張曉元,郝榮華,劉　飛,侯重文,朱希強(qiáng)

(山東省藥學(xué)科學(xué)院山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)公司 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250101)

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麥芽糖漿預(yù)處理對(duì)酶法生產(chǎn)海藻糖的影響研究

張曉元,郝榮華,劉飛,侯重文,朱希強(qiáng)*

(山東省藥學(xué)科學(xué)院山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)公司 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250101)

利用酵母發(fā)酵法預(yù)處理去除麥芽糖漿中葡萄糖,以消除底物抑制提高酶法生產(chǎn)海藻糖產(chǎn)率。實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)朊假絲酵母為發(fā)酵微生物,以麥芽糖漿中的葡萄糖去除率為指標(biāo),采用單因素及正交實(shí)驗(yàn)方法探討不同因素對(duì)葡萄糖去除率的影響,并確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明:麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)40%,酵母菌液接種量4%,pH5.5,溫度32 ℃條件下,發(fā)酵 6 h后葡萄糖的去除率可達(dá)99.4%。以此糖漿為酶反應(yīng)底物生產(chǎn)海藻糖,海藻糖產(chǎn)率由初始29.8%提高至58.4%,漲幅達(dá)96.0%。研究結(jié)果對(duì)工業(yè)化利用麥芽糖漿酶法生產(chǎn)海藻糖提供有效數(shù)據(jù)及理論支持。

產(chǎn)朊假絲酵母,麥芽糖漿,預(yù)處理,海藻糖

海藻糖獲譽(yù)“生命之糖”,在脫水、干旱、低溫、高滲透等惡劣環(huán)境下可對(duì)生物膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子進(jìn)行有效保護(hù),進(jìn)而維持生物體的生命過程和生物特征[1-4]。而葡萄糖、蔗糖、乳糖等其它糖類均不具備這一功能。獨(dú)特的功能特性,使得海藻糖除廣泛用作酶類、疫苗和其他生物制品的活性保護(hù)劑外,更可作為甜味劑、穩(wěn)定劑、保鮮劑等應(yīng)用于食品加工和儲(chǔ)存,以有效保持食品新鮮風(fēng)味及避免食品品質(zhì)劣化[5-9]。

目前,海藻糖生產(chǎn)大都采用一步酶轉(zhuǎn)化法,由tres基因編碼的海藻糖合酶通過分子轉(zhuǎn)糖基作用、異構(gòu)反應(yīng)將麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖[10-13]。工業(yè)化生產(chǎn)上多采用麥芽糖漿替代純麥芽糖粉,以降低生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)品收益。麥芽糖漿主要成分為麥芽糖及少量葡萄糖、麥芽三糖、麥芽四糖,其中葡萄糖含量約5%～10%(以干物質(zhì)計(jì))[14-15]。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)麥芽糖漿中過多葡萄糖成分會(huì)嚴(yán)重抑制海藻糖產(chǎn)率[16],因此對(duì)麥芽糖漿進(jìn)行合適預(yù)處理來降低葡萄糖含量至關(guān)重要。Kyu Beomk等報(bào)道用模擬移動(dòng)床分離色譜技術(shù)連續(xù)處理分離葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖[17]。但作為工業(yè)化生產(chǎn)原料預(yù)處理上應(yīng)用,相對(duì)成本較高。酵母發(fā)酵法去除葡萄糖在木糖母液、玉米皮水解液、大豆低聚糖等生產(chǎn)上都有所報(bào)道,該法安全性高,價(jià)格低廉而廣受市場(chǎng)歡迎[18-20]。但在麥芽糖漿預(yù)處理應(yīng)用上尚未見報(bào)道。本研究選用產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵法去除麥芽糖漿中葡萄糖,優(yōu)化預(yù)處理工藝條件,以提高酶法生產(chǎn)海藻糖產(chǎn)率,為工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

