杜靜芳,繆璐歡,白鳳翎,勵建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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乳酸菌素分離純化和特性及在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

杜靜芳,繆璐歡,白鳳翎*,勵建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

乳酸菌素是由某些乳酸菌核糖體合成的對相同或相近生境微生物具有拮抗作用的一類多肽、蛋白質(zhì)類次級代謝產(chǎn)物,作為天然生物防腐劑已用于食品防腐保鮮領(lǐng)域。經(jīng)過硫酸銨沉淀、凝膠層析和高效液相色譜等分離純化流程獲取乳酸菌素,進(jìn)而對其熱穩(wěn)定性、pH適應(yīng)性和分子量等進(jìn)行分析,其中,乳酸菌素純化技術(shù)是限制其研究和應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。本文對近幾年乳酸菌素分離純化如硫酸銨沉淀(ASP)、細(xì)胞吸附和解吸(ADPC)、甲醇丙酮萃取(MAE)、凝膠過濾層析(GFC)、陽離子交換色譜(CEC)、瓊脂糖凝膠電泳(SP-SFF)和反向液相色譜(RP-HPLC)等技術(shù)及其綜合運(yùn)用進(jìn)行比較分析,并對乳酸菌素性質(zhì)研究和在食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述,為開發(fā)高效乳酸菌生物保護(hù)劑提供借鑒與參考。

乳酸菌素,分離純化,特性,食品防腐劑,應(yīng)用

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一類能利用碳水化合物形成乳酸為主要代謝產(chǎn)物的革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱。它們天然存在于動物腸道、傳統(tǒng)發(fā)酵食品和發(fā)酵飼料等各種生態(tài)環(huán)境中,可以通過生態(tài)位競爭和營養(yǎng)物競爭、形成各種拮抗活性物質(zhì)等控制環(huán)境中他種微生物的生長繁殖。拮抗活性物質(zhì)既包括乳酸、乙酸、丙酸等酸性代謝產(chǎn)物,還包括乳酸菌素、過氧化氫、雙乙酰、羅伊氏菌素等次級代謝產(chǎn)物[1-2]。乳酸菌素是一些乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽,可以殺死或抑制與之相同或相似生境的微生物,產(chǎn)生乳酸菌素的細(xì)菌對其自身分泌的乳酸菌素具有免疫性。

自1969年英國食品防腐劑委員會和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會確認(rèn)乳酸鏈球菌素(Nisin)為食品防腐劑以來,作為首個應(yīng)用于食品中的乳酸菌素,Nisin以其產(chǎn)生基因穩(wěn)定、抑菌效果好、食用安全而陸續(xù)被許多國家所接受[3]。迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有百余種乳酸菌素,但真正用于商業(yè)化的卻很少,主要是因?yàn)槿樗峋氐男再|(zhì)和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌素的獲取及其工業(yè)化生產(chǎn)。乳酸菌素純化流程是一個多元化系統(tǒng),建立高效、快速的純化流程是促進(jìn)乳酸菌素研究及在食品中的應(yīng)用的關(guān)鍵所在。

本文對國內(nèi)外乳酸菌素的分離純化技術(shù)及特性的最新研究成果進(jìn)行分析比較,并對其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述,為進(jìn)一步開發(fā)乳酸菌素資源的研究與應(yīng)用提供借鑒與參考。

1　乳酸菌素及其分類

細(xì)菌素是由某些細(xì)菌的核糖體合成分泌到細(xì)胞外對近緣微生物具有抑制或殺滅作用的一類小分子肽或蛋白質(zhì)[4]。乳酸菌素是一類可用于抑制食品中致腐和致病微生物生長的由乳酸菌產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)。根據(jù)乳酸菌素氨基酸結(jié)構(gòu)、分子量大小、熱穩(wěn)定性及抑菌譜等的差異,Klaenhammer和Nes等[5-7]將其分為3類,后拓展為4類,分別是Ⅰ類:羊毛硫抗生素(lantibiotics);Ⅱ類:小分子熱穩(wěn)定性的多肽;Ⅲ類:大分子熱不穩(wěn)定性的蛋白質(zhì);Ⅳ類:由蛋白質(zhì)和脂類或碳水化合物部分組成的復(fù)合細(xì)菌素。

