王夢怡,趙慶珠,劉　博,李　想,*,陳舜勝

(1.上海海洋大學(xué),上海 201306;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135)

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運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)分析市售魚類及制品的物種真實(shí)性

王夢怡1,2,趙慶珠2,劉博2,李想2,*,陳舜勝1

(1.上海海洋大學(xué),上海 201306;2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局,上海 200135)

目的:運(yùn)用準(zhǔn)確快速的魚類品種鑒定方法,對上海市售魚類制品標(biāo)識(shí)符合性進(jìn)行調(diào)查。方法:利用DNA條形碼技術(shù),以動(dòng)物線粒體細(xì)胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase Subunit I,COI)基因序列為鑒定靶標(biāo),對采集的63種市售魚類樣本進(jìn)行序列分析比對后,分析樣品的標(biāo)注名稱與真實(shí)物種名的一致性。結(jié)果:經(jīng)序列測定和比對,13份樣品的魚類品種名稱與標(biāo)注名稱不一致,占20.63%,此外有19份樣品標(biāo)注名為一類魚的總稱或俗稱,占30.16%。結(jié)論:目前,我國對魚類及其制品物種真實(shí)性鑒定研究亟待發(fā)展,魚類標(biāo)注物種名稱混亂,分類不清,概念模糊,急需規(guī)范化。

DNA條形碼技術(shù),魚類及其制品,品種鑒定,COI基因,摻假鑒別

魚類是人們餐桌上必不可少的美味佳肴之一,也是全球貿(mào)易的重要組成部分。由于魚類品種多樣,營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值千差萬別,為了追求利益的最大化,魚類制品以次充好、假冒替代現(xiàn)象十分嚴(yán)重。目前,世界水產(chǎn)制品種屬錯(cuò)誤標(biāo)簽問題時(shí)有報(bào)道,尤以魚類更為嚴(yán)重。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),愛爾蘭和西班牙鱈魚類產(chǎn)品錯(cuò)誤標(biāo)簽率均超過20%、南非魚類產(chǎn)品錯(cuò)誤標(biāo)簽率31%、美國紅鯛魚錯(cuò)誤標(biāo)簽率為77%[1-5]。在我國,問題同樣嚴(yán)重。如全國多家超市因被懷疑用“油魚”充當(dāng)“鱈魚”,而遭消費(fèi)者投訴[2-4]。由于魚類制品從外觀上很難鑒定種屬類別,因此基于分子生物學(xué)技術(shù)對魚類制品進(jìn)行物種真實(shí)性鑒定十分必要。

近年分子生物技術(shù)發(fā)展迅速,很多分子鑒定方法已用于魚類的鑒定。如RAPD[5-8]、RLFP技術(shù)等[9-13],但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且結(jié)果穩(wěn)定性差。也有國內(nèi)外研究者利用特異性基因鑒定鯊魚、鰹魚、鮭魚[14-18],但這些研究僅限于鑒定一種或一類魚。

表1　用于物種鑒定的樣品信息

近年發(fā)展起來的DNA條形碼技術(shù),是基于某段特異性DNA片段的序列分析實(shí)現(xiàn)物種鑒定的方法。在動(dòng)物物種鑒定中,采用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因(COI)上的一段650 bp序列作為鑒定靶標(biāo)逐漸得到各國科學(xué)家的認(rèn)同。DNA條形碼法具有能快速、準(zhǔn)確、客觀鑒定物種等優(yōu)點(diǎn)[19],已被美國FDA確定作為魚類物種鑒定的方法[20]。目前已有報(bào)道COI基因用于鯉科、石斑魚、三文魚、蟹類等的鑒定[21-25]?；诖?本研究對現(xiàn)有COI基因檢測體系進(jìn)行比較和優(yōu)化,并對市售63份樣品進(jìn)行種屬鑒定,對其標(biāo)注名稱與真實(shí)物種名稱進(jìn)行比對分析,以期獲得上海市場上魚類制品標(biāo)注真實(shí)情況的初步結(jié)果。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