產(chǎn)朊假絲酵母YKY-Z81(CandidautilisYKY-Z81)本實(shí)驗(yàn)室篩選保存的耐高糖酵母菌;麥芽糖漿(固形物(80%),麥芽糖(50%),葡萄糖(10%)保齡寶生物股份有限公司提供;海藻糖合酶(適用pH5.5～6.5 酶活單位100 U/mL)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建基因工程菌株發(fā)酵獲得;其他生化試劑均分析純購自山東博尚生物科技有限公司。

生物傳感儀SBA-40C山東省科學(xué)院生物研究所;液相色譜儀1200型美國安捷倫公司;六聯(lián)發(fā)酵罐Infors ht 1000 mL瑞士INFORS公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)朊假絲酵母菌液制備將活化后產(chǎn)朊假絲酵母CandidautilisYKY-Z81按1%～2%的接種量無菌條件下接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min恒溫培養(yǎng)至OD600=4～5,5000 r/min離心5 min,去除上清液,得到酵母泥。用前加入1/5發(fā)酵體積無菌水懸浮得酵母菌液,顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌數(shù)量控制在1～1.2×109個(gè)/mL。

1.2.2葡萄糖含量測(cè)定方法生物傳感儀SBA-40C測(cè)定葡萄糖含量。

1.2.3海藻糖、麥芽糖測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[21]HPLC法檢測(cè),具體參數(shù)色譜柱:XBridgeTMNH2(3.5 μm×4.6 μm×250 mm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:V乙腈∶V水=4∶1,配好后加0.1%氨水;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)器溫度:40 ℃。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)方法利用Infors ht 1000 mL六聯(lián)發(fā)酵罐模擬工業(yè)化生產(chǎn),進(jìn)行平行反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。重點(diǎn)考察酵母菌液接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH、麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)這四個(gè)主要因素,確定各參數(shù)的較優(yōu)條件。六聯(lián)罐參數(shù)設(shè)計(jì)如下:統(tǒng)一最終裝液量70%(700 mL)、轉(zhuǎn)速200 r/min、進(jìn)氣壓力0.05 MPa、通氣量0.2 L/min、DO不控制。發(fā)酵時(shí)間16 h,每2 h測(cè)定一次葡萄糖含量。

1.2.4.1酵母菌液接種量對(duì)去除葡萄糖效果的影響選用體積分?jǐn)?shù)為50%的麥芽糖漿液,酵母菌液分別以1%、2%、3%、4%和5%的接種量,發(fā)酵溫度28 ℃,pH6.5,進(jìn)行去除葡萄糖發(fā)酵并定時(shí)測(cè)定葡萄糖含量。

1.2.4.2發(fā)酵溫度對(duì)去除葡萄糖效果的影響麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)50%,酵母菌液接種量為3%,分別在26、28、30、32、34 ℃溫度下,pH6.5,進(jìn)行去除葡萄糖發(fā)酵并定時(shí)測(cè)定葡萄糖含量。

1.2.4.3麥芽糖漿的pH對(duì)去除葡萄糖效果的影響麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)50%,酵母菌液接種量為3%,發(fā)酵溫度28 ℃,分別調(diào)節(jié)其pH為4.5、5.5、6.5、7.5,進(jìn)行去除葡萄糖發(fā)酵并定時(shí)測(cè)定葡萄糖含量。

1.2.4.4麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)對(duì)去除葡萄糖效果的影響麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%、60%、70%,酵母菌液接種量為3%,發(fā)酵溫度28 ℃,pH6.5,進(jìn)行去除葡萄糖發(fā)酵并定時(shí)測(cè)定葡萄糖含量。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用正交表L9(34)做正交實(shí)驗(yàn)(見表1)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)處理重復(fù)3次,每次做3個(gè)平行。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.6海藻糖酶法合成參照文獻(xiàn)[22]方法,(預(yù)處理)麥芽糖漿用0.02 mol/L pH6.5磷酸緩沖液稀釋成40%體積分?jǐn)?shù)稀釋液,取95 mL稀釋麥芽糖漿底物加入5 mL海藻糖合酶酶液,24 ℃反應(yīng)30 h后,沸水浴10 min終止酶反應(yīng),12000 r/min離心10 min,上清液適當(dāng)稀釋后用HPLC測(cè)定生成的海藻糖量。

