5.0 mmol/L ［Fe（CN）6］4-/3-（由0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液pH7.4配制）。其余化學(xué)試劑均為分析純，所有實驗用水為去離子水。所有電化學(xué)測試在CHI 440A電化學(xué)工作站（中國，上海辰華）上進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)三電極體系中，以飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，玻碳電極或修飾電極為工作電極。循環(huán)伏安（CV）、方波伏安（SWV）和交流阻抗（EIS）用于實驗研究中。循環(huán)伏安掃描范圍為-0.2 V～0.6 V，掃速100 mV/s。EIS測試頻率范圍在開路電位下為0.1～105 Hz，振幅為0.22 V。掃描電子顯微圖像由S-4800掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立）得到。

1.2手性生物傳感界面的制備

裸玻碳電極（GCE，Φ=4mm）分別用1.0、0.3 和0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨拋光，依次在乙醇和去離子水中超聲清洗，自然晾干。隨后，將玻碳電極置于1%的HAuCl4溶液中，采用溶出法在-0.2 V的恒電位下電沉積60 s，取出并用去離子水沖洗干凈。再在該修飾電極表面滴加8 μL，0.5 mg/mL的HSA溶液，將該修飾電極置于4℃下保存過夜。電極構(gòu)建如圖1所示。

圖1　電極表面構(gòu)建原理圖Fig.1　The establishment of electrode surface schematic diagram

2　結(jié)果與討論

2.1界面的SEM檢測

圖2a所示為導(dǎo)電玻璃在-0.2 V的電壓下，電沉積60 s納米金的SEM表征圖，從圖中可以看出，納米金分散較為均勻。插圖c為單個納米金的SEM圖，從圖中可以看出單個納米金為明顯的花狀結(jié)構(gòu)。圖2b所示為HSA孵育在納米金表面的SEM表征圖，可以看出在自組裝HSA之后電極表面變得更加粗糙，而且相較于前面的圖2a，該圖像較為模糊，邊緣增大且較亮，這是因為修飾了HSA分子后改變了電極表面納米金粒子的形態(tài)。因此，可以說明HSA已經(jīng)成功組裝在電極表面。

圖2　（a）AuNFs和（b）HSA/AuNFs的SEM表征；插圖（c）單個AuNFs的SEM表征Fig.2　SEM images:（a）AuNFs，（b）HSA/AuNFs，（c）a single AuNF

圖3　不同修飾電極的CV（A）和EIS（B）響應(yīng)：（a）裸GCE，（b）AuNFs/GCE，（c）HSA/AuNFs/GCEFig.3　CVs（A）and EIS（B）of different eletrodes in 5.0mmol/L［Fe（CN）6］4-/3-solution（pH7.4）:（a）bare GCE，（b）AuNFs/GCE，（c）HSA/AuNFs/GCE

2.2修飾界面的電化學(xué)特性

該實驗采用循環(huán)伏安技術(shù)（CV）對電極修飾過程中電極表面的電化學(xué)特性進(jìn)行研究。電化學(xué)測試在5.0 mmol/L的［Fe（CN）6］4-/3-（pH7.4）溶液中進(jìn)行，掃速為0.1 V/s。如圖3A所示，裸GCE電極在電化學(xué)測試中呈現(xiàn)一對可逆的氧化還原峰 （曲線a），在電極表面電沉積納米金后（AuNFs/GCE）峰電流顯著增加（曲線b），這是因為納米金具有提高電子傳遞速率的特性；在AuNFs/GCE表面修飾HSA后，由于蛋白質(zhì)阻礙電子的傳遞，所以峰電流響應(yīng)下降且明顯降低（曲線c）。

交流阻抗技術(shù)（EIS）用于跟蹤電極修飾過程中電極表面阻抗的變化。如圖3B所示，測試出的阻抗圖譜中包括低頻的線性部分和高頻的半圓部分，半圓的直徑相當(dāng)于界面電子傳輸?shù)淖杩梗?2］。但由于修飾過HSA的電極表面阻抗相對于AuNFs/GCE和裸GCE表面的阻抗大很多，導(dǎo)致裸GCE和AuNFs/GCE阻抗的半圓不明顯。裸GCE阻抗較?。ㄇ€b），在電極表面電沉積納米金后，阻抗變小，這是由于電極表面的納米金粒子提高了電極表面的電子傳輸能力 （曲線a）。當(dāng)AuNFs/GCE表面滴涂上HSA時，阻抗明顯增加（曲線c），這與前面的循環(huán)伏安測試結(jié)果相符。

