趙風(fēng)琴,贠建民,趙小瑞,李宏珍,賈亞莉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

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涼州熏醋釀造過程產(chǎn)乙偶姻酵母菌篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

趙風(fēng)琴,贠建民*,趙小瑞,李宏珍,賈亞莉

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

乙偶姻是涼州熏醋特征風(fēng)味成分四甲基吡嗪的前體。本實驗從涼州熏醋發(fā)酵料醅中分離獲得了一株產(chǎn)乙偶姻酵母菌T8,通過經(jīng)典鑒定方法結(jié)合ITS基因測序的方法,確定其為葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)。為探明T8菌株生長及代謝產(chǎn)乙偶姻的營養(yǎng)需求,本實驗對產(chǎn)乙偶姻酵母菌T8發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,以期為傳統(tǒng)食醋釀造工藝現(xiàn)代化改造過程中人工接種增香酵母種子的制備提供培養(yǎng)基。通過研究不同碳源、氮源、無機鹽對T8菌株產(chǎn)乙偶姻的影響,確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的最終組分:葡萄糖60 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏10 g/L,(NH4)2HPO48 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.75 g/L,MnSO40.6 g/L。培養(yǎng)基優(yōu)化后,乙偶姻產(chǎn)量達到15.236 g/L,與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高了20.65%。人工接種T8菌株種子液所釀食醋中四甲基吡嗪的含量較對照提高了22.1%,增香效果明顯,證明H.UvarumT8菌株可以作為食醋釀造的增香酵母。

食醋釀造,乙偶姻,酵母菌,發(fā)酵培養(yǎng)基,優(yōu)化

涼州熏醋是甘肅名優(yōu)產(chǎn)品,采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵技術(shù),經(jīng)糖化、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵三個階段釀造而成[1]。四甲基吡嗪是涼州熏醋特征風(fēng)味成分,它與其它揮發(fā)性成分共同作用,形成了涼州熏醋酸不澀口、醇厚綿長、濃郁和諧、口感柔和的品質(zhì)特點[2-3]。

研究報道表明,乙偶姻是四甲基吡嗪的前體物質(zhì),可由微生物代謝產(chǎn)生,具有奶香味,是一種重要的食品風(fēng)味物質(zhì),廣泛存在于多種發(fā)酵食品中[4]。目前已報道的產(chǎn)乙偶姻微生物多為細菌,如醋酸菌(Acetobacter)、乳球菌(Galactococcus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、沙門氏菌(Salmonella)等[5-6],但有關(guān)酵母菌產(chǎn)乙偶姻的研究報道相對較少。而酵母菌是涼州熏醋酒精發(fā)酵階段的主要功能菌,除了代謝生產(chǎn)酒精外,對食醋風(fēng)味的形成也至關(guān)重要[7]。因此,篩選高產(chǎn)乙偶姻酵母菌及人工接種增香酵母是提高傳統(tǒng)食醋風(fēng)味的可能途徑,探明產(chǎn)乙偶姻酵母菌株在菌體生長及代謝過程的營養(yǎng)需求顯得非常重要,可為增香菌株的人工接種種子液的制備提供理論依據(jù)。

為此,本實驗依據(jù)微生物營養(yǎng)學(xué)基本原理,采用單因素及正交設(shè)計,擬對所分離酵母菌T8產(chǎn)乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化研究,旨在為涼州熏醋釀造過程酒精發(fā)酵階段人工接種增香酵母菌種子液的制備提供優(yōu)良的培養(yǎng)基,以期實現(xiàn)傳統(tǒng)食醋釀造工藝的現(xiàn)代化改造，改善食醋的風(fēng)味和品質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料及儀器

涼州熏醋發(fā)酵第3 d酒醅由甘肅益民食品有限公司提供。

酵母菌分離培養(yǎng)基(YEPD):葡萄糖20 g,酵母膏10 g,蛋白胨20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,備用。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖80 g,酵母膏20 g,蛋白胨10 g,KH2SO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,(NH4)2SO42 g,MnSO40.2 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