Ⅰ類主要包括Nisin、Lacticin481、LactocinS、CarnocinUI49等,代表物為Nisin。這類細(xì)菌素含有不飽和氨基酸、羊毛硫氨酸或3-甲基羊毛硫氨酸等,分子量小于5 ku的多肽,抑菌譜較廣,具有熱穩(wěn)定性;Ⅱ類被稱為“抗李斯特菌活性多肽”,分子量小于10 ku,具有一定的熱穩(wěn)定性,以片球菌素類細(xì)菌素為代表,一般含有36～48個氨基酸殘基,序列中有多個谷氨酸,N-末端一般含有“Y-G-N-G-V-N”序列;Ⅲ類主要包括HelveticinJ、HeleveticinV-1829、AcidophilucinA、LacticinA、LacticinB等,分子量大于30 ku,對熱敏感;Ⅳ類由蛋白質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì)等組合而成,其抑菌活性來自三者共同作用,代表物有PlantaricinS、LeuconocinS、Lactocin27等[8],目前有關(guān)這類乳酸菌素結(jié)構(gòu)和功能的報道較少。Ⅰ類和Ⅱ類乳酸菌素因其抑菌的高活性和專一性具有在食品防腐保鮮中應(yīng)用的潛在價值。

2　乳酸菌素分離純化方法研究進(jìn)展

2.1乳酸菌素的產(chǎn)生

乳酸菌素一般產(chǎn)生于乳酸菌生長的對數(shù)末期或穩(wěn)定期,是其次級代謝產(chǎn)物,因其濃度較低使得純化受到限制,分析掌握其最高形成階段是分離乳酸菌的關(guān)鍵所在[9]。

Elayaraja等[10]發(fā)現(xiàn)乳酸菌素產(chǎn)量與乳酸菌生長曲線具有一致性,從生長的對數(shù)末期開始產(chǎn)生,到穩(wěn)定期(20～34 h)時達(dá)到高峰,產(chǎn)量與培養(yǎng)溫度和發(fā)酵液的pH密切相關(guān)。Liu等[11]從百歲老人腸道分離的動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimals),在37 ℃培養(yǎng)16 h開始產(chǎn)生細(xì)菌素bifidocin A(80 AU/mL),到穩(wěn)定中期(32～44 h)達(dá)到最大值(640 AU/mL),表明bifidocin A為動物雙歧桿菌的次級代謝產(chǎn)物。因此,準(zhǔn)確把握乳酸菌素的最佳產(chǎn)生時間對下一步的分離純化至關(guān)重要。

2.2乳酸菌素的分離純化方法

揭示乳酸菌素生化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)和作用位點(diǎn)對深入研究乳酸菌素很重要,這些必須建立在獲取乳酸菌素純品的基礎(chǔ)上[12]。由于乳酸菌素具有蛋白質(zhì)的基本特性,一般應(yīng)用純化蛋白質(zhì)方法獲取乳酸菌素純品,乳酸菌素純化流程分為粗提、中度純化和精細(xì)純化三個階段[13],為了取得良好純化效果,各個階段乳酸菌素的純化方法要依據(jù)自身的特異性來選擇。

粗提階段目的是澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白,獲得粗提物。通常采用硫酸銨沉淀、有機(jī)溶劑萃取及吸附和解吸等[14-16]技術(shù)從乳酸菌無細(xì)胞上清液中獲取粗提物質(zhì),粗提的乳酸菌素可用于研究其理化性質(zhì),為后續(xù)純化階段提供材料。中度純化常應(yīng)用離子交換柱色譜、凝膠柱層析和疏水層析等[15,17]各技術(shù)進(jìn)行純化,純化的作用是除去粗提物中大量的雜蛋白。采用Tricine-SDS-PAGE和反相高效液相色譜等[18-19]技術(shù)對中度純化的產(chǎn)物進(jìn)一步純化,使其純度達(dá)到99%左右。經(jīng)過精細(xì)純化的乳酸菌素才能進(jìn)行質(zhì)譜分析和氨基酸序列測定。

