王征征,陳澤平,劉艷全,李明元,李玉鋒

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039)

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響應(yīng)面法優(yōu)化防腐劑在腌制大頭菜中抑制腐敗微生物的效果

王征征,陳澤平,劉艷全,李明元,李玉鋒*

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039)

微生物的繁殖是導(dǎo)致袋裝腌制蔬菜腐敗變質(zhì)的根本原因,為了延長食品的保存期和貨架期,對(duì)防腐劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化,研究了防腐劑對(duì)腌制大頭菜中腐敗微生物的抑制效果。以腌制大頭菜中篩選得到的芽孢桿菌(Bacillussp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillusstubtilitus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、產(chǎn)硫芽孢桿菌(Bacillusboroniphilus)、球形賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillussphaericus)、近鄒褶念珠菌(Candidapararugos)、酵母類念珠菌(Candidazemplinina)為研究對(duì)象,考察了苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、山梨酸鉀、亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)對(duì)以上腐敗菌的抑制作用。在此基礎(chǔ)上,探討了防腐劑復(fù)配對(duì)大頭菜中腐敗菌的抑制效果。結(jié)果表明,苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、EDTA對(duì)腌制大頭菜中腐敗菌有明顯的抑制作用。響應(yīng)面優(yōu)化得到復(fù)合防腐劑最佳配方為苯甲酸鈉0.5 g/L,脫氫乙酸鈉0.2 g/L,EDTA0.2 g/L。在該復(fù)配條件下對(duì)于實(shí)驗(yàn)中抗性較強(qiáng)的菌株Bacillussp.、Lysinibacillussphaericus有良好的抑制效果,抑制率都在99%以上。

腌制大頭菜,防腐劑,腐敗微生物,抑制效果,響應(yīng)面優(yōu)化

我國腌制菜距今有3000多年歷史,起源于周朝[1]。在我國居民餐桌上,腌制蔬菜是常見的佐餐食品,市場(chǎng)銷售的主要形式是袋裝產(chǎn)品[2]。腌制蔬菜中腐敗微生物的快速增長使產(chǎn)品質(zhì)量下降、變劣、腐敗。目前蔬菜腌制品向著低鹽、增酸、適甜方向發(fā)展,但是正是由于用鹽量的下降,腌制對(duì)腐敗微生物的抑制作用降低,而帶來保質(zhì)期限縮短的問題[3]。醬腌菜在加工過程中發(fā)生的各種變化以及成品的敗壞,主要是微生物的生長繁殖的結(jié)果,這些微生物主要是霉菌、酵母菌和其它細(xì)菌[4]。

防腐劑主要作用是抑制微生物的生長繁殖,延長食品的保存時(shí)間,抑制物質(zhì)的腐敗[5]。談到防腐劑,人們往往認(rèn)為它是有害的,但研究表明防腐劑在安全使用范圍內(nèi),對(duì)人體是無毒副作用的[6]。隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展,傳統(tǒng)食品防腐方法已不能滿足其防腐需求[7],人們對(duì)食品的防腐提出了更高的要求:要求操作更簡便、保質(zhì)期更長、達(dá)到防腐效果的成本更低[8]。于是,漸漸將化學(xué)產(chǎn)品作為防腐劑,用于食品防腐中[9]。防腐劑之所以在食品行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用,是因?yàn)樗苡行б种剖称分形⑸锏纳L繁殖所引起的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象,從而延長食品的保存期和貨架期[10]。可以這樣說,當(dāng)今的食品工業(yè)是站在食品防腐劑的肩膀上發(fā)展起來的,食品防腐劑為當(dāng)今的食品工業(yè)發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)[11]。為了保持低鹽腌制大頭菜的固有品質(zhì),又能達(dá)到一定的保存期限,針對(duì)工廠化生產(chǎn)中經(jīng)高溫水浴殺菌后的袋裝低鹽腌制大頭菜添加一定的防腐劑,實(shí)屬必要[12]。