63份樣品信息詳見表1,購自超市、水產(chǎn)市場或進(jìn)口商;海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(Cat.# DP324-02)購自天根生化科技(北京)有限公司;2×Premix Ex Taq HS(Cat. # FRRR030A)購自寶生物工程(大連)有限公司;10×PCR緩沖液(Cat. # 10966-034)、MgCl2(Cat. # 10966-034)、1 U Platinum Taq DNA聚合酶(Cat. # 10966-034)和dNTPs(Cat. # 18427-013)購自美國Invitrogen公司;瓊脂糖(Cat. # RT101)和50×TAE緩沖液(Cat. # RT204)購自天根生化科技(北京)有限公司;引物寶生物(大連)有限公司;實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純或優(yōu)級純;實(shí)驗(yàn)用水滅菌超純水。

6850型冷凍研磨機(jī)美國Spex公司;NanoVue Plus微量分光光度計(jì)美國GE公司;2S-2200型凝膠成像系統(tǒng)美國Alpha公司;Mastercycler pro PCR擴(kuò)增儀德國Eppendorf公司;CL-32L型全自動(dòng)高壓滅菌鍋日本ALP公司。

1.2基因組DNA提取

表2　PCR所用的引物序列

注:*灰色部分為M13引物序列,用于測序。

用無菌手術(shù)刀去除表層魚肉,以防止加工過程中的交叉污染。切取內(nèi)部魚肉10 g左右,切成小塊,置冷凍研磨機(jī)中研磨成均勻地泥狀,稱取研磨后的樣品100 mg,采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,每次提取均設(shè)空白對照。利用微量分光光度計(jì)測定DNA樣品的濃度和純度,并稀釋至10 ng/μL,置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物

經(jīng)對多對引物進(jìn)行比對,確定選用優(yōu)化后的下述COI基因引物進(jìn)行擴(kuò)增:上游引物和下游引物分別由四條引物按照1∶1∶1∶3的比例混合而成(表2)[26]。同時(shí)采用18S rRNA引物[27]對所有DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以測試提取的DNA是否可用于進(jìn)一步序列分析。

1.4PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

1.4.118S rRNA PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)條件:94 ℃,10 min;36個(gè)循環(huán)×(94 ℃變性20 s;56 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s);72 ℃延伸10 min[31]。

1.4.2COI基因PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25 μL,包含2.5 μL 10×PCR緩沖液,2 mmol/L MgCl2,400 nmol/L上游或下游引物,200 nmol/L dNTPs,1 U Platinum Taq DNA聚合酶,2 μL模板DNA,不足用ddH2O補(bǔ)齊。

PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性1 min;5個(gè)循環(huán)×(94 ℃變性30 s,50 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min);35個(gè)循環(huán)×(94 ℃變性30 s,54 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min);72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物檢測方法:取5 μL PCR產(chǎn)物,在2.0%瓊脂糖凝膠和0.2% TAE緩沖液中電泳30 min(120 V),然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照存檔。

1.5PCR產(chǎn)物序列比對和數(shù)據(jù)分析

將所有成功擴(kuò)增出COI基因序列的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,采用M13正反向引物雙向測序并拼接結(jié)果,利用MEGA5.2軟件[28]人工修正測序結(jié)果。

測序結(jié)果通過Genbank(http://www.Genbank. nlm.nih.gov)和BOLD(www.barcodinglife.org)數(shù)據(jù)庫比對分析,確定魚類的種屬名(相似度需達(dá)到≥98%[29])。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR結(jié)果

2.1.118S rRNA PCR結(jié)果當(dāng)使用18S rRNA引物擴(kuò)增時(shí),63份魚樣均可見明亮的目的條帶(數(shù)據(jù)未在此呈現(xiàn)),表明提取的DNA可用于進(jìn)一步PCR擴(kuò)增。