隨著近年來分離純化技術(shù)的快速發(fā)展,乳酸菌素的純化流程日臻成熟。衡量純化技術(shù)流程的標(biāo)準(zhǔn)主要包括樣品前處理、純化活性與產(chǎn)率以及純化成本等因素,同時還要考慮適用對象和預(yù)期產(chǎn)品[20]。表1是近些年國內(nèi)外一些學(xué)者的乳酸菌素純化技術(shù)流程和結(jié)果。Cheikhyoussef等[21]采用兩步法純化B.infantisBCRC 14602產(chǎn)生的乳酸菌素,先將無細(xì)胞上清液冷凍干燥,活性為228 AU/mg;基于細(xì)胞的吸附和解吸特性,利用磷酸和氫氧化鈉所形成的酸性環(huán)境使抑菌活性物質(zhì)活性提高到31605 AU/mg,為原培養(yǎng)液的120倍。H-Kittikun等[22]則采用四步法對EnterococcusfaecalisKT2W2G所產(chǎn)細(xì)菌素進(jìn)行分離純化。首先,用70%硫酸銨沉淀乳酸菌無細(xì)胞上清液,活性提高了11倍;其次,通過Sep-Pak C8固相萃取,活性提高了32倍;第三,通過陽離子交換層析,活性達(dá)到12620.51 AU/mg;最后,通過2次C8反向高效液相色譜進(jìn)一步純化,最終活性達(dá)到13470.53 AU/mg,提高了48.10倍。Gao等[23]對LactococcusgarvieaeLG34所產(chǎn)細(xì)菌素Garviecin LG34進(jìn)行純化,經(jīng)過甲醇萃取、G50葡聚糖凝膠層析、陽離子交換色譜后冷凍干燥,其活性達(dá)到54.9 AU/mg,提高了20.3倍。Casaburi等[24]對分離自意大利傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中的Lactobacilluscurvatus54M16所產(chǎn)乳酸菌素經(jīng)反向液相色譜純化,通過解析電離飛行時間質(zhì)譜后得出分子量為2.5 ku。

表1　乳酸菌素分離純化技術(shù)流程和結(jié)果

注:CFS:無細(xì)胞上清液;FD:冷凍干燥;ADPC:細(xì)胞的吸附和解吸;RP-HPLC:反向高效液相色譜;ASP:硫酸銨沉淀;CEC:陽離子交換色譜;ADSA:硅酸吸附和解吸;AE:丙酮萃取;GFC:凝膠過濾層析;CE:三氯甲烷萃取;SP-SFF:瓊脂糖凝膠電泳;(-):未測。

綜上結(jié)果表明,乳酸菌的不同,產(chǎn)生的乳酸菌素不同,因此依據(jù)每種乳酸菌素的特性選擇設(shè)計優(yōu)化不同的分離純化流程,才能獲取純度較高的高活性乳酸菌素。

3　乳酸菌素的性質(zhì)及在食品中的應(yīng)用

乳酸菌素的特性研究是評價其安全性和適用性的前提和基礎(chǔ)。目前研究比較清楚的是Nisin的分子結(jié)構(gòu)及特性,但Nisin只對大多數(shù)革蘭氏陽性菌起作用,抑菌范圍相對較窄[28],因此,需發(fā)掘和探究新的乳酸菌資源,獲取抗菌活性強(qiáng)和抑菌范圍廣的新型乳酸菌素[29]。

表2是對近幾年國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)乳酸菌素的特性及在食品中應(yīng)用情況,從表2中可以看出所獲取的乳酸菌素多屬于Ⅱ類細(xì)菌素。這些乳酸菌素的特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)錯綜復(fù)雜,分子量和生化特性差異性較大,熱穩(wěn)定性好,pH適應(yīng)性相近,在食品中多用于L.monocytogenes、Salmonellatyphimurium和Enterococcusfaecalis等致病菌的安全控制。