本實(shí)驗(yàn)參照食品防腐劑在腌制蔬菜中的添加法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn),通過對(duì)各種防腐劑成分和質(zhì)量濃度的復(fù)合研究,利用響應(yīng)面進(jìn)一步優(yōu)化,得到安全高效的復(fù)合防腐劑,應(yīng)用于腌制大頭菜中,以延長腌制大頭菜的保質(zhì)期和貨架期。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腌制大頭菜宜賓戎陳坊食品有限公司;實(shí)驗(yàn)菌種從脹袋的腌制大頭菜中篩選的7株腐敗微生物,其中5株細(xì)菌X1(Bacillussp.)、X2(Bacillusstubtilitus)、X3(Bacillusmegaterium)、X4(Bacillusboroniphilus)、X5(Lysinibacillussphaericus),2株酵母菌Y1(Candidapararugos)、Y2(Candidazemplinina);培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(液體)、YPD培養(yǎng)基(液體);苯甲酸鈉、亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)天津博迪化工股份有限公司;山梨酸鉀上海源葉生物科技有限公司;脫氫乙酸鈉Ding Chemistry(Shanghai)Co.,Ltd。

DR5000型紫外可見分光光度計(jì)哈希HACH儀器有限公司;HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋鄭州科創(chuàng)儀器公司;ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司;YXQ-LS-50A立式高壓蒸汽滅菌器上海博訊儀器有限公司;隔水式電熱恒溫生長箱-BG-270杭州匯爾儀器有限公司;IS09001電子天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;FE20-Five EasyTMpH計(jì)梅特勒-托利多儀器科技有限公司;SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;BCD-192TGN海爾冰箱海爾集團(tuán)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1制備菌懸液制備細(xì)菌菌懸液[13]:從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取少量菌接入牛肉膏蛋白胨普通營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃空氣恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)12～14 h,保存于冰箱中備用。

制備酵母菌菌懸液[14]:從平板上挑取少量菌接入YPD液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃空氣恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)16～18 h,保存于冰箱中備用。

1.2.2評(píng)價(jià)抑菌效果的方法

1.2.2.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線按照下述制備菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,測(cè)定大頭菜中7株腐敗菌Bacillussp.、B.stubtilitus、B.megaterium、B.boroniphilus、L.sphaericus、C.pararugos、C.zemplinina的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取9 mL液體培養(yǎng)基,接種1 mL各菌株的菌懸液,對(duì)比其標(biāo)準(zhǔn)曲線,使其初始菌量與測(cè)得的最大菌落總數(shù)一致,然后置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,37 ℃下培養(yǎng)12 h(酵母菌于30 ℃下培養(yǎng)14 h),將沒有接種的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組,相同條件下培養(yǎng)后于分光光度計(jì)中600 nm下測(cè)得其OD值。

在無菌操作臺(tái)中,將培養(yǎng)了12 h的菌懸液用空白培養(yǎng)基稀釋,使其濃度分別變?yōu)橄♂屒皾舛鹊?%、10%、20%、40%、60%、80%不等梯度。以相同培養(yǎng)條件下但沒有接種的培養(yǎng)液作為對(duì)照,測(cè)定稀釋后的不同濃度的菌懸液在600 nm下的吸光度值[15]。同時(shí)將各稀釋度的菌懸液,接種于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基中,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,取出計(jì)數(shù)。以菌懸液在600 nm下的吸光度值為縱坐標(biāo),菌懸液的不同稀釋濃度為橫坐標(biāo),繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2計(jì)算抑菌率的方法將實(shí)驗(yàn)的各個(gè)菌株對(duì)比其標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行稀釋,使接種到培養(yǎng)基中的菌株初始菌量為500 CFU/mL。再添加不同濃度的防腐劑到此培養(yǎng)基中,放在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,設(shè)置37 ℃培養(yǎng)12 h(兩株酵母菌C.pararugos、C.zemplinina置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃下培養(yǎng)14 h),然后于600 nm下測(cè)定其OD值。將接種菌株但不加防腐劑的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組,相同條件下培養(yǎng),然后在600 nm下測(cè)定其OD值。每個(gè)處理重復(fù)三次,最后結(jié)果取其平均值。