DH-600A臺式恒溫振蕩器上海躍進醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1FD潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;PHS-3C型pH計上海佑科儀器儀表有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;UV756CRT紫外可見分光光度計上海佑科儀器儀表有限公司;FA1004B電子天平上海佑科儀器儀表有限公司;101-1-S-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱北京科偉永興儀器有限公司;YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器上海三申醫(yī)療器械有限公司;GC 6890N 氣相色譜儀、DB-WAX 色譜柱美國 Agilent scientific公司;頂空固相微萃取裝置、DVB/CAR/PDMS萃取器美國surpelco公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種分離純化采用梯度稀釋平板法對所需菌株進行分離[8]。采用分光光度法結(jié)合氣相色譜法[9]測定所分離菌株初始發(fā)酵培養(yǎng)基中乙偶姻的含量,篩選出產(chǎn)乙偶姻最高的菌株。

1.2.2菌種鑒定形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定參照《酵母菌特性及鑒定手冊》[10],采用經(jīng)典鑒定方法,通過菌體形態(tài)觀察,子囊孢子、擲孢子、假菌絲的形成,以及相應(yīng)的生理生化實驗對菌株進行鑒定。

將提取的基因組DNA委托甘肅金博研生物科技有限公司進行ITS序列擴增測序。測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫,將得到的基因序列通過BLAST程序提交,NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列檢索[11]。將目標(biāo)菌株和應(yīng)用Blast檢索到的與之較高的同源性菌株的ITS序列作最大同源性比較分析。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化固定因素裝液量50 mL/250 mL錐形瓶,接種量10%(v/v),30 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h,對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

挑取一環(huán)新鮮的斜面菌種,接入液體YEPD培養(yǎng)基中,裝液量50 mL/250 mL,30 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h,4 ℃保藏備用。

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,分別選取淀粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖為單一碳源,以80 g/L的添加量配制發(fā)酵培養(yǎng)基,測定發(fā)酵液中生物量和乙偶姻含量,研究不同碳源對T8發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的影響;設(shè)置碳源濃度為0、20、40、60、80、100、120 g/L,測定發(fā)酵液中還原糖、生物量、乙偶姻含量,篩選最佳碳源濃度;分別選取玉米漿、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨為單一氮源,以20 g/L的添加量配制發(fā)酵培養(yǎng)基,測定發(fā)酵液中生物量和乙偶姻含量,研究不同氮源對T8發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的影響;設(shè)置酵母膏/蛋白胨含量為10 g/10 g(1∶1)、10 g/20 g(1∶2)、15 g/10 g(1.5∶1)、15 g/20 g(1.5∶2)、20 g/10 g(2∶1),測定發(fā)酵液中生物量和乙偶姻含量,確定復(fù)合有機氮源的最佳比例。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的(NH4)2HPO40、2、4、6、8、10 g/L進行實驗,測定發(fā)酵液中pH、生物量和乙偶姻含量,研究(NH4)2HPO4對T8發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的影響。

根據(jù)微生物生長代謝以及產(chǎn)乙偶姻的營養(yǎng)要求[12,14],選取KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4為無機鹽配置發(fā)酵培養(yǎng)基,采用正交實驗設(shè)計研究K+、Mg2+、Mn2+對T8產(chǎn)乙偶姻的影響,因素水平表見表1。

表1　正交實驗因素水平表(g)

1.2.4分析方法(1)乙偶姻的測定方法:肌酸甲萘酚法[13-14]

乙偶姻含量計算公式為

其中:V-樣本體積,n-稀釋倍數(shù)。

(2)還原糖含量測定:采用3,5-二硝基水楊酸比色法[15];

(3)pH測定:采用pH計對發(fā)酵液pH進行測定;

(4)生物量的測定:恒重法[16];

(5)四甲基吡嗪的測定方法:氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[17]。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù),計算標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SE)并繪制折線圖、柱形圖。使用SPSS 19.0進行正交分析以及單因素方差分析(p<0.05為差異顯著)。

