王大欣,張　丹,*,初少華,支月娥,2,周　培,2,3,*

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240;2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200240;3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240)

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巨大芽孢桿菌NCT-2凍干菌劑的制備及凍干保護(hù)劑響應(yīng)面優(yōu)化

王大欣1,張丹1,*,初少華1,支月娥1,2,周培1,2,3,*

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240;2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200240;3.上海交通大學(xué)陸伯勛食品安全研究中心,上海 200240)

采用真空冷凍干燥法制備巨大芽孢桿菌NCT-2菌劑,采用單因素實(shí)驗(yàn)并用響應(yīng)面方法對凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行了優(yōu)化。以巨大芽孢桿菌NCT-2凍干存活率為考察因素,從離心濃縮條件、保護(hù)基質(zhì)、保護(hù)劑篩選與復(fù)配、復(fù)水種類等方面探究影響。結(jié)果表明,離心條件為5000 r/min,10 min,選取新鮮培養(yǎng)基為保護(hù)基質(zhì)時(shí)對巨大芽胞桿菌NCT-2凍干保護(hù)效果最佳。不同復(fù)水水質(zhì)對菌體存活率無較大影響。當(dāng)凍干保護(hù)劑濃度為:蔗糖4.51 mg/g、海藻糖0.90 mg/g、葡萄糖9.60 mg/g時(shí)凍干存活率最高,經(jīng)驗(yàn)證存活率最高可達(dá)91.8%。

巨大芽孢桿菌,真空冷凍干燥,保護(hù)劑,響應(yīng)面優(yōu)化

設(shè)施栽培中由于氮肥的大量施用,導(dǎo)致土壤次生鹽漬化,使土壤鹽分尤其是硝態(tài)氮含量增高,硝態(tài)氮在土壤和水體中積累給人類的生存帶來巨大的危害。采用微生物法修復(fù)次生鹽漬化土壤是極為有效的途徑[1]。實(shí)驗(yàn)室自主從設(shè)施栽培次生鹽漬化土壤中篩選出一株耐硝酸鹽的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)NCT-2,該菌株可以有效降低土壤中硝態(tài)氮含量及土壤電導(dǎo)率值,并提高土壤有機(jī)質(zhì)含量及微生物數(shù)量[2]。該菌株已經(jīng)作為生物肥料用于生產(chǎn)當(dāng)中,但是仍存在活菌數(shù)不高,體積大攜帶不方便,未優(yōu)化配方等問題,制約了生產(chǎn)進(jìn)一步發(fā)展。

真空冷凍干燥技術(shù)是將物料在低溫凍結(jié)后,真空條件下將冰升華為水蒸氣從而脫去物料中的水分使物料干燥的技術(shù)[3],具有可以避免物料熱敏變質(zhì)、理想的速溶與復(fù)水性、體積小方便儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)。但是,真空冷凍干燥過程對菌體存活率具有一定的影響。研究表明,凍干保護(hù)劑的應(yīng)用是影響凍干存活率最為重要的因素[4]。因此,優(yōu)化保護(hù)劑配方是提高凍干菌體存活率的關(guān)鍵途徑,響應(yīng)面作為一種高效統(tǒng)計(jì)方法,可以用較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)去優(yōu)化多種變量,從而預(yù)測最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]。國內(nèi)已有相關(guān)利用真空冷凍干燥技術(shù)制備菌粉的研究[6-7],保護(hù)劑經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后保證了較高的菌體存活率,可見對保護(hù)劑研究具有重要意義。

本研究以前期獲得的具有良好次生鹽漬化土壤修復(fù)特性的巨大芽孢桿菌(B.megaterium)NCT-2為研究對象,應(yīng)用真空冷凍干燥技術(shù)制備凍干菌劑,通過探究保護(hù)劑配方并對其進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化,獲得了高活性巨大芽孢桿菌凍干菌劑,解決目前微生物菌劑普遍存在的活菌數(shù)不高,體積大不方便運(yùn)輸,無優(yōu)化配方,生產(chǎn)效率低等問題,為我國土壤修復(fù)菌劑的生產(chǎn)提供了依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

