林　曼,陳歷俊,董學(xué)艷,閔偉紅,姜鐵民,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130000；2.北京三元食品股份有限公司國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163)

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GC-MS法檢測(cè)嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸

林曼1,陳歷俊2,董學(xué)艷2,閔偉紅1,姜鐵民2,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130000；2.北京三元食品股份有限公司國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163)

研究建立一種高效、準(zhǔn)確測(cè)定嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸含量的方法。采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ISO)14156的方法提取脂肪,利用豬胰脂酶專一水解甘油三酯Sn-1,3位脂肪酸,通過(guò)氨基固相萃取柱法分離水解產(chǎn)物中單甘油酯,甲酯化后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)Sn-2位棕櫚酸。結(jié)果表明用氨基固相萃取柱法取代傳統(tǒng)薄層層析法分離單甘油酯不僅操作簡(jiǎn)單,分離效果好,而且回收率高,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,GC-MS法檢測(cè)3種嬰兒配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的含量分別為40.5%、40.3%和40.8%,添加回收率范圍為91.7%～98.5%,RSD為1.56%,重現(xiàn)性良好,完全適用于嬰兒配方奶粉甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的檢測(cè)。

嬰兒配方奶粉,Sn-2位棕櫚酸,氨基固相萃取柱(SPE),氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)

母乳是足月新生兒最理想、最安全的食物,是嬰兒配方乳粉的黃金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。母乳中含有3%～5%的脂肪,其中甘油三酯占98%以上,它們?yōu)閶雰禾峁?0%～60%的能量和必需脂肪酸[3]。母乳脂肪具有特殊的組成和結(jié)構(gòu),其中含量最高的飽和脂肪酸是棕櫚酸,是人體最重要的產(chǎn)能脂肪酸,占母乳脂肪的20%～25%,其中70%以上棕櫚酸分布在Sn-2位上[4-6]。WHO提倡在嬰兒出生后至少6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行母乳喂養(yǎng),以滿足嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的需要,提高免疫力,降低感染傳染性疾病機(jī)率,但是受客觀因素影響,部分母親選擇奶粉喂養(yǎng)。國(guó)際一些大型嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)相繼推出含母乳脂肪類似物的產(chǎn)品,如荷蘭紐迪西亞乳制品公司的Nutrilon Omneo奶粉,產(chǎn)品標(biāo)示富含高Sn-2位棕櫚酸油脂,能夠有效防止嬰兒便秘腹瀉,有利于鈣質(zhì)吸收。Loders Croklaan(Univer)公司取得生產(chǎn)人乳脂替代品的專利,產(chǎn)品為BetapolTM,現(xiàn)在正進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。

2010年,中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第一號(hào)公告明確了1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(1,3-Dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride,C52:2,簡(jiǎn)稱OPO)擴(kuò)大使用范圍及使用量,旨在模仿母乳構(gòu)成和脂肪結(jié)構(gòu)的特性,提高Sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量。因此,亟待建立嬰兒配方奶粉Sn-2位棕櫚酸含量的檢測(cè)方法[7-8]。目前,用薄層層析法分離脂肪水解產(chǎn)物,衍生后利用氣相色譜進(jìn)行分析,是最常見(jiàn)的Sn-2位脂肪酸檢測(cè)方法[4,9-10],此方法不僅操作復(fù)雜,耗時(shí)耗力,而且檢測(cè)結(jié)果受硅膠層析板質(zhì)量、展開(kāi)劑組成、顯色方法影響很大。本文采用氨基固相萃取柱法替代薄層層析法分離甘油單酯,快速衍生后用GC-MS法檢測(cè)Sn-2位棕櫚酸的含量,以建立方便、準(zhǔn)確測(cè)定嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸含量的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

3種不同品牌的嬰兒配方奶粉購(gòu)于大型超市;豬胰酯酶(30～90 units/mg)Sigma公司;氨基固相萃取柱(500 mg/6 mL)Agela公司;薄層層析硅膠板(100 mm×200 mm,厚度0.20～0.25 mm)青島海洋化工有限公司;37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(≥99%,10 mg/mL)、棕櫚酸甘油三酯(≥98%,1 g)Aladdin公司;去離子水;其他試劑為色譜純。

GC-MS系統(tǒng)TRACE1300-ISQ-LT系統(tǒng);超聲清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠;渦旋振蕩器SCILOGEX公司;高速冷凍離心機(jī):Sigma公司;氮吹儀天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1脂肪提取方法采用ISO14156(IDF172)規(guī)定的方法提取嬰兒配方奶粉脂肪[11]。