2　結(jié)果與分析

2.1分離篩選結(jié)果

將從涼州熏醋發(fā)酵第3 d酒醅中分離獲得的176株酵母菌分別接入初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量為50 mL/250 mL三角瓶,30 ℃培養(yǎng)72 h。發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵液8000 r/min離心10 min,采用分光光度法測定各菌株發(fā)酵液中乙偶姻含量,選取發(fā)酵液中乙偶姻含量較高的前20株菌株采用氣相色譜(GC)進行二次發(fā)酵篩選,檢測發(fā)酵液中乙偶姻的含量,以不接種的樣品為對照,其中T8菌株發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的含量最大,達到11.642 g/L。

表3　T8菌株基因比對結(jié)果

2.2菌株鑒定

2.2.1菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定根據(jù)表2實驗結(jié)果,查閱《酵母菌特性及鑒定手冊》,對已分離的T8酵母菌株進行初步鑒定,屬于漢遜酵母屬(Hanseniaspora)。

表2　T8菌體形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

注:“+”代表陽性,“-”代表陰性。

2.2.2菌株分子生物學(xué)鑒定對篩出菌株進行ITS基因序列分析,提取其DNA,進行PCR擴增,擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測,電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1　T8菌株的電泳圖Fig.1　Electrophoregram of strain T8注:“1”代表T8菌株ITS基因,“2”代表Marker。

T8菌株DNA經(jīng)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳,在約750 bp 的位置出現(xiàn)了清晰的條帶。將純化后的 PCR 產(chǎn)物切膠回收委托甘肅金博研生物科技有限公司進行ITS測序,結(jié)果顯示該條帶大小為689 bp(GenBank accession number KT802750),提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對(表3),與葡萄汁有孢漢遜酵母菌(Hanseniasporauvarum)同源性為99%。

2.3H.UvarumT8產(chǎn)乙偶姻發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1不同碳源對H.UvarumT8發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的影響碳源不僅要滿足微生物生長繁殖的需求,還要有益于代謝產(chǎn)物的生成,因此選擇合適的碳源對微生物的生長和產(chǎn)物合成至關(guān)重要。選擇淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖四種不同碳源進行實驗,結(jié)果如圖2所示。

由圖2可看出,H.uvarumT8均可利用淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻,以葡萄糖作為碳源時,乙偶姻產(chǎn)量最高,可達到12.090 g/L,并且葡萄糖的來源廣泛,價格相對便宜,因此選擇葡萄糖為產(chǎn)乙偶姻H.uvarumT8發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳碳源。

2.3.2碳源最佳濃度葡萄糖是微生物生長和代謝產(chǎn)乙偶姻可利用的直接碳源,但發(fā)酵體系中葡萄糖濃度過高或過低,都不利于菌體的生長和代謝,因此需要研究葡萄糖濃度對菌體生長和乙偶姻含量的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖2　不同碳源對乙偶姻發(fā)酵的影響Fig.2　The effect of different carbon sources on acetoin fermentation注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),下同。

圖3　不同濃度葡萄糖對乙偶姻發(fā)酵的影響Fig.3　The effect of initial glucose concentration on acetoin fermentation

由圖3可以看出,隨著發(fā)酵液中葡萄糖濃度的增加,發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵體系中殘?zhí)呛恐饾u增加,生物量和乙偶姻含量均呈現(xiàn)一個先上升后下降的趨勢,發(fā)酵液中葡萄糖初始濃度為60 g/L時,乙偶姻含量達到最大。發(fā)酵液中初始葡萄糖濃度高于80 g/L時,生物量含量也開始下降,說明高濃度的葡萄糖對微生物生長有抑制作用,不利于發(fā)酵液中乙偶姻的積累,因此選擇60 g/L為最佳初始葡萄糖濃度。

2.3.3不同氮源對H.UvarumT8發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的影響本實驗選擇玉米漿、蛋白胨、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨為單一氮源,研究不同氮源對乙偶姻發(fā)酵的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4　不同氮源對乙偶姻發(fā)酵的影響Fig.4　The effect of different nitrogen sources on acetoin fermentation