抑菌率(%)=對(duì)照組的吸光度-添加防腐劑組的吸光度/對(duì)照組的吸光度×100

1.2.3單一防腐劑對(duì)大頭菜中腐敗菌抑制效果研究根據(jù)GB2760-2011《食品添加劑使用安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和文獻(xiàn)的記錄結(jié)果[16],選擇苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、EDTA、山梨酸鉀、亞硫酸鈉作為防腐劑，對(duì)選取的實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)濃度分別取：0、0.15、0.03、0.45 g/L、0.06、0.09、0.12 g/L；脫氫乙酸鈉實(shí)驗(yàn)濃度分別?。?、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 g/L；EDTA實(shí)驗(yàn)濃度分別?。?、0.05、0.1、0.2、0.25 g/L；山梨酸鉀實(shí)驗(yàn)濃度分別取：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L；亞硫酸鈉實(shí)驗(yàn)濃度分別取：0、0.05、0.1、0.2、0.25 g/L，用實(shí)驗(yàn)中得出的抑菌率來表示防腐劑的抑制效果。

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)合防腐劑對(duì)大頭菜中腐敗菌抑制作用研究用Design-Expert.V 8.0.5b軟件中Box-Behnken法則進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[17-19]。

表1　復(fù)合防腐劑響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1　Response surface test factors and levels of composite preservatives

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、EDTA三個(gè)因素為實(shí)驗(yàn)因子,實(shí)驗(yàn)菌的抑菌率為響應(yīng)值,采取響應(yīng)面設(shè)計(jì),優(yōu)化出最佳的對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的抑菌效果。復(fù)合防腐劑響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平取值見表1。菌種培養(yǎng)基以普通營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn),裝液在試管中,裝液量為10 mL。置于37 ℃恒溫空氣搖床中恒溫培養(yǎng)12 h后,再于600 nm分光光度計(jì)下測(cè)定其吸光度[20],通過其菌種數(shù)量并計(jì)算7株腐敗菌Bacillussp.、B.stubtilitus、B.megaterium、B.boroniphilus、L.sphaericus、C.pararugos、C.zemplinina的抑制率。

1.2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)所得出的復(fù)合防腐劑配備方案,按照具體的防腐劑添加量,添加到袋裝腌制大頭菜中,以不添加防腐劑的袋裝腌制大頭菜作為空白對(duì)照組,常溫下放置30 d,對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)[21]。

2　結(jié)果與討論

2.1腐敗菌吸光度-菌落數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)剛生產(chǎn)的未添加任何防腐劑的真空包裝低鹽腌制大頭菜菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定。10-1稀釋度的計(jì)數(shù)結(jié)果如表2所示。

表2　真空包裝低鹽腌制大頭菜初始菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 2　The determination results of vacuum packaging of low salt pickled turnip initial colony total

取7株腐敗菌菌懸液接種量1 mL,測(cè)定其菌落總數(shù)。Bacillussp.未稀釋菌懸液在10-3梯度上菌落數(shù)為67 CFU/mL;B.stubtilitus未稀釋菌懸液在10-4梯度上菌落數(shù)為228 CFU/mL;B.megaterium未稀釋菌懸液在10-4梯度上菌落數(shù)為30 CFU/mL;B.boroniphilus未稀釋菌懸液在10-3梯度上菌落數(shù)為81 CFU/mL;L.sphaericus未稀釋菌懸液在10-6梯度上菌落數(shù)為114 CFU/mL;C.pararugos未稀釋菌懸液在10-8梯度上菌落數(shù)為240 CFU/mL;C.zemplinina未稀釋菌懸液在10-8梯度上菌落數(shù)為180 CFU/mL。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出7株腐敗菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以7株腐敗菌在600 nm下的吸光度為縱坐標(biāo),菌懸液的稀釋濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見表3。

表3　7株腐敗菌標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程Table 3　The linear regression equation of the standard curve of seven strains of spoilage bacteria