巨大芽孢桿菌(B.megaterium)NCT-2,由實(shí)驗(yàn)室保藏。

種子培養(yǎng)基(LB):NaCl 10 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,蒸餾水1000 mL,pH7.0～7.5,121 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母粉 3.0 g,蔗糖15 g,KH2PO40.5 g,MnSO40.05 g,水1000 mL。新鮮培養(yǎng)基:KCl 1.0 g,FeSO4·7H2O 10.0 mg,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl21.0 mg,KH2PO40.5 g,葡萄糖 15.0 g,KNO31.5 g,蛋白胨1.5 g,水1000 mL,pH7.0～7.2。脫脂奶粉懸浮基質(zhì):脫脂奶粉 100 g/L,水1000 mL。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中加入15～20 g/L瓊脂即可。

ZWYR-2112B 型雙層恒溫?fù)u床上海智城分析儀器制造有限公司;DELTA320 pH計(jì)梅特勒-托利多儀器上海有限公司;BLBIO-XGCA型5 L發(fā)酵罐上海百倫生物科技有限公司;M200PRO多功能酶標(biāo)儀德國/瑞士TECAN;CT/4RO型離心機(jī)天美(中國)科學(xué)儀器有限公司;icount10型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀杭州迅速科技有限公司;FD-1-50e型真空冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1巨大芽孢桿菌NCT-2凍干菌劑制備流程菌種活化→制備菌液→生長曲線測定→離心收集菌體→制備菌懸液→添加保護(hù)劑→真空冷凍干燥→復(fù)水

1.2.2巨大芽孢桿菌NCT-2 的培養(yǎng)及生長曲線的測定將巨大芽孢桿菌NCT-2接種至100 mL LB培養(yǎng)基中,35 ℃,180 r/min震蕩培養(yǎng)12 h后接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,初始pH7.0,轉(zhuǎn)速300 r/min、通氣量2 vvm、培養(yǎng)18 h后獲得發(fā)酵液。期間,每隔4 h用多功能酶標(biāo)儀測定OD(660 nm)值。菌種計(jì)數(shù)采用平板稀釋涂布法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3巨大芽孢桿菌NCT-2濃縮離心條件的確定取菌液25 mL裝于滅菌的離心管中,以4000、5000、6000 r/min轉(zhuǎn)速分別配以10、20 min離心時(shí)間,考察不同離心參對菌體存活能力的影響,檢測在不同的離心條件下的離心損失率、離心存活率,從而選取最佳的離心條件,減少菌體的損傷。離心前稱取管體總質(zhì)量(m2)及離心去上清液后管體總質(zhì)量(m1),計(jì)算每管獲得菌泥質(zhì)量。計(jì)算公式如下:

菌泥質(zhì)量(g)=m2-m1

離心損失率(%)=上清液活菌總數(shù)/發(fā)酵液活菌總數(shù)×100

離心存活率(%)=菌泥活菌總數(shù)/(發(fā)酵液活菌總數(shù)-上清液活菌總數(shù))×100

1.2.4懸浮基質(zhì)對冷凍干燥保護(hù)效果的影響凍干過程一般在一定的懸浮基質(zhì)中進(jìn)行,懸浮溶液的特性在整個(gè)凍干過程中對細(xì)胞活力有重要影響。以新鮮培養(yǎng)基及10%脫脂奶粉作為懸浮基質(zhì),與菌泥混合后加入15.0 mg保護(hù)劑/g濕菌。蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇作為凍干保護(hù)劑,進(jìn)行冷凍干燥,測定凍干后菌體存活率,計(jì)算方法如下:

菌體存活率(%)=凍干后活菌數(shù)(cfu)/凍干前活菌數(shù)(cfu)×100

1.2.5真空冷凍干燥方法將巨大芽孢桿菌NCT-2菌懸液放入到低溫冷凍冰箱中進(jìn)行預(yù)凍,凍結(jié)完全和形成小冰晶后將預(yù)凍好的菌液放入冷阱溫度為-30 ℃的真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干22 h。

1.2.6單一保護(hù)劑的選擇選取蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、麥芽糊精、海藻糖、甘露醇、甘油作為單一凍干保護(hù)劑研究其在凍干過程中對巨大芽孢桿菌NCT-2的保護(hù)效果。其中,蔗糖、葡萄糖、山梨醇、淀粉、麥芽糊精的添加濃度分別為0.9、4.8、9.6、14.4 mg保護(hù)劑/g濕菌;海藻糖、甘露醇、甘油的添加濃度分別為0.9、2、3.9、9.6 mg保護(hù)劑/g濕菌。