對乳酸菌素特性研究結(jié)果表明,主要是在拮抗菌篩選的基礎(chǔ)上對乳酸菌素的分離純化和性能進(jìn)行研究。Xin等[30]從新疆舒巴特乳中分離的Lb.caseiTN-2所產(chǎn)的乳酸菌素TN-2進(jìn)行研究,結(jié)果表明TN-2分子量為6.352 ku,在Lb.caseiTN-2生長至60～72 h時呈現(xiàn)最大抑菌活性,pH耐受性較寬,經(jīng)121 ℃、20 min后仍保持活性。Todorov等[31]從葡萄牙傳統(tǒng)煙熏豬肉腸中分離的Lb.plantarum可產(chǎn)生乳酸菌素bacST202Ch和bacST216Ch,經(jīng)Trycine-SDS-PAGE證明分子量分別約為3.5 ku和10.0 ku,在生長的為27 h和22 h表現(xiàn)出最大抑菌活性,細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)表明二者對自身細(xì)胞均有吸附性。bacST216Ch經(jīng)121 ℃處理2 h不影響其活性,經(jīng)100 ℃處理2 h后兩種乳酸菌素仍保留抑菌活性。

在食品保鮮和安全控制方面,乳酸菌素作為一種生物保護(hù)劑已應(yīng)用于各種食品中[32]。Chakchouk等[33]從雞胗中分離產(chǎn)生乳酸菌素BacJ1的菌株WeissellaparamesenteroidesJ1,將BacJ1純化后用于抑制火雞肉片中S.typhimurium。結(jié)果表明接種107CFU/gS.typhimurium的火雞肉片4 ℃放置30 h后,S.typhimurium數(shù)量增至108CFU/g,而加入BacJ1的實(shí)驗(yàn)組中S.typhimurium的數(shù)量已經(jīng)檢測不出,控制作用較好。Barbosa等[34]將分離自意大利香腸中的Lb.curvatus產(chǎn)生的乳酸菌素MBSa2用于控制香腸中的L.monocytogenes,在10 d和20 d后L.monocytogenes的數(shù)量分別降低2.0和1.5個數(shù)量級,表明乳酸菌素MBSa2能夠很好地抑制食品中L.monocytogenes的生長。

表2　乳酸菌素特性及在食品中的應(yīng)用

注:“-”表示未做說明。

Dortu等[35]應(yīng)用兩株產(chǎn)乳酸菌素的菌株Lb.sakeiCWBI-B1365和Lb.curvatusCWBI-B28和不產(chǎn)乳酸菌素的菌株Lb.sakeiLMG17302控制禽肉和牛肉中的L.monocytogenes,兩種載體中三株乳酸菌的生長曲線基本一致。新鮮牛肉中添加3.1×102CFU/g目標(biāo)菌,空白對照中L.monocytogenes的數(shù)量在21d 后降至為1×102CFU/g,稍有降低。添加菌株Lb.sakeiCWBI-B1365的實(shí)驗(yàn)組中L.monocytogenes7 d后降低1.5個數(shù)量級,14 d后降低2.0個數(shù)量級,21 d終點(diǎn)時降至2×101CFU/g。而添加相同數(shù)量不產(chǎn)乳酸菌素的菌株Lb.sakeiLMG17302中L.monocytogenes在21 d后僅降低0.7個數(shù)量級。如此表明降低L.monocytogenes數(shù)量的是乳酸菌素作用的結(jié)果,排除了乳酸菌所產(chǎn)生的有機(jī)酸的作用。進(jìn)而以新鮮禽肉為載體進(jìn)行研究,空白對照組中L.monocytogenes的數(shù)量從初始值2×102CFU/g 21 d 后增加到5×104CFU/g,分別添加三種菌株在禽肉保藏期間均未能顯著控制禽肉中L.monocytogenes的生長,表明單一菌株產(chǎn)生的乳酸菌素并不能很好地抑制L.monocytogenes的增殖,可以看出,應(yīng)用載體不同,乳酸菌素的作用效果也不同。Udhayashree等[36]將從雞腸道分離的Lb.fermentumCECT5716所產(chǎn)細(xì)菌素UN01添加到蘋果汁和新鮮魚中,在4 ℃冰箱條件下可將產(chǎn)品的貨架期從3 d延長至9 d,保鮮效果明顯。很多研究均證實(shí)乳酸菌素在食品保鮮方面有著化學(xué)防腐劑無法比擬的作用,因此,生物保鮮劑在食品防腐保鮮領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