2.1.2COI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析,發(fā)現(xiàn)除DNA提取空白和加樣空白對照外,所有樣品DNA均在650 bp左右有單一的目的條帶,表明COI基因引物適合魚類PCR擴(kuò)增,可用于進(jìn)一步序列分析。圖1為部分樣品擴(kuò)增后電泳圖。

圖1　部分PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1　Partial PCR results of commercial samples注:泳道S1～S45,分別為S1～S45號(hào)樣品的擴(kuò)增;泳道N為加樣空白;泳道B為提取空白。

2.2COI基因序列比對結(jié)果

為了能夠更加準(zhǔn)確的對樣品種屬進(jìn)行鑒定,所有樣品DNA序列均在Genbank和BOLD數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對,結(jié)果如表3所示。大部分樣品在Genbank和BOLD數(shù)據(jù)庫中都能準(zhǔn)確鑒定出樣品種名(最大相似度≥98%)。S23、S26、S27及S60四個(gè)樣品DNA序列在Genbank數(shù)據(jù)庫中不能準(zhǔn)確鑒定出種名,最大相似度分別為85%、90%、92%及87%,除S60外,另外3個(gè)魚樣在BOLD數(shù)據(jù)庫可準(zhǔn)確鑒定出種名,最大相似度均大于99%。

表3　樣品測序結(jié)果比對

續(xù)表

續(xù)表

注:G表示與Genbank數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果;B表示與BOLD數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果;*1 表示標(biāo)注名稱與真實(shí)種名完全不符;*2表示標(biāo)注名稱是真實(shí)種名的同科其它種屬;*3表示標(biāo)注名稱為一類魚的總稱。

有些樣品在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫中鑒定的種屬名稱不一致。S26樣品在Genbank數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果為黃鰭短須石首魚(Umbrinaroncador),相似度為90%,在BOLD數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果為阿根廷短須石首魚(U.canosai),相似度為99.69%。相比之下,BOLD數(shù)據(jù)庫中的序列相似度更高,說明有些序列信息只上傳至其中的一個(gè)數(shù)據(jù)庫中,因此在對魚類品種進(jìn)行分析時(shí)盡量選擇兩個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對以提高鑒定的準(zhǔn)確性。S60海鰻(Muraenesoxcinereus)在Genbank數(shù)據(jù)庫比對最大相似度為87%,在BOLD數(shù)據(jù)庫中不能比對到近似的序列,可能由于該魚種來源于我國,而我國還未進(jìn)行過相關(guān)研究,因此沒有COI基因的序列信息。

有些樣品在Genbank及BOLD數(shù)據(jù)庫中可比對到多個(gè)種名。S39在Genbank數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果為無鰾鲉屬的赫氏無鰾鲉(Helicolenushilgendorfi)和胎生無鰾鲉(H.avius),相似度均為99%;在BOLD數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果為無鰾鲉屬的轉(zhuǎn)化型(Helicolenus.sp),相似度為99.84%。S44和S57在Genbank及BOLD數(shù)據(jù)庫比對均得到兩個(gè)品種,S44在Genbank數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果為馬面鲀屬的擬短角單棘鲀(Thamnaconusmodestoides)和短角單棘鲀(T.modestus),相似度均為99%,在BOLD數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果相同,相似度均為100%;S57在Genbank數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果為石斑魚屬的清水石斑(Epinepheluspolyphekadion)和褐點(diǎn)石斑(E.fuscoguttatus),相似度均為99%,在BOLD數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果相同,相似度均為99.84%。說明有些魚類品種親緣性很高,進(jìn)化關(guān)系近,序列差異小。也可能在分類上,某些品種的分類還不甚明晰或存在分歧。

2.3樣品標(biāo)簽名稱的真實(shí)性分析

在檢測的63份樣品中,30份樣品的魚類品種名稱與標(biāo)注名稱完全一致,占總樣品的47.62%;13份樣品的魚類品種名稱與標(biāo)注名稱不一致,其中5份樣品的標(biāo)注名稱與真實(shí)種名完全不符,占總樣品的7.94%;其余8份樣品標(biāo)注為同科其它種屬,占總樣品的12.70%;另外,有19份樣品標(biāo)注的為一類魚的總稱或俗名,而非品種名稱,占總樣品的30.16%(圖2)。