1.2.7響應(yīng)面法優(yōu)化凍干保護(hù)劑配方為了確定最佳的保護(hù)劑配方,根據(jù)單因素篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取蔗糖(X1)、海藻糖(X2)、葡萄糖(X3)三個(gè)主要因素為自變量,巨大芽孢桿菌NCT-2菌體存活率為相應(yīng)指標(biāo),采用Box-Behnken方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),具體設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)見表1,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表1　NCT-2菌體存活率響應(yīng)面因素水平表

注:mg/g指mg保護(hù)劑/g濕菌。

1.2.8巨大芽孢桿菌NCT-2菌劑的復(fù)水取等量的凍干菌劑分別加入井水、河水、雨水稀釋到凍干前原有體積后,放置1 h,測定復(fù)蘇后菌體存活率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取平均值。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Design Expert 8.0軟件完成響應(yīng)面設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、回歸模型建立,應(yīng)用SAS 9.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性顯著分析,Origin Pro 8.0 進(jìn)行作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1巨大芽孢桿菌NCT-2生長曲線的繪制

以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD660為縱坐標(biāo),繪制NCT-2生長曲線,結(jié)果如圖1所示。

圖1　巨大芽孢桿菌NCT-2生長曲線Fig.1　The growth curve of B.megaterium NCT-2

由圖1可知,巨大芽孢桿菌NCT-2生長過程中,0～4 h為延遲期,4～20 h為對數(shù)期,其中16～20 h為對數(shù)末期,20～32 h為穩(wěn)定期。因此,選取對數(shù)末期18 h作為收獲期。

2.2巨大芽孢桿菌NCT-2濃縮離心條件的確定

目前主要有離心、過濾、絮凝等方式進(jìn)行生物質(zhì)收獲[8],其中用于菌體濃縮的方法主要是離心分離法。在離心過程中,一方面要注意離心力等因素對菌體存活率的影響,另一方面要保證較高的活菌數(shù)量,活菌數(shù)會(huì)因離心工藝掌握不當(dāng)而大大降低[9]。

如圖2所示,相同轉(zhuǎn)速下,隨著離心時(shí)間的增加,離心損失率下降,離心存活率也隨之下降,說明雖然增加離心時(shí)間可以減少菌體隨上清液的流失,但是對菌體活性的活性也造成了相應(yīng)的危害。相較離心損失率而言,不同離心時(shí)間對菌體存活率影響較大。從經(jīng)濟(jì)角度應(yīng)選擇較小離心力和較短離心時(shí)間,因此選取5000 r/min,10 min離心參數(shù),來保證最佳的離心存活率,此時(shí)菌體存活率為75.43%。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)重復(fù)取平均值。同時(shí)經(jīng)測三次定取平均值后得知,離心每25 mL發(fā)酵液獲菌泥的平均質(zhì)量為2.10 g。

圖2　不同轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間對菌體存活率的影響Fig.2　Different rotational speedand centrifugal effect on bacteria survival rate

2.3不同懸浮基質(zhì)對冷凍干燥保護(hù)效果的影響

凍干前一般將菌泥懸浮在一定基質(zhì)中,基質(zhì)不但能給后續(xù)微生物生長提供營養(yǎng),也可以在凍干過程中對微生物起到一定的保護(hù)作用[10]。如表2為不同凍干保護(hù)劑在新鮮培養(yǎng)基及10%脫脂奶粉中的凍干存活率。

表2　不同懸浮基質(zhì)中NCT-2凍干存活率

由表2結(jié)果可以看出,在四種保護(hù)劑中,以新鮮培養(yǎng)基作為懸浮基質(zhì)的菌體存活率均高于以10%脫脂奶粉為懸浮基質(zhì)的存活率。有研究表明,雖然Ca2+、Mg2+等離子會(huì)使細(xì)胞的滲透壓發(fā)生改變從而對細(xì)胞產(chǎn)生損傷,但是對于一些喜鹽微生物來說,適當(dāng)濃度的Na+、K+、Mg2+可以保證最大程度的凍干菌體存活率[11]。因此選用新鮮培養(yǎng)基為懸浮基質(zhì)進(jìn)行單一凍干保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)。