從圖4可以看出,以酵母膏和蛋白胨為單一氮源時,發(fā)酵液中乙偶姻含量較高,且二者之間無顯著差異,說明蛋白胨和酵母膏對H.uvarumT8產(chǎn)乙偶姻均有顯著影響。與無機氮源相比,有機氮源更有利于菌體生長和乙偶姻的生成。為了探索最佳氮源組成,有必要進一步研究蛋白胨和酵母膏的復(fù)合比例對H.uvarumT8產(chǎn)乙偶姻的影響。

2.3.4復(fù)合有機氮源的最佳比例通過調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏和蛋白胨的添加量,研究不同氮源添加比例對乙偶姻發(fā)酵的影響,實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5　不同氮源添加比例對乙偶姻發(fā)酵的影響Fig.5　The effect of different nitrogen sources concentration on acetoin fermentation

由圖5可以看出,發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏和蛋白胨添加量不同,發(fā)酵結(jié)束時體系中生物量和乙偶姻含量也有所差異,隨著酵母膏與蛋白胨比例的增加,生物量和乙偶姻含量均呈現(xiàn)一個先上升后下降的過程,酵母膏:蛋白胨為1∶1時,發(fā)酵液中生物量和乙偶姻含量均達到最大,分別為7.34 g/L和14.10 g/L。為了使發(fā)酵過程中乙偶姻更好地積累,選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母膏、蛋白胨濃度均為10 g/L。

2.3.5(NH4)2HPO4對H.UvarumT8發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的影響(NH4)2HPO4不僅可以作為氮源被微生物代謝利用,而且(NH4)2HPO4作為一種緩沖溶液,可以對發(fā)酵體系的pH起到調(diào)節(jié)作用[18-19]。本實驗通過配制不同濃度的(NH4)2HPO4發(fā)酵培養(yǎng)基,研究(NH4)2HPO4添加量對H.uvarumT8產(chǎn)乙偶姻發(fā)酵的影響,實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6　不同濃度的(NH4)2HPO4對乙偶姻發(fā)酵的影響Fig.6　The effect of(NH4)2HPO4 concentration on acetoin fermentation

從圖6可知,隨著(NH4)2HPO4濃度的增大,生物量趨于穩(wěn)定,乙偶姻含量呈先增加后下降的趨勢,(NH4)2HPO4濃度為8 g/L時,發(fā)酵液中乙偶姻的含量達到最大。此外,隨著(NH4)2HPO4濃度的增大,發(fā)酵液pH呈先下降,后逐漸趨于平緩的趨勢,(NH4)2HPO4濃度為8 g/L時,發(fā)酵液的最終pH為6.24,乙偶姻積累量最大,這是由于(NH4)2HPO4作為一種磷酸鹽緩沖液,可有效調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH,培養(yǎng)液中pH為中性偏酸時,有利于酵母菌生長,進而促進發(fā)酵液中乙偶姻的積累。

2.3.6金屬離子對H.UvarumT8發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的影響在微生物生長及代謝過程中,金屬離子除了構(gòu)成細胞成分外,K+作為一種生理調(diào)節(jié)物質(zhì),參與維持滲透壓以及氧化還原電位的平衡,pH穩(wěn)定等;Mg2+、Mn2+是酶的激活劑,能夠控制許多酶類參與的化學(xué)反應(yīng)的進行[12]。根據(jù)表1所列因素和水平,以發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中乙偶姻的含量為指標(biāo),采用L9(34)正交表對發(fā)酵培養(yǎng)基中不同金屬鹽濃度進行優(yōu)化,正交設(shè)計結(jié)果和方差分析結(jié)果如表4和表5所示。

表4　正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表5　正交實驗設(shè)計方差分析結(jié)果

注:“*”表示差異顯著(p<0.05)。

從表4正交結(jié)果可知,處理3(A1B3C3)乙偶姻含量最高。前期研究已證實了酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻的代謝途徑為:酵母菌通過糖酵解生成丙酮酸,丙酮酸在丙酮酸脫氫酶作用下生成乙酰-TPP,乙酰-TPP與乙醛在醛連接酶的作用下生成乙偶姻[20]。由方差分析(表5)可知,MgSO4·7H2O添加量對發(fā)酵液中乙偶姻含量有顯著影響,主要是由于Mg2+是PDP的主要輔助因子,而PDP和PDK共同控制丙酮酸脫氫酶的活性,進而影響發(fā)酵液中乙偶姻的含量[21-22]。通過極差分析,三種金屬鹽對乙偶姻發(fā)酵影響的主次因素為B>A>C,極差分析獲得的最佳實驗組合為A1B3C3,不需要做驗證實驗。因此確定培養(yǎng)基中無機鹽的添加量為KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.75 g/L,MnSO40.6 g/L。