圖2　樣品標(biāo)注名稱真實(shí)性分析結(jié)果Fig.2　Analysis results of authority of sample name

標(biāo)注名稱與真實(shí)種名完全不符的樣品有5份,編號(hào)分別為S5、S13、S15、S26、S28,錯(cuò)誤標(biāo)簽率為7.94%。S5標(biāo)注名稱為銀鱈魚(Anoplopomafimbria),隸屬于鮋形目裸蓋魚科裸蓋魚屬,鑒定的種名為小鱗南極犬牙魚(Dissostichuseleginoides),隸屬于鱸形目南極魚科犬牙南極魚屬。這兩種魚隸屬于兩個(gè)不同的目,但由于銀鱈魚價(jià)格昂貴,常被一些不法商販用其它魚種假冒替換,其中以小鱗南極犬牙魚較為常見。此外,消費(fèi)者也常將銀鱈魚與鱈魚混淆,鱈魚是鱈形目(Gadiformes)魚類的總稱,其價(jià)格要低于銀鱈魚。S13標(biāo)注名稱為藍(lán)鱈(Micromesistiuspoutassou),隸屬于鱈形目鱈科藍(lán)鱈屬,鑒定的種名為新西蘭擬鱸(Paraperciscolias),隸屬于鱸形目擬鱸科擬鱸屬;S15標(biāo)注名稱為黑鱈(Melanonusspp.),隸屬于鱈形目黑鱈科黑鱈屬,鑒定的種名為裸蓋魚(Anoplopomafimbria),隸屬于鮋形目裸蓋魚科裸蓋魚屬;S26標(biāo)注名稱為黃鰭棘鯛(Acanthopagruslatus),隸屬于鱸形目鯛科棘鯛屬,鑒定的種名為阿根廷短須石首魚(Umbrinacanosai),隸屬于鱸形目石首魚科短須石首魚屬;S28標(biāo)注名稱為真鯛(Pagrosomusmajor),隸屬于鱸形目鯛科赤鯛屬,鑒定的種名為黑鰭髭鯛(Hapalogenysnigripinnis),隸屬于鱸形目石鱸科髭鯛屬。這類不一致情況一般為商家故意假冒替換,由于實(shí)際種名魚類較昂貴,商家為了追求經(jīng)濟(jì)利益,常用一些肉質(zhì)相似且價(jià)格較低的魚類冒充替換。

此外,有19份樣品標(biāo)注的為一類魚的總稱或俗稱,而非品種名稱,分別為S1、S3、S4、S7、S8、S11、S12、S16、S31、S33、S36、S38、S41、S44、S52、S56、S57、S58、S59,占30.16%。其中以目為命名的有4種,分別為S12、S16、S41、S59,比如S12和S41,標(biāo)注名稱分別為比目魚、左口魚,其名稱均為鰈形目魚類的統(tǒng)稱,經(jīng)鑒定分別為格陵蘭大比目魚Reinhardtiushippoglossoides、牙鲆Paralichthysolivaceus。以科命名的有6種,分別為S1、S3、S4、S31、S33、S58,比如S1、S3和S4標(biāo)注名稱分別為三文魚刺身、凍鮭魚、凍鱒魚,其商品名為三文魚,均為鮭科魚類,但這三種鮭魚的價(jià)格卻相差甚遠(yuǎn),其中大西洋鮭Salmosalar的價(jià)格要高于虹鱒Oncorhynchusmykiss和大麻哈魚O.keta。S31、S33、S58標(biāo)注的名稱分別為鱸魚(鱸總科)、石鱸(石鱸科)和帶魚(帶魚科),經(jīng)鑒定分別為大口黑鱸Micropterussalmoides、三線磯鱸Parapristipomatrilineatus、白帶魚Trichiurusaponicas。以屬命名的有9種,分別為S7、S8、S11、S36、S38、S44、S52、S56、S57,比如S7、S8均標(biāo)注名稱為金槍魚(金槍魚屬),但不同品種金槍魚價(jià)格不同,藍(lán)旗金槍魚價(jià)格要高于黃鰭金槍魚;S11標(biāo)注為黃蓋鰈(黃蓋鰈屬)。出現(xiàn)這一情況的主要原因是由于全球魚類商業(yè)化進(jìn)程中俗名更適于使用和記憶,也有些魚類名稱是外來語的音譯,沿用至今。隨著魚類制品全球化發(fā)展,越來越需要魚類名稱的規(guī)范化,以促進(jìn)漁業(yè)貿(mào)易公平,促進(jìn)國際貿(mào)易的正常有序進(jìn)行。