2.4單一凍干保護(hù)劑篩選

適宜的凍干保護(hù)劑可以顯著的提高凍干后的菌體存活率,絕大多數(shù)細(xì)菌冷凍干燥成功的關(guān)鍵在于有效保護(hù)劑的使用[12-13]。不同的保護(hù)劑及其用量對細(xì)菌凍干時(shí)保護(hù)作用不同,因此需對凍干保護(hù)劑的種類及用量進(jìn)行篩選。如圖3所示,為加入不同種類和濃度的凍干保護(hù)劑后巨大芽孢桿菌NCT-2的凍干存活率。

圖3　加入不同種類濃度凍干保護(hù)劑后凍干菌體存活率Fig.3　The sruvival rate of bacterica afteradding different cryoprotectants of different concentration

由圖3的結(jié)果可以看出,巨大芽孢桿菌NCT-2的存活率在加入保護(hù)劑后均有不同程度的提高,保護(hù)劑均對巨大芽胞桿菌NCT-2有一定的保護(hù)作用。在眾多的保護(hù)劑中,海藻糖保護(hù)效果最為顯著,凍干保護(hù)率達(dá)78.8%。蔗糖、葡萄糖、甘露醇等也對巨大芽孢桿菌NCT-2具有良好的保護(hù)效果。

有研究表明,海藻糖具有抗凍抗熱的穩(wěn)定性。海藻糖不僅可以通過與細(xì)胞外水分子形成氫鍵來提高細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[14],而且它具有較高的晶體轉(zhuǎn)換溫度,可以在較高的凍干溫度下保持很好的穩(wěn)定性[15]。甘露醇一般在凍干過程中作為填充劑使用,它可以產(chǎn)生晶體從而為組分提供物理支撐,且不會(huì)與其它成分發(fā)生反應(yīng)[16]。蔗糖可以促進(jìn)細(xì)胞在懸浮液中分散,還可以作為細(xì)胞今后生長用的碳源。在冷凍干燥保護(hù)劑選擇過程中,要考慮其在凍干菌劑中的溶解性能,還要考慮到成本及后期微生物生長過程中的能源供給問題,額外碳源的添加可以顯著提高微生物冷凍干燥的抗性[17]。

2.5響應(yīng)面法優(yōu)化凍干保護(hù)劑配方

響應(yīng)面法RSM是為了找尋多變量體系中最佳的優(yōu)化條件設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案,是一種高效的優(yōu)化技術(shù)[18]。它主要分析研究因素和評價(jià)因素之前的相關(guān)性和他們之間的相互影響,并建立數(shù)學(xué)模型,獲得最佳的優(yōu)化組合,可以提高生產(chǎn)效率,減少支出,獲得科學(xué)的結(jié)論。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取蔗糖(X1)、海藻糖(X2)、葡萄糖(X3)三個(gè)效果最好的主要因素為自變量,菌體存活率為相應(yīng)指標(biāo),采用Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)原理,進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),共27個(gè)析因點(diǎn)和15個(gè)區(qū)域中心點(diǎn),每組平行實(shí)驗(yàn)三次,具體設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3　NCT-2菌體存活率BBD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

軟件分析得到目標(biāo)響應(yīng)值與各個(gè)因素關(guān)系的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?Y=20.67500+13.83072917X1+78.71296X2+8.66753X3-5.69444X1X2-0.45166X1X3-4.14931X2X3-1.24674X12-29.12037X22-0.35807X32。其中,Y為凍干后的菌體存活率,X1為蔗糖,X2為海藻糖,X3為葡萄糖。

表4　二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果

注:*差異顯著,p<0.05,**差異極顯著,p<0.01。

保持其中單一因素最優(yōu)條件,其它兩個(gè)因素與響應(yīng)值的關(guān)系由Design Expert 8.0軟件處理得到響應(yīng)面圖如下圖4所示,可以直觀呈現(xiàn)各因素相互作用影響,從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等值線可以看出,各因素在所選范圍內(nèi)存在極值,即響應(yīng)最高點(diǎn),這與表4中p值結(jié)果一致。在交互項(xiàng)對菌體存活率影響中,蔗糖與海藻糖交互作用對菌體存活率影響極為顯著(p<0.0001),交互作用影響順序?yàn)?X1X2>X2X3>X1X3。