計(jì)算海藻糖產(chǎn)率(%)=反應(yīng)液海藻糖量/反應(yīng)液總糖含量×100

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)并制圖。應(yīng)用正交設(shè)計(jì)助手II V3.1軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析。

2　結(jié)果與討論

2.1酵母接種量對(duì)去除葡萄糖效果的影響

由圖1可知,在麥芽糖漿濃度和葡萄糖濃度等初始條件相同的情況下,葡萄糖去除效果與接種量呈正相關(guān),接種量增加,葡萄糖去除速度增加。1%酵母菌液接種量去除葡萄糖速度最慢,發(fā)酵16 h,麥芽糖漿中仍有質(zhì)量分?jǐn)?shù)約0.3%葡萄糖存在。3%～5%酵母菌液接種量去除葡萄糖效果相差不大,發(fā)酵10 h時(shí),葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)可降低至0.3%左右,此后下降變緩,直至葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)趨于零。因此可以得出,麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),接種3%酵母菌液,發(fā)酵10 h即可有效去除葡萄糖。

圖1　不同接種量下葡萄糖濃度隨時(shí)間的變化Fig.1　Effect of the addition of yeast on the result of removing glucose

2.2發(fā)酵溫度對(duì)去除葡萄糖效果的影響

由圖2可知,在26～32 ℃范圍內(nèi),隨著溫度升高,葡萄糖去除效果越明顯。主要原因在于,在一定溫度范圍內(nèi),隨溫度升高,酵母細(xì)胞內(nèi)酶活性升高,生長繁殖加快,葡萄糖利用效率提高[23]。當(dāng)溫度提高至34 ℃時(shí),過高溫度影響菌體生長及菌體參與葡萄糖代謝相關(guān)酶活性[24]。因此選擇32 ℃下進(jìn)行葡萄糖去除較為恰當(dāng)。

圖2　不同溫度下葡萄糖濃度變化Fig.2　Effect of the temperature on the result of removing glucose

2.3麥芽糖漿的pH對(duì)去除葡萄糖效果的影響

由圖3可知,pH為7.5時(shí),去除葡萄糖效果最差。pH為5.5和6.5時(shí)效果差別不大,去除葡萄糖效果較好。故麥芽糖漿的pH選為5.5～6.5。

圖3　pH對(duì)葡萄糖去除效果的影響Fig.3　Effect of the pH on the result of removing glucose

2.4麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)對(duì)去除葡萄糖效果的影響

由圖4可知,麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)越大,葡萄糖去除越慢。分析原因,麥芽糖漿濃度的增加對(duì)應(yīng)葡萄糖濃度也增加,去除葡萄糖所需的時(shí)間也增長。另外,糖濃度的增加,酵母細(xì)胞周圍的滲透壓升高,影響酵母細(xì)胞生長及胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。當(dāng)麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)增加至60%以上時(shí),葡萄糖去除速度明顯變慢。麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)30%、40%,葡萄糖濃度8 h內(nèi)降至0.2%以下;麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)50%時(shí),葡萄糖濃度8 h內(nèi)可降至0.7%以下。綜合考慮后續(xù)海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)麥芽糖底物濃度要求30%～40%,預(yù)處理后麥芽糖漿還需進(jìn)行pH調(diào)節(jié)及添加酶液,麥芽糖濃度會(huì)進(jìn)一步稀釋降低,故選擇40%～50%體積分?jǐn)?shù)麥芽糖漿較為合適。

圖4　麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄糖去除效果的影響Fig.4　Effect of the concentration of malt syrup on the result of removing glucose

2.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,結(jié)合海藻糖工業(yè)生產(chǎn)上下游工藝及節(jié)能降耗、簡(jiǎn)化工藝目標(biāo),優(yōu)化設(shè)計(jì)水平參數(shù)見表1,其中麥芽糖漿pH對(duì)下游海藻糖合酶穩(wěn)定性影響較大,根據(jù)酶適用pH5.5～6.5范圍,選取5.5、6.0、6.5三水平?？刂祁A(yù)處理時(shí)間6 h,以葡萄糖殘留濃度為指標(biāo),進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)確定最佳葡萄糖去除條件。