2.2單一防腐劑對(duì)腐敗菌抑制實(shí)驗(yàn)

2.2.1苯甲酸鈉濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)腐敗菌抑制效果的影響苯甲酸鈉對(duì)所示的7種腐敗菌均有較好的抑制效果。如圖1所示,苯甲酸鈉濃度為0.3 g/L時(shí),其對(duì)B.sp.、B.stubtilitus、B.megaterium、B.boroniphilus的抑制率均在40%以上。當(dāng)苯甲酸鈉的濃度達(dá)到0.3 g/L時(shí),B.sp.、B.stubtilitus、B.megaterium、B.boroniphilus、C.zemplinina的抑制率分別為98.86%、96.12%、91.98%、61.93%、45.03%。但是苯甲酸鈉對(duì)L.sphaericus、C.pararugos的抑制效果相對(duì)較弱。苯甲酸鈉濃度為0.3 g/L時(shí),L.sphaericus、C.pararugos的抑制率分別為18.70%、16.02%。當(dāng)苯甲酸鈉濃度達(dá)到最大1.2 g/L時(shí),其對(duì)L.sphaericus、C.pararugos兩種腐敗菌的抑制率能達(dá)到59.26%、58.46%。由此可知,苯甲酸鈉對(duì)本實(shí)驗(yàn)的多數(shù)菌株均有很好的抑制效果,所以本實(shí)驗(yàn)可考慮選擇苯甲酸鈉作為復(fù)合防腐劑的成分。綜合考慮以上因素最終確定苯甲酸鈉添加量為0.35～0.45 g/L。

圖1　不同濃度苯甲酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.1　Inhibition effect of sodium benzoate on spoilage bacteria

2.2.2脫氫乙酸鈉濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)腐敗菌抑制效果的影響脫氫乙酸鈉對(duì)所示7種腐敗菌均有較好的抑制效果。如圖2所示,隨著脫氫乙酸鈉濃度的增加,其對(duì)腐敗菌的抑制效果也越來越明顯。其中當(dāng)脫氫乙酸鈉濃度為0.15 g/L時(shí),C.pararugos、B.boroniphilus、C.zemplinina、B.megaterium、B.stubtilitus的抑制率都達(dá)到80%以上,抑制率分別為:90.63%、88.64%、87.37%、87%、83.09%。當(dāng)脫氫乙酸鈉濃度再增加到0.2 g/L時(shí),除L.sphaericus外,其余6株菌的抑制率都達(dá)到了90%以上,對(duì)抗性相對(duì)較強(qiáng)的B.sp.的抑制率也能達(dá)到99.90%,此時(shí)只有L.sphaericus相對(duì)抑制率較低?？梢?脫氫乙酸鈉對(duì)L.sphaericus的抑制效果相對(duì)較低,但當(dāng)脫氫乙酸鈉濃度增加到0.4 g/L時(shí),L.sphaericus的抑制率也能達(dá)到99.05%。所以,脫氫乙酸鈉對(duì)L.sphaericus的抑制效果相對(duì)較差,而對(duì)其他菌株有較好的抑制效果。這可能是由于脫氫乙酸鈉作用于腐敗菌的細(xì)胞膜上,讓細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,從而實(shí)現(xiàn)抑制或直接殺死腐敗菌,所以增大它的用量,抑制效果越來越強(qiáng)。因此,綜合考慮最終確定脫氫乙酸鈉的添加量為0.15～0.25 g/L。

圖2　不同濃度脫氫乙酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.2　The inhibitory effect of different concentration of sodium dehydroacetate on spoilage bacteria