2.3修飾電極對色氨酸的識別

采用方波伏安技術(shù)研究了HSA/AuNFs/GCE修飾電極與L-或D-Trp的相互作用，如圖4A所示，修飾電極分別與L-Trp和D-Trp（5.0 mmol/L）作用后，兩者電流響應(yīng)明顯不同，峰電流差（△I=△IL-△ID）達(dá)到123.7 μA。產(chǎn)生這種現(xiàn)象是因為HSA和色氨酸均具有阻礙電子傳輸?shù)奶匦?，但是色氨酸對映異?gòu)體因其自身構(gòu)型不同，所以與HSA的結(jié)合能力不同，電極表面電子傳輸能力也因此發(fā)生變化。如圖4B所示EIS測試結(jié)果表明L-Trp與修飾電極作用后電極表面阻抗（曲線e）顯著增大，而D-Trp與修飾電極作用后電極表面阻抗（曲線d）略有增加，且二者的阻抗差值為330 Ω。

圖4　（A）L-Trp（a）和D-Trp（b）在HSA/AuNFs/GCE表面的SWV響應(yīng)，（B）不同修飾電極的EIS圖：（a）裸GCE （b）AuNFs/GCE，（c）HSA/AuNFs/GCE（d）D-Trp/HSA/AuNFs/GCE，（e）L-Trp/HSA/AuNFs/GCEFig.4　（A）SWV of L-Trp（a）and D-Trp（b）on HSA/AuNFs/GCE in 5.0 mmol/L［Fe（CN）6］4-/3-solution，（B）EIS of different electrode in 5.0 mmol/L［Fe（CN）6］4-/3-solution（pH7.4）:（a）bare GCE，（b）AuNFs/GCE，（c）HSA/AuNFs/GCE，（d）D-Trp/HSA/AuNFs/GCE，（e）L-Trp/HSA/AuNFs/GCE

圖5　pH和時間對手性識別的影響：（A）pH，（B）timeFig.5　pH and time dependence of chiral recognition:（A）pH，（B）time

2.4實驗條件優(yōu)化

2.4.1pH的影響

pH的變化會影響手性界面與色氨酸對映異構(gòu)體之間的相互作用，圖5A為HSA/AuNFs/GCE 與L-和D-色氨酸（5.0 mmol/L）作用后獲得的方波響應(yīng)。兩種構(gòu)型的峰電流差值隨著pH的變化而變化，在pH5～pH7之間，峰電流差值隨著pH的增大而增加；但隨著pH的繼續(xù)增加，峰電流差值卻隨pH增加而減小。因此，實驗條件選擇pH7為最佳pH。

2.4.2作用時間的影響

實驗中通過控制時間來探究手性界面與色氨酸對映異構(gòu)體的相互作用，將作用時間設(shè)置為10 min、20 min、30 min、1 h和2 h。通過圖5B可知，當(dāng)修飾電極與色氨酸對映異構(gòu)體作用10 min后，出現(xiàn)了較小的峰電流差值，而在20 min后，兩種構(gòu)型的峰電流差值達(dá)到最大（ΔI=131.9 μA），但隨著時間的繼續(xù)增加，峰電流差值呈現(xiàn)下降的趨勢，且在30 min到2 h之間峰電流差值變化不大。所以將20 min作為最佳的作用時間。

2.5線性

實驗進(jìn)一步研究了峰電流與L-或D-色氨酸濃度變化的關(guān)系，在最佳pH和時間條件下，HSA/AuNFs/GCE與不同濃度的L-Trp（直線a）和D-Trp（直線b）作用后進(jìn)行了方波伏安測試。圖6所示HSA/AuNFs/GCE與濃度從1.0×10-6mol/L 到5.0×10-3mol/L的兩種構(gòu)型色氨酸作用后，電極表面的電子傳輸能力發(fā)生改變，與未作用的修飾電極相比峰電流減小。隨著色氨酸濃度的增大，峰電流呈上升趨勢，這是因為兩種構(gòu)型的色氨酸會不同程度的破壞HSA的結(jié)構(gòu)，使疏水基暴露在外，從而使HSA以一種更疏松的狀態(tài)存在，有利于電子的傳輸［23］。從圖6可以看出ΔID＞ΔIL，但ΔIL的遞減更為顯著。經(jīng)過線性擬合，得出線性方程分別為ΔID=4.067-0.2378c（r=0.9974）和ΔIL=2.619-0.3943c（r=0.9989）。