1.2.2豬胰酯酶水解脂肪向提取的脂肪中加入2 mL 0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.8)、0.5 mL 0.05%(m/v)膽酸鈉溶液、0.2 mL 2.2%(m/v)CaCl2溶液,充分混勻后加入20 mg豬胰脂酶,渦旋振蕩1 min后,在40 ℃的振蕩水浴鍋中反應(yīng)2 min,恒溫環(huán)境下劇烈振蕩2 min,分兩次加入10 mL無(wú)水乙醚,4000 r/min離心5 min,合并醚層,氮吹至恒重,正己烷復(fù)容。

1.2.3 Sn-2位單甘油酯的制取氨基固相萃取柱分離法:取氨基固相萃取柱(500 mg,6 mL),分兩次加入4 mL正己烷,活化萃取柱。加入脂肪酸溶液,棄去流出液;分4次加入8 mL正己烷-乙酸乙酯淋洗液(v/v=85∶15),棄去淋洗液;分4次加入8 mL二氯甲烷-甲醇洗脫液(v/v=2∶1),收集洗脫液,氮?dú)獯蹈伞?/p>

薄層層析分離法[11]:玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管將脂肪溶液點(diǎn)在距離薄層板底邊15 mm處,點(diǎn)樣后干燥5 min,展開(kāi)劑為正己烷∶乙醚∶甲酸=70∶30∶1(v∶v∶v),層析結(jié)束后將層析板放入到碘蒸氣中顯色,用微型刮鏟刮下單甘油酯譜帶(Rf值約0.035),加入10 mL乙醚分兩次提取脂肪,離心后取出有機(jī)層,氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.4脂肪酸甲酯化方法一[12]:加入5 mL甲苯,6 mL乙酰氯-甲醇溶液,75 ℃水浴振蕩2.5 h。冷卻至室溫,將反應(yīng)液移至50 mL離心管中,用6.0 mL碳酸鈉溶液分2次清洗頂空瓶,合并清洗于離心管中,4000 r/min離心5 min,吸取1 mL上次清液于進(jìn)樣瓶,檢測(cè)前于-20 ℃下保存。

方法二[13]:加入5.0 mL 0.5 N的鹽酸-甲醇溶液,2 mL正己烷,2 mL甲醇,在80 ℃下水浴2 h,冷卻后加入2 mL去離子水,4000 r/min離心5 min,取1.0 mL上層清液于進(jìn)樣瓶,檢測(cè)前于-20 ℃下保存。

方法三:加入4.0 mL 1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液,劇烈振蕩4 min,加入1 mL去離子水和2 mL正己烷,充分混勻后于4000 r/min離心5 min,取1.0 mL上層清液于進(jìn)樣瓶中,檢測(cè)前于-20 ℃下保存。

1.2.5GC參數(shù)色譜柱:HP-88氣相色譜柱(100 m×0.250 mm,0.20 μm);進(jìn)樣口溫度:200 ℃;恒流速模式:1 mL/min;進(jìn)樣量:1 μL;分流比:10∶1;載氣:N2;柱溫箱升溫程序如表:

表1　柱溫箱升溫程序

1.2.6 MS參數(shù)電子轟擊離子源:EI;離子源溫度:280 ℃;四級(jí)桿溫度:150 ℃;質(zhì)譜接口溫度:240 ℃;四級(jí)桿質(zhì)量掃描范圍:35～400 amu。采用面積歸一法對(duì)脂肪酸定量。

1.2.7數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)取平行實(shí)驗(yàn)的平均值,采用SPSS,EXCEL軟件進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與討論

2.1單甘油脂分離方法確定

以同一次提取的2號(hào)奶粉脂肪為實(shí)驗(yàn)原料,加入棕櫚酸三甘酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液,對(duì)比研究了氨基固相萃取柱分離法和薄層層析法對(duì)單甘油酯的分離效果。結(jié)果如表2,經(jīng)過(guò)氨基固相萃取柱法分離的單甘油酯衍生后進(jìn)行GC-MS分析算得回收率為91.7%～98.5%,RSD值為1.56%,經(jīng)過(guò)薄層層析法分離的單甘油酯衍生后進(jìn)行GC-MS分析得回收率為81.2%～86.7%,RSD值為3.62%。韓瑞麗等[14]利用HPLC-ELSD法分離脂肪水解產(chǎn)物中單甘油酯,衍生后進(jìn)行GC-MS分析回收率為83.3%～85.1%。表明氨基固相萃取柱法不僅操作簡(jiǎn)便,而且準(zhǔn)確度更高。

表2　SPE法和TLC法數(shù)據(jù)對(duì)比

表4　回收率及精密度實(shí)驗(yàn)(n=5)