2.2.3EDTA濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)腐敗菌抑制效果的影響EDTA對(duì)實(shí)驗(yàn)腐敗菌的抑制效果如圖3所示。當(dāng)EDTA濃度達(dá)到0.1 g/L時(shí),對(duì)B.sp.的抑制率達(dá)到了66.08%,所以EDTA對(duì)B.sp.有較好的抑制效果。隨著防腐劑濃度的增加,對(duì)B.sp.抑制效果也逐漸增強(qiáng),當(dāng)EDTA達(dá)到最大濃度0.25 g/L時(shí),其抑制率達(dá)到85.37%。對(duì)于其他幾株菌來說,隨著EDTA濃度的增加,對(duì)其的抑制率也有明顯提高的效果。當(dāng)EDTA的濃度達(dá)到最大濃度0.25 g/L時(shí),其對(duì)菌株L.sphaericus的抑制率也能達(dá)到51.68%。所以,EDTA可被選作為復(fù)合防腐劑的成分,綜合考慮最終確定EDTA的添加量為0.15～0.25 g/L。

圖3　不同濃度EDTA對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.3　Inhibitory effect of different concentrations of EDTA on spoilage bacteria

2.2.4山梨酸鉀濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)腐敗菌抑制效果的影響山梨酸鉀對(duì)所示7種腐敗菌的抑制效果差別較大。由圖4可知,隨著山梨酸鉀濃度的逐漸增大,對(duì)各腐敗菌的抑制效果也逐漸增強(qiáng)。其中對(duì)B.boroniphilus、C.zemplinina的抑制效果最佳,當(dāng)山梨酸鉀的濃度達(dá)到0.4 g/L及以上時(shí),基本可以完全抑制這兩種菌株,但是對(duì)于B.sp.、L.sphaericus的抑制效果還是較差。當(dāng)所示山梨酸鉀濃度達(dá)到最大0.7 g/L時(shí),對(duì)B.sp.、L.sphaericus的抑制率分別才46.60%、29.39%。因此可以得出,山梨酸鉀對(duì)這幾株腐敗菌的抑制作用不強(qiáng),必須要在其最大實(shí)驗(yàn)濃度下才能基本抑制本實(shí)驗(yàn)中的腐敗菌,且對(duì)于腐敗菌B.Sp、L.Sphaericus的抑制效果尤為不佳,所以此響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)將不考慮把山梨酸鉀作為復(fù)配成分。

圖4　不同濃度山梨酸鉀對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.4　Inhibitory effect of different concentrations of potassium on the inhibition of spoilage bacteria

2.2.5亞硫酸鈉濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)腐敗菌抑制效果的影響由圖5可知,亞硫酸鈉對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幾株防腐劑的抑制效果均不明顯。當(dāng)亞硫酸鈉達(dá)到最大濃度0.2 g/L時(shí),對(duì)B.sp.最好的抑制率也才28.8%,不超過30%,幾乎可認(rèn)為亞硫酸鈉對(duì)其沒有起到抑制作用,達(dá)不到預(yù)期的抑制效果。同樣,亞硫酸鈉對(duì)其他菌株的也不能達(dá)到較好的抑制效果,抑制率都超不過30%。即使當(dāng)亞硫酸鈉達(dá)到最大濃度0.2 g/L時(shí),C.zemplinina的抑制率才6.73%。由此可得出,本實(shí)驗(yàn)可完全不用考慮亞硫酸鈉作為復(fù)合防腐劑的成分。

圖5　不同濃度亞硫酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.5　The inhibitory effect of different concentration of sodium sulfite on spoilage bacteria

2.3針對(duì)抗性較強(qiáng)菌株優(yōu)化復(fù)合防腐劑最佳配方的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1回歸模型的建立及方差分析由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出,L.sphaericus、B.sp.對(duì)防腐劑的抗性較強(qiáng),上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果又確定了復(fù)合防腐劑的成分,即苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉和EDTA。所以在此基礎(chǔ)上依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選用對(duì)此兩株菌的抑制率作為響應(yīng)面優(yōu)化的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。然后對(duì)此響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果見表4。

表4　響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　Response surface analysis test results

表5　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析Table 5　Response surface regression model analysis of variance

注:**表示影響極顯著(p<0.01);*表示影響顯著(p<0.05)。利用Design-Expert.V 8.0.5b軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,三個(gè)因素經(jīng)過回歸擬合分別得到以對(duì)L.sphaericus抑制率(Y1)及對(duì)B.sp.抑制率(Y2)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程:

Y1=99.50-1.30A+13.68B+5.83C-1.69AB-1.68AC+0.20BC-6.79A2-11.15B2-7.86C2

Y2=99.65+0.72A+1.27B-0.13C+0.77AB+0.44AC-0.21BC-1.42A2-2.38B2-0.16C2

由表5回歸模型方差分析可知,回歸模型p值均小于0.0001,達(dá)到了極顯著水平,說明該模型顯著回歸,方程能夠正確反映L.sphaericus和B.sp.的抑制率與各因素之間的關(guān)系。模型的失擬項(xiàng)p值分別為0.8546和0.4016,均大于0.05,差異不顯著,說明回歸模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好,實(shí)驗(yàn)誤差小,可用于模型分析。相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9989及0.9745,表明采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)所得的回歸模型有效,適用于此復(fù)合防腐劑對(duì)腌制大頭菜中腐敗微生物的抑制作用研究實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。以對(duì)L.sphaericus抑制率(Y1)為響應(yīng)值的模型中,A、B、C、AB、AC、A2、B2及C2的p值小于0.01,表明影響極顯著;以對(duì)B. sp.抑制率(Y2)為響應(yīng)值的模型中,A、B、A2、B2及C2的p值小于0.01,表明影響極顯著。

2.3.2響應(yīng)面分析響應(yīng)面圖能夠直觀地反映出各個(gè)因素及其交互作用,利用Design Expert軟件即可以作出兩因素交互作用的響應(yīng)面圖,交互作用顯著和極顯著的交互性的響應(yīng)面圖結(jié)果見圖6～圖8。

圖6　苯甲酸鈉和脫氫乙酸鈉交互作用 對(duì)L. sphaericus抑制率的響應(yīng)面圖Fig.6　The response surface of L. sphaericus inhibition by the interaction of sodium benzoate and sodium dehydroacetate

圖7　苯甲酸鈉和EDTA交互作用 對(duì)L. Sphaericus抑制率的響應(yīng)面圖Fig. 7　The response surface of L. Sphaericus inhibition by the interaction of sodium benzoate and EDTA

由表5可知,苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、EDTA均為影響L.Sphaericus抑制率的主要因素,其中交互項(xiàng)顯著如圖6、圖7。從結(jié)果來看,響應(yīng)值隨著苯甲酸鈉變化的幅度較小,而脫氫乙酸鈉和EDTA對(duì)響應(yīng)值的影響較大。圖6可以看出,對(duì)L.Sphaericus抑制率隨著脫氫乙酸鈉添加量和苯甲酸鈉添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì);圖7可以看出,對(duì)L.Sphaericus抑制率隨著苯甲酸鈉添加量和EDTA添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。

由表5可知,苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉為影響B(tài).Sp.抑制率的主要因素,交互項(xiàng)顯著的響應(yīng)面分析如圖8。從結(jié)果來看,響應(yīng)值隨著苯甲酸鈉變化的幅度較小,而脫氫乙酸鈉對(duì)響應(yīng)值的影響較大。圖8可以看出,對(duì)B.Sp.抑制率隨著脫氫乙酸鈉添加量和苯甲酸鈉添加量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。

2.3.3響應(yīng)面法分析結(jié)果利用Design-Expert軟件,通過對(duì)兩個(gè)二次回歸方程進(jìn)行聯(lián)合求解,分析可得最優(yōu)化的對(duì)抗性較強(qiáng)的兩株菌L.sphaericus和B.sp.的抑制率條件為苯甲酸鈉添加量0.47 g/L,脫氫乙酸鈉添加量0.23 g/L,EDTA添加量0.20 g/L。該條件下對(duì)L.Sphaericus抑制率的理論預(yù)測(cè)值為101.23%,對(duì)B.Sp抑制率的理論預(yù)測(cè)值為99.98%。