2.4接種T8菌株的食醋釀造驗證實驗

按照涼州熏醋釀造工藝流程進行食醋模擬發(fā)酵實驗,在酒精發(fā)酵階段人工接種5%(v/m)釀酒酵母菌和T8種子液,醋酸發(fā)酵結(jié)束后采用GC-MS法測定發(fā)酵產(chǎn)物中四甲基吡嗪的含量,以酒精發(fā)酵階段不接種T8菌株為對照,實驗結(jié)果如表6所示。從表6可以看出,接入T8菌株后,料醅中四甲基吡嗪的含量與對照相比提高了22.1%,說明T8菌株在食醋釀造過程中有明顯的增香作用。

表6　接種T8菌株食醋中四甲基吡嗪的含量

3　結(jié)論

本實驗對篩選獲得的產(chǎn)乙偶姻酵母菌T8進行了生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定,確定其為葡萄汁有孢漢遜酵母(H.uvarum),可為食醋及相關(guān)發(fā)酵食品風(fēng)味改善提供菌種來源。優(yōu)化的H.uvarumT8菌株發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻種子培養(yǎng)液為:葡萄糖60 g/L,蛋白胨和酵母膏復(fù)合氮源各為10 g/L,(NH4)2HPO4濃度為8 g/L,培養(yǎng)基的無機鹽組分是KH2SO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、MnSO40.6 g/L。培養(yǎng)基組分優(yōu)化后,生物量為7.68 g/L,乙偶姻含量到達15.236 g/L,與初始發(fā)酵培養(yǎng)基乙偶姻產(chǎn)量12.090 g/L相比提高了20.65%。人工接種T8菌株種子液的食醋釀造實驗結(jié)果表明,所釀食醋中特征風(fēng)味物質(zhì)——四甲基吡嗪的含量較對照提高了22.1%,增香效果明顯,證明H.UvarumT8菌株可以作為食醋釀造的增香酵母。

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Isolation of yeast with high acetoin-producing ability from Liangzhou fumigated vinegar and optimization for its fermentation medium

ZHAO Feng-qin,YUN Jian-min*,ZHAO Xiao-rui,LI Hong-zhen,JIA Ya-li

(College of Food science and engineering of Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Acetoin,a precursor of tetramethylpyrazine,is identified as a flavor component of Liangzhou fumigated vinegar. In the test,an acetoin-producing strain T8 was isolated from the fermented cultures of Liangzhou fumigated vinegar,which was identified asHanseniasporauvarumby classical identification methods and ITS gene sequence similarities. In order to further know the nutritional requirements of T8 growth and metabolism,the fermentation medium for producing acetoin with T8 was optimized,so that it could provide the better seed medium for flavoring yeast in modern vinegar brewing process.The key fermentation factors of affecting acetoin yield byH.uvarumwere studied,including the carbon resource,the nitrogen resource,inorganic salts concentration. The results showed that the best fermentation medium component was:glucose 60 g/L,peptone 10 g/L,yeast extract 10 g/L,(NH4)2HPO48 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.75 g/L,MnSO40.6 g/L. Under the optimized conditions,the acetoin yield reached 15.236 g/L,which was increased by 20.65% in comparison with the initial fermentation medium,and the content of tetramethylpyrazine in vinegar cultures was increased by 22.1% in comparison with control in the artificial inoculation vinegar brewing test,it showed that T8 could help to improve the vinegar flavor.

vinegar brewing;acetoin;yeast;fermentation medium;optimization

2015-12-16

趙風(fēng)琴(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：zhaofq0825@126.com。

贠建民(1968-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物發(fā)酵與發(fā)酵工程，E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項目(31360405)。

TS264.2

A

1002-0306(2016)11-0147-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.022