3　結(jié)論

本研究利用DNA條形碼技術(shù)初步分析了市售魚類制品的品種真實(shí)性標(biāo)識(shí)情況。在抽檢的63份樣品中,13份樣品的魚類品種名稱與標(biāo)注名稱不一致,其中5份樣品標(biāo)注名稱與實(shí)際品種名稱有較大差異,分屬不同科,占樣本總數(shù)的7.94%;8份樣品標(biāo)注為同科的其它品種,占12.70%。此外,在13份標(biāo)注名稱與實(shí)際種名不一致的樣品中,除S26、S48外均為進(jìn)口魚類,進(jìn)口魚類的錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)占總錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)的84.62%,其主要原因可能是進(jìn)口魚類在從捕撈到消費(fèi)者期間,環(huán)節(jié)較多,易出現(xiàn)假冒替代。另外,有19份樣品標(biāo)注名稱為一類魚的總稱或俗稱,而非品種名稱,占30.16%。相比之下,僅有47.62%的樣品標(biāo)注名稱與實(shí)際名稱完全一致。因此,從本次調(diào)查結(jié)果看,無論是進(jìn)口還是國產(chǎn)魚類,上海市場魚類制品錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)現(xiàn)象廣泛存在。魚類制品的“名不副實(shí)”不僅侵害了消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益,而且魚制品中的某些成分易造成食品安全風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)其對漁業(yè)公平貿(mào)易和國際水產(chǎn)品貿(mào)易的有序化和規(guī)范化也造成極大影響。因此,從技術(shù)和法律規(guī)范上,我國均應(yīng)進(jìn)一步出臺(tái)措施,以促進(jìn)進(jìn)出口魚類制品標(biāo)識(shí)的規(guī)范化。

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Species authority of fish and its derived products in Shanghai by DNA barcoding

WANG Meng-yi1,2,ZHAO Qing-zhu2,LIU Bo2,LI Xiang2,*,CHEN Shun-sheng1

(1.Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200135,China)

Objective:To investigate the authority of labeling of fish and its derived products in Shanghai,DNA barcoding was applied to identify fish species. Methods:Based on an animal mitochondrial cytochrome c oxidase I(COI)gene,63 fish DNA samples were sequenced and aligned to analyze the consistency of labeling name and the true species name. Results:After sequencing and alignment,the true name of 13 fish samples out of 63 was different with the labeling name with the percentage of 20.63%. In addition,19 samples labeled the popular name or the name of a class of fish,with the ratio of 30.16%. Conclusion:At present,the research on species authority identification of fish and its derived products is urgent to develop. The labeled fish species name is disordered and unclear in classification in our country. The fish species authority needs to be normative and regular.

DNA barcoding;fish and its derived products;species identification;COIgene;authority identification

2015-09-29

王夢怡(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail:113744526@qq.com。

李想(1978-)，女，高級工程師，研究方向：分子生物學(xué)，E-mail:idealne@163.com。

上海市技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)專項(xiàng)項(xiàng)目(14DZ0501002)；上海檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(HK012-2014)。

TS254.7

A

1002-0306(2016)10-0049-09

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.001