對(duì)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),根據(jù)實(shí)際生產(chǎn),綜合考慮復(fù)合防腐劑對(duì)腌制大頭菜中腐敗微生物抑制作用的研究,將預(yù)測(cè)條件校正為苯甲酸鈉添加量0.50 g/L,脫氫乙酸鈉添加量0.20 g/L,EDTA添加量0.20 g/L。結(jié)果得出在此優(yōu)化工藝條件下,對(duì)實(shí)驗(yàn)中大頭菜的抑菌率達(dá)到了99%以上,與模型理論預(yù)測(cè)值的偏差均約為1.0%,說明該響應(yīng)面回歸模型具有可行性。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

綜合響應(yīng)面結(jié)果分析,根據(jù)各因素相對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的顯著性不同。將上述復(fù)合防腐劑組合添加到腌制大頭菜中,常溫下放置30 d,對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù),空白組菌落總數(shù)為9×104CFU/mL,添加復(fù)合防腐劑組合的菌落總數(shù)為60 CFU/mL。對(duì)比空白組,有很高的抑菌作用,添加該復(fù)合防腐劑對(duì)產(chǎn)品有很好的保質(zhì)和貯存效果。另外對(duì)兩組腌制大頭菜進(jìn)行感官評(píng)價(jià),結(jié)果見表6。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)單一防腐劑的篩選實(shí)驗(yàn)表明,脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)中7種腐敗菌的抑制效果比較明顯。對(duì)于L.sphaericus和B.sp.兩株抗性較強(qiáng)的菌株,EDTA對(duì)其抑制率尤為明顯。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表明,在防腐劑苯甲酸鈉濃度為0.5 g/L,脫氫乙酸鈉濃度為0.2 g/L,EDTA濃度為0.20 g/L的復(fù)配下,實(shí)驗(yàn)中大頭菜的抑菌率達(dá)到了99%以上,有相當(dāng)好的抑制效果,且復(fù)配防腐劑各自的用量之和占其最大使用量的比例之和小于90%,符合GB26687-2011的要求,達(dá)到了復(fù)配協(xié)同增效的作用。

將所篩選和響應(yīng)面優(yōu)化得到的復(fù)合防腐劑添加到腌制大頭菜中,常溫放置30 d,進(jìn)行菌落測(cè)定和感官評(píng)價(jià),表明其仍然具有很好的保鮮效果,可以達(dá)到對(duì)腌制大頭菜防腐和延長食品貨架期的目的。

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Study on the inhibitory effects of preservatives on spoilage microorganisms in salted turnip using response surface methodology

WANG Zheng-zheng,CHEN Ze-ping,LIU Yan-quan,LI Ming-yuan,LI Yu-feng*

(College of Food and Biological Engineering,Xihua University,Chengdu 610039,China)

The reproduction of microorganisms is the main cause of spoilage of bagged pickled vegetables. In order to preserve and extend the shelf life of food,screening and optimization of preservatives,studied on the inhibitory effect of preservatives on spoilage microorganisms in salted turnip. Seven spoilage microbes,Bacillussp.,Bacillusstubtilitus,Bacillusmegaterium,Bacillusboroniphilus,Lysinibacillussphaericus,Candidapararugos,andCandidazemplinina,separated from pickled rutabaga were used as objective strains.The antibacterial effects of sodium benzoate,sodium dehydroacetate,potassium sorbate,sodium sulfite,and EDTA on the strains were investigated.Then,the synergistic effects of the preservatives were studied.The results showed that sodium benzoate,sodium dehydroacetate,and EDTA exhibit significant inhibitory actions on the main spoilage microbes in rutabaga. Moreover,a compound preservative was optimized to be 0.5 g/L sodium benzoate,0.2 g/L sodium dehydroacetate,and EDTA 0.2 g/L through response surface optimization. This compound preservative exhibited an excellent suppression effect on two strains of bacteria separated from pickled rutabaga. The suppression rate could reach up to 99%.

pickled rutabaga;preservative;spoilage microbe;antibacterial effect;response surface optimization

2015-12-25

王征征(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：4163383@qq.com。

李玉鋒(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：907493056@qq.com。

TS255.36

A

1002-0306(2016)14-0291-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.050