2.2甲酯化方法確定

分別采用乙酰氯法、鹽酸-甲醇法及酯交換法對(duì)Sn-2位棕櫚酸進(jìn)行甲酯化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種方法都能將Sn-2位棕櫚酸甲酯化,如表3所示棕櫚酸峰面積和峰高基本一致,說(shuō)明棕櫚酸的酯化程度相同。但是乙酰氯-甲醇溶液配制時(shí)具有一定危險(xiǎn)性,反應(yīng)過(guò)程中易發(fā)生試管炸裂。鹽酸-甲醇法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2 h,反應(yīng)溫度高達(dá)80 ℃,容易引起多不飽和脂肪酸裂解。而酯交換法不僅反應(yīng)條件溫和,在常溫下完成酯化反應(yīng),而且操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)時(shí)間最短,僅為4 min,有利于下一步的分析。因此,選擇酯交換法作為Sn-2位棕櫚酸甲酯化方法。

表3　三種甲酯化方法比較(n=3)

2.3色譜條件選擇

在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行色譜分析,圖1為樣品脂肪酸衍生后的色譜圖,可見(jiàn)采用HP-88氣相色譜柱分析甘油三酯中脂肪酸組分,可以將所有脂肪酸色譜峰完全分離開(kāi),分流比為10∶1時(shí),脂肪酸峰型良好,無(wú)拖尾峰,基線平穩(wěn),棕櫚酸響應(yīng)值高。采用面積歸一化法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作圖,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定棕櫚酸的保留時(shí)間為29.84 min,回歸方程為y=3.39643×106+6.52896×106X,R2=0.9994,線性關(guān)系良好。

圖1　GC-MS法檢測(cè)樣品色譜圖Fig.1　GC-MS Chromatogram of sample

2.4GC-MS法回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

以同一次提取的奶粉脂肪為實(shí)驗(yàn)原料,加入3個(gè)不同水平的棕櫚酸三甘酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液,水解后經(jīng)過(guò)氨基固相萃取柱分離單甘油酯,衍生后用GC-MS分析,每個(gè)實(shí)驗(yàn)做5個(gè)平行,結(jié)果如表4所示,添加標(biāo)準(zhǔn)品的回收率范圍為91.7%～98.5%,準(zhǔn)確性高。

2.5重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

將3個(gè)不同品牌嬰兒配方乳粉送到中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心檢測(cè)Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分含量,對(duì)比本實(shí)驗(yàn)利用氨基固相萃取柱法制備單甘油酯,GC-MS法檢測(cè)Sn-2位棕櫚酸相對(duì)含量,結(jié)果如表5,中國(guó)檢科院與氨基固相萃取柱法分離單甘油酯三種方法檢測(cè)結(jié)果基本一致,方法的重現(xiàn)性良好,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確、可靠。

表5　Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分含量(%)

3　結(jié)論

本文建立了一種用氨基固相萃取柱分離水解產(chǎn)物中單甘油酯,酯交換法衍生后,用GC-MS法分析嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸的檢測(cè)方法。該方法用氨基固相萃取柱法取代薄層層析法制備純化單甘油酯,大大縮短樣品的前處理時(shí)間,操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高。選擇酯交換法衍生Sn-2位棕櫚酸,不僅酯化程度高,而且反應(yīng)條件溫和,GC-MS法檢測(cè)脂肪酸精密度高,重現(xiàn)性良好,完全適用于嬰兒配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于嬰幼兒配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸的測(cè)定,為今后更深入研究結(jié)構(gòu)脂肪在配方乳粉中的應(yīng)用,研發(fā)更母乳化的母乳替代品提供參考。

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Determination of palmitic acid in the Sn-2 position in infant formulas by GC-MS

LIN Man1,CHEN Li-jun2,DONG Xue-yan2,MIN Wei-hong1,JIANG Tie-min2,*

(1.School of Fermentation Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130000,China;2.National maternal and infant health dairy researching center of Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd.,Beijing,100163,China)

To establish a highly efficient and accurate determination of Sn-2 palmitic acid in triglycerides of infant formulas. Lipids of milk powder were extracted by the method of ISO14156. The Sn-1,3 fatty acids in the triglycerides were specially hydrolyzed by pancreatic lipase. The 2-monoglyceride was separated and prepared by solid phase extraction(SPE),and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). Results showed that the content of palmitic acid esterified at the Sn-2 position was 40.5%,40.3%,40.8%. The average spike recoveries for palmitic acid were 91.7%～98.5%,and the relative standard deviation was 1.56%. The developed method was proved to be simple,precise,accurate and reliable,thereby being suitable for the determination of Sn-2 palmitic acid in infant formulas.

infant formulas;Sn-2 palmitic acid;solid phase extraction(SPE);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

2015-12-14

林曼(1990-)，女，碩士，研究方向：乳制品檢測(cè)，E-mail：15210766546@sina.cn。

姜鐵民(1971-)，碩士，教授級(jí)高工，研究方向：乳品生物技術(shù)，E-mail：jiang515910@126.com。

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAD18B04)；北京市科技計(jì)劃(D141100004814001)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)11-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.049