根據(jù)回歸模型預(yù)測出菌體存活率的最高值,當(dāng)蔗糖濃度為4.51 mg/g,海藻糖濃度0.90 mg/g,葡萄糖9.60 mg/g,預(yù)測出的菌體存活率為93.64%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性,應(yīng)用該預(yù)測配方,實(shí)驗(yàn)經(jīng)過三次實(shí)驗(yàn)取平均值,測得菌體存活率為91.8%,實(shí)際值比預(yù)測值誤差為1.96%。因此,響應(yīng)面法對凍干保護(hù)劑的優(yōu)化是可行的,得到的保護(hù)劑配方具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4　三因子交互作用對NCT-2凍干存活率影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Survival response surface figure of three factors on freeze-dried survival rate of NCT-2

2.6NCT-2凍干菌劑的復(fù)水

復(fù)水是凍干細(xì)胞復(fù)蘇重要的一個(gè)步驟,復(fù)蘇所用的溶劑以及復(fù)蘇條件都會(huì)影響最后的菌體存活率。一般采用最適合該菌生長的培養(yǎng)液或生理鹽水作為復(fù)水介質(zhì)進(jìn)行復(fù)水[19]。由于用于一般灌溉用水中存在Ca2+、Mg2+等金屬離子,可以滿足細(xì)胞復(fù)水需要。

圖5　不同復(fù)水水質(zhì)對應(yīng)的菌體存活率Fig.5　The survival rate of bacteria influenced by water type

圖5結(jié)果顯示,經(jīng)復(fù)水后,在井水、雨水、河水中凍干菌劑的存活率分別為90.90%、91.53%、91.27%?？梢?不同水質(zhì)用于凍干菌劑的復(fù)水,菌體存活率相差不大。

3　結(jié)論

本研究探究了巨大芽孢桿菌NCT-2凍干菌劑的制備方法,應(yīng)用離心法收集菌泥,探究不同離心速率及時(shí)間對菌體離心損失率及存活率的影響,最終確定了最佳離心條件為5000 r/min,10 min,經(jīng)探究選定新鮮培養(yǎng)基作為懸浮基質(zhì)。本研究通過單因素篩選和響應(yīng)面優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到的二次響應(yīng)曲面模型具有較高的回歸率,與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合程度較高,確定了最佳保護(hù)劑配方為:蔗糖4.51 mg/g、海藻糖0.90 mg/g、葡萄糖9.60 mg/g。經(jīng)驗(yàn)證菌體存活率達(dá)91.8%。研究分別采用井水、河水、雨水對制成的菌劑進(jìn)行復(fù)水,結(jié)果表明不同類型灌溉水對菌體復(fù)水存活率影響不大。

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Preparation ofBacillusmegateriumNCT-2 freeze-dried agent by using response surface methodology

WANG Da-xin1,ZHANG Dan1,*,CHU Shao-hua1,ZHI Yue-e1,2,ZHOU Pei1,2,3,*

(1.School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China;2.Key laboratory of Urban Agriculture(South),Ministry of Agriculture,Shanghai 200240,China;3.Bor.S.Luh Food Safety Research Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

Vacuum freeze-drying method was used to prepareB.megateriumNCT-2 agents,cryoprotectants were optimized using response surface methodology after single factor experiment.Centrifugal conditions,suspension substrate,selection and formulation of cryoprotectants,rehydration water were studied on the impact of survival rate.The results showed that the optimal conditions were 5000 r/min,10 min and fresh media was the better choice as the suspended substrate.Different kinds of water did not had obvious impact on the survival rate after rehydration.Results indicated the optimal amounts of cryoprotectants formula were sucrose 4.51 mg/g,trehalose 0.9 mg/g,glucose 9.60 mg/g.The proven survival rate was 91.8%.

BacillusmegateriumNCT-2;Vacuum freeze-drying;cryoprotectant;response surface methodology

2015-09-25

王大欣(1992-)，女，碩士，研究方向：環(huán)境微生物，E-mail：hellodaxin@163.com。

張丹(1988-),女，助理研究員，研究方向:土壤微生物修復(fù)，E-mail:zhangdannjut@163.com。

周培(1964-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)業(yè)生境污染防治與生物修復(fù)，E-mail：peizhousjtu@163.com。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)課題(2012AA101405)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0156-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.024