2.6不同色氨酸對映異構(gòu)體識別方法比較

近年來，用電化學(xué)方法識別色氨酸對映異構(gòu)體的研究已取得了很大的進(jìn)展［24-25］。現(xiàn)將已有的研究成果做對比，如表1。該研究中，在玻碳電極上電沉積納米金后自組裝上HSA，用該修飾電極對色氨酸對映異構(gòu)體進(jìn)行識別，并展現(xiàn)出較高的手性選擇性。

圖6　峰電流與L/D-Trp的響應(yīng)關(guān)系1.0×10-6mol/L～5.0×10-3mol/L：（a）D-Trp，（b）L-TrpFig.6　Dependence of the peak current on the concentration of（a）D-Trp and（b）L-Trp from 1.0×10-6mol/L to 5.0×10-3mol/L

表1　不同色氨酸對映異構(gòu)體識別方法對比Tab.1　Comparison of different methods for the identification of tryptophan enantiomers

3　結(jié)論

由于HSA與色氨酸對映異構(gòu)體的相互作用能力不同，不同電極表面的電子傳輸能力也不同，因此在SWV中得到不同的峰電流，從而可以進(jìn)行手性識別研究。在該實驗中，將HSA自組裝于電沉積納米金修飾的玻碳電極表面，構(gòu)建了一個簡單可靠的電化學(xué)傳感界面，將其用于色氨酸對映異構(gòu)體的手性識別研究，并得到了良好的手性識別效果。通過對pH和時間的條件優(yōu)化，確定了最佳pH為7.0，最佳作用時間為20 min。在1.0×10-6mol/L到5.0×10-3mol/L的濃度范圍內(nèi)峰電流與濃度有很好的線性響應(yīng)。該傳感器不僅能夠識別色氨酸手性異構(gòu)體，而且為其他手性物質(zhì)與HSA的作用提供了一定的理論基礎(chǔ)，因此該方法具有潛在的應(yīng)用價值。

［1］戴立信，席振峰，王梅祥．有機(jī)化學(xué)一結(jié)構(gòu)與功能［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.139-140.

［2］Trojanowicz M，Wcislo M.Electrochemical and Piezoelectric Enantioselective Sensors and Biosensors［J］. Anal Lett.，2005，38:523-547.

［3］Qing G Y，Sun T L，Chen Z H，et al.Naked-Eye Enantioselective Chemosensors for N-Protected Amino Acid Anions Bearing Thiourea Units［J］.Chirality，2009，21: 363-373.

［4］Gopal R，Seo C H，Song R I，et al.Effect of repetitive lysinetry-ptophan motifs on the bactericidal activity of antimicrobial peptides［J］.Amino Acids，2013，44:645-660.

［5］Budisa N，Rubini M，Bae J H，et al.Global Replacement of Tryptophan with Aminotryptophans Generates Non-Invasive ProteinBased Optical pH Sensors［J］.Angew. Chem.Int.Ed，2002，41:4066-4069.

［6］Suzuki Y，Suda T，F(xiàn)uruhashi K，et al.Increased serum kynurenine/tryptophan ratio correlates with disease progression in lung cancer［J］.Lung Cancer，2010，67: 361-365.

［7］Van der Does A J Willem.The Effects of tryptophan depletion on mood andpsychiatric symptoms［J］.J.Affect. Disorders，2001，64:107-119.

［8］Wang D H，Wei P，Ouyang P.Advance in Studying on DTryptophan［J］.Chemical Industry and Engineering Progress，2002，21:103-105.

［9］Kang S Z，Chen H，Li X Q，et al.Preparation of L-alanine ethyl ester modified multi walled carbon nanotubes and their chiral discrimination between D-and L-tryptophan ［J］.DiamondRelat.Mater.，2010，19:1221-1224.

［10］Zhen Q N，Xu B，Ma L，et al.Simultaneous determination of tryptophan kynurenine and 5-hydroxytryptamine by HPLC:Applicationinuremicpatientsundergoing hemodialysis［J］.Clin.Biochem.，2011，44:226-230.

［11］Kuhn R，Erni F，Bereuter T，et al.Chiral recognition and enantiomeric resolution based on host-guest complexation with crown ethers in capillary zone electrophoresis ［J］.Analytical Chemistry，1992，64（22）:2815-2820.