4　結(jié)論與展望

隨著生活水平的提高,人們對富有營養(yǎng)的生鮮食品需求日益增加。然而,由于化學(xué)防腐劑和抗生素在生鮮食品保鮮應(yīng)用中存在藥物殘留和耐藥性等不足,因此,生物防腐劑越來越顯示出優(yōu)勢。Nisin等乳酸菌素作為生物防腐劑的杰出代表在食品防腐領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,尚有潛在高效抑菌譜廣、穩(wěn)定性好的乳酸菌素有待于開發(fā)與利用。限制乳酸菌素資源開發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)是純化流程,對乳酸菌素的純化流程依據(jù)細(xì)菌素的性質(zhì)多采用綜合純化技術(shù),以便高效地獲得純品。本文對近年來國內(nèi)外對乳酸菌素純化的綜合技術(shù)應(yīng)用進(jìn)行分析比較,可以看出純化流程一般都要選擇粗提階段的硫酸銨沉淀、細(xì)胞吸附與解吸、有機(jī)溶劑萃取,中度純化階段的凝膠過濾層析、陽離子交換色譜以及精細(xì)純化的小分子量凝膠電泳、反向高效液相色譜等技術(shù)并加以結(jié)合使用獲取純品。進(jìn)而對乳酸菌素的產(chǎn)生菌株來源、特性及其應(yīng)用進(jìn)行分析比較,可以看出來源與應(yīng)用之間具有相似性原則。

從目前對乳酸菌素的研究結(jié)果來看,主要集中在對乳酸菌素的拮抗活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性及其分子量等性質(zhì)進(jìn)行分析,建立在乳酸菌素分離純化基礎(chǔ)上的乳酸菌菌株遺傳特性及基因調(diào)控方面的研究具有重要的理論和應(yīng)用價值。

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Advances on purification,characterization and application of bacteriocin from lactic acid bacteria

DU Jing-fang,MIAO Lu-huan,BAI Feng-ling*,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province, National & Local Joint Engineering Research Center Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

Bacteriocin,that can be regarded as natural preservatives to apply to food industry,are secondary metabolites produced from lactic acid bacteria,such as proteins and peptides. They are ribosomally synthesized,which can inhibit microorganism in the same or similar habitat. The pure product can be achieved through ammonium sulfate precipitate(ASP),gel-filtration chromatography(GFC),high performance liquid chromatography(HPLC)and so on. And then the thermostability,tolerance for pH and molecular weight can be analyzed.The process of purification is the technical bottle neck to limit the study and applications of bactericins. The methods,such as ASP,adsorption-desorption producer cells(ADPC),methanol acetone extraction(MAE),GFC,cation exchange chromatography(CEC)and reversed phase high-performance liquid chromatography(RP-HPLC)to purify bacteriocins produced by lactic acid bacteria,were mainly compared and analysised in this paper. At the same time,the recent research advance on characterizations and applications of bacteriocins were reviewed highlightly,which aims to provide reference for protective agent of lactic acid bacteria.

bactericins;purification;characterization;food preservatives;application

2015-10-27

杜靜芳(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制,E-mail:dujingfang2013@163.com。

白鳳翎(1964-)男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全控制和食品微生物學(xué)，E-mail:baifling@163.com。

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD29B06)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0391-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.073