表2　L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

按表2進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行極差分析,得到各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響的主要順序是D>A>B>C,A2B2C1D1為較優(yōu)方案,即酵母菌液接種量4%,發(fā)酵溫度32 ℃,pH5.5,麥芽糖漿添加比例40%。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果做最佳因素的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),麥芽糖漿預(yù)處理前后主要成分濃度變化見圖5,可見麥芽糖漿中葡萄糖濃度由初始2.47%降低0.053%以下,接近于零;麥芽糖及糖漿中麥芽三糖、麥芽四糖等其他雜糖成分基本沒有影響。

圖5　麥芽糖漿預(yù)處理前后主要成分濃度變化及對(duì)海藻糖合成影響Fig.5　Concentration changes of main componentsand effects on the yield of trehalose beforeand after malt syrup pretreatment注：顯著性差異p值p<0.05(*)；p<0.01(**)；p<0.001(***)。

2.6預(yù)處理麥芽糖漿對(duì)海藻糖酶法合成影響

分別以預(yù)處理前麥芽糖漿和預(yù)處理后麥芽糖漿為底物,利用海藻糖合酶進(jìn)行麥芽糖轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖。HPLC法檢測(cè)海藻糖產(chǎn)量,計(jì)算可知海藻糖生成率由初始29.8%提高至58.4%,漲幅達(dá)96.0%(圖5)。

3　結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn),得出麥芽糖漿預(yù)處理較佳條件為:麥芽糖漿體積分?jǐn)?shù)40%,產(chǎn)朊假絲酵母菌液接種量4%,pH為5.5,溫度32 ℃條件下,經(jīng)6 h發(fā)酵預(yù)處理,糖漿中葡萄糖濃度可降低至0.06%以下。有效降低了葡萄糖作為麥芽糖異構(gòu)生產(chǎn)海藻糖反應(yīng)副產(chǎn)物的反饋抑制作用,海藻糖產(chǎn)率也由初始29.8%提高至58.4%,漲幅達(dá)96.0%。該研究為工業(yè)化以麥芽糖漿為底物生產(chǎn)海藻糖提供了理論及數(shù)據(jù)支持。

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Effect of malt syrup pretreatments on the trehalose production by enzymatic method

ZHANG Xiao-yuan,HAO Rong-hua,LIU Fei,HOU Zhong-wen,ZHU Xi-qiang*

(Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences,Shandong Freda Pharmaceutical Group Company,Key Laboratory of Biopharmaceuticals,Engineering Laboratory of Polysaccharide drugs,National-Local Joint Engineering Laboratory of Polysaccharide drugs,Jinan 250101,China)

Removing the glucose from malt syrup could disarm the substrate inhibition and improve the trehalose production by enzymatic method. In this study,the removing efficiency of glucose from malt syrup was improved by yeast fermentation,and the fermentation parameters was optimized by mono-factor analysis and orthogonal test. Results showed that at the presence of 40% malt syrup,4% yeast,99.4% glucose could be removed from malt syrup after incubation for 6 hour at 32 ℃ pH5.5. As a consequence,the trehalose yield increased from 29.8% to 58.4% which was a 96.0% increase compared with that obtained before. Our results provide a promising strategy for industrial production of trehalose using malt syrup as substrate.

Candidautilis;malt syrup;pretreatment;trehalose

2015-11-19

張曉元(1979-)，男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：微生物技術(shù)，E-mail：gnice@163.com。

朱希強(qiáng)(1967-)，男，博士，研究員，研究方向：生物技術(shù)藥物，E-mail：xistrong@sina.com。

山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)(2014GGZH1306)；濟(jì)南市重大專項(xiàng)(201403009)。

TS202.1

A

1002-0306(2016)11-0161-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.025