［12］Miller G D，Johnson J A，MillerB S.Fluorometric Micromethod for Determination of Tryptophan［J］.Anal. Chem.，1956，28:884-887.

［13］Liang Y D，Song J F.Flow-injection chemiluminescence determination of tryptophan through its peroxidation and epoxidation by peroxynitrous acid［J］.J.Pharm.Biomed. Anal.，2005，38:100-106.

［14］Zor E，Patir L H，Bingol H，et al.An electrochemical biosensor based on human serum albumin/graphene oxide/3aminopropyltriethoxysilan-e modified ITO electrode for the enantioselective discrimination of D-and L-tryptophan［J］.Biosens.Bioelectron.，2013，42:321-325.

［15］Gu X，Tao Y，Pan Y，et al.DNA-inspired electrochemical recognition of tryptophan isomers by electrodeposited chitosan and sulfonated chitosan［J］.Anal.Chem.，2015，87（18）:9481-9486.

［16］Tao Y，Dai J，Kong Y，et al.Temperature-Sensitive Electrochemical Recognition of Tryptophan Enantiomers Based on β-Cyclodextrin Self-Assembled on Poly（l-Glutamic Acid）［J］.Anal.Chem.，2014，86（5）:2633-2639.

［17］He X M，Carter D C.Atomic structure and chemistry of human serum albumin［J］.Nature，1992，358（6383）: 209-215.

［18］Li N，Zhao P，Astruc D.Anisotropic gold nanoparticles: synthesis，properties，applications，and toxicity［J］. Angew.Chem.Int.Ed.，2014，53（7）:1756-1789.

［19］Kang Y J，Oh J W，Kim Y R，et al.Chiral gold nanoparticle-based electrochemical sensor for enantioselective recognition of 3，4-dihydroxyphenylalanine［J］.Chem. Commun，2010，46:5665-5667.

［20］Huan S，Shen G，Yu R.Enantioselective recognition of amino acid by differential pulse voltammetry in molecularly imprinted monolayers assembled on au electrodes ［J］.Electroanal，2004，16:1019-1023.

［21］Qu L T，Dai L M，Osawa E.Shape/Size-Controlled Syntheses of Metal Nanoparticles for Site-Selective Modification of Carbon Nanotubes［J］.J.Am.Chem.Soc.，2006，128:5523-5532.

［22］Liao Y H，Yuan R，Chai Y Q，et al.Study on an amperometric immunosensor based on Nafion-cystein composite membrace for detection of carcinaembryonic antigen［J］. Anal Biochem，2010，402（1）:47-53.

［23］Liu Y，Chen M M，Wang S H，et al.New insight into the stereoselective interactions of quinine and quinidine，with bovine serum albumin［J］.Mol.Recognit.，2014，27:239-249.

［24］Xu J，Wang Q，Xuan C，et al.Chiral Recognition of Tryptophan Enantiomers Based on β-Cyclodextrin-platinum Nanoparticles/Graphene Nanohybrids Modified Electrode ［J］.Electroanalysis，2016，28（4）:868-873.

［25］Tao Y，Gu X，Deng L，et al.Chiral Recognition of d-Tryptophan by Confining High-Energy Water Molecules Inside the Cavity of Copper-Modified β-Cyclodextrin ［J］.The Journal of Physical Chemistry C，2015，119（15）: 8183-8190.

Study on Au nanoflowers-human serum albumin for enantioselective of tryptophan enantiomers

Yang Cheng-cheng，Li Yang，Ma Jiao，Xia Qiao，F(xiàn)u Ying-zi*
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715，China）

A simple chiral sensing platform for enantioselective recognition of the tryptophan enantiomers was fabricated via the self-assembled of human serum albumin（HSA）on the gold nanoflowers（AuNFs）modified glassy carbon electrode.And the interaction between the modified electrodes and the tryptophan enantiomers（D-Trp and L-Trp）was studied via square wave voltammetry（SWV）.The difference of peak currents in SWV display that the transmission of the electron on the electrode surface can be hindered by the interaction between D-or L-Trp and the chiral interface.The peak currents of L-Trp were significantly lower than that of D-Trp and the difference of peak currents reached 123.7 μA.The peak currents of L-Trp or D-Trp were linearly related to the concentration in the range of 1.0×10-6mol/L to 5.0×10-3mol/L.

enantioselective recognition；human serum albumin；tryptophan；gold nanoflowers

*通信聯(lián)系人，E-mail:fyzc@swu.edu.cn