史紅梅,王恒振,孫玉霞,王詠梅,周　攀

(1.山東省葡萄研究院,山東濟南 250100;2.山東省農業(yè)科學院農產品研究所,山東濟南 250100;3.煙臺張裕卡斯特酒莊有限公司,山東煙臺 264000)

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高效液相色譜法測定葡萄皮、籽中的15種單體酚

史紅梅1,王恒振2,*,孫玉霞2,王詠梅1,周攀3

(1.山東省葡萄研究院,山東濟南 250100;2.山東省農業(yè)科學院農產品研究所,山東濟南 250100;3.煙臺張裕卡斯特酒莊有限公司,山東煙臺 264000)

建立了葡萄皮、籽中15種單體酚的高效液相色譜(HPLC)分析方法,采用ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,柱溫30 ℃,流動相乙腈-甲酸水(2∶98 V/V)溶液,梯度洗脫,洗脫流速為1.0 mL/min,檢測波長280 nm。15種單體酚在一定濃度范圍內呈良好的線性關系,相關系數(shù)為0.9980～0.9999。方法檢出限0.01～0.10 mg/L,加標回收率均大于85%。本方法快速、準確、靈敏度高,可用于葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚的測定。

高效液相色譜,葡萄籽,葡萄皮,單體酚

多酚(Polyphenolics)是指分子結構中攜帶多個酚羥基的一大類植物次生代謝產物[1],主要有酚酸類(Phenolic acids)、黃酮(Flavones)、黃烷醇(Flavanols)、黃酮醇(Flavonols)、花色苷(Anthocyanins)、原花色素(Proanthocyanidins)、水解單寧(Hydrolysable tannins)等[2-6]。多酚類物質是釀酒葡萄中的一類重要物質,直接影響葡萄酒的感官品質如苦味、澀味、收斂性及風味等[7],而且具有極強的抗氧化性,具有廣泛的生理功能,如清除自由基、抗發(fā)炎、抗血栓等[8]。研究表明,葡萄果實中多酚主要分布在果皮、種子和果梗中,果肉也存在一定量的多酚物質。果皮中含有酚酸、白藜蘆醇、花色苷、黃酮醇、黃烷-3-醇等結構簡單的多酚[9-10],還含有原花色素等結構復雜的多酚,如花色苷和芳香物質[11]。種子中多酚主要是黃烷醇類多酚[12],也有大量原花色素[13],還有沒食子酸[9,12]、咖啡酸[14]等多酚類物質;果肉中的酚類物質主要是酚酸類。

近幾年國內外對葡萄酒和葡萄中的酚類物質單體酚含量的測定研究逐漸增多,如韓國民等建立了葡萄酒中14種單體酚的HPLC測定方法[15],陳建業(yè)等建立葡萄酒中11種酚酸含量的測定方法[3],王美麗等測定了葡萄中6種單體酚的含量[16]。目前還未見采用一個方法分別測定葡萄皮和葡萄籽中15種單體酚含量的研究,本次實驗通過高壓液相色譜法測定葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚的方法,測定了蓬萊產區(qū)三個主要紅色品種中葡萄皮和葡萄籽中酚類物質的含量,比較近三年葡萄中酚類物質的變化情況。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄品種為赤霞珠、品麗珠、小味兒多由蓬萊產區(qū)各大葡萄酒廠的葡萄園提供；乙腈、甲醇(均為色譜純)由美國Honeywell公司生產;甲酸為分析純;實驗用水為超純水；咖啡酸(Caffeic acid)、香豆酸(p-Coumaric acid)、阿魏酸(Ferulic acid)、沒食子酸(Gallic acid)、香草酸(Vanillic acid)、水楊酸(Salicylic acid)、堪非醇(Kaemferol)、楊梅黃酮(Myricetin)、兒茶素沒食子酸酯((-)-epicatechin gallate,ECG)、表棓兒茶素沒食子酸酯((-)-epgallocatechin gallate,EGCG)、表兒茶素((-)-epicatechin,EC),均由美國Flulca公司生產;白藜蘆醇(Resveratrol),由西安交大保賽生物技術股份有限公司生產;蘆丁(Rutin)、槲皮素(Quercetin),均由中國藥品生物制品鑒定所生產;兒茶素((+)-catechin, CAT)由上海順勃生物工程技術有限公司生產。

Agilent 1200液相色譜儀美國安捷倫公司;RE-2000A旋轉蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;SHZ-A水浴恒溫振蕩器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;ML 204/02梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;TDL-5臺式低速冷凍離心機上海安亭科學儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預處理參照B.Girard等的方法[17],稍作修改。取-20 ℃冷凍的葡萄,將皮、籽、肉分開,將皮和籽用液氮研磨,研磨后置于冰箱(-18～-20 ℃)備用。取凍干研磨后的葡萄樣品1.000 g于10倍體積的提取液(丙酮∶水∶甲酸=80∶19∶1)中。每個葡萄樣品的皮、籽各取三個平行進行提取,記錄每個平行稱取樣品的實際質量。將提取體系水浴(水浴溫度45.0±0.5 ℃)震蕩30 min后,離心(8000×g,20 min,4 ℃)取上清。將皮和籽的提取液采用旋轉蒸發(fā)儀(45.0± 1.0 ℃)蒸干,再用2 mL色譜級甲醇重溶置于5 mL棕色樣品瓶中,存放于-20 ℃避光保存待分析。測定樣品前經0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2檢驗波長的選擇用紫外分光光度計對沒食子酸、兒茶素等15種單體酚標準樣品溶液在波長200～400 nm區(qū)間內掃描。15種單體酚紫外吸收光譜圖顯示,其組分最大吸收峰均在280 nm處有最大吸收峰,故選擇280 nm為檢測波長。

1.2.3流動相條件的確定根據(jù)成宇峰[18]的研究,本實驗選取流動相A:甲酸-水(2∶98,V/V),流動相B:乙腈,設計了10個不同濃度的洗脫實驗,其中分離效果較好的兩個梯度是:I.0～5 min,B相為2%～8%;5～8 min,B相為8%～15%;8～12 min,B相為15%～25%;12～17 min,B相為25%～35%;17～30 min,B相為35%～45%;30～40 min,B相為50%～50%,液相色譜圖如圖1a;流動相II. 0～7 min,B相為5%～10%;7～10 min,B相為10%～20%;10～15 min,B相為20%～30%;15～20 min,B相為30%～40%;20～30 min,B相為40%～50%;30～40 min,B相為50%～50%,液相色譜圖如圖1b。

1.2.4色譜條件Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),紫外檢驗波長為280 nm,柱溫30 ℃,進樣量10 μL,以峰面積外標法定量。梯度洗脫:流動相A:甲酸-水(2∶98,V/V),流動相B:乙腈,流速為1.0 mL/min。洗脫程序:0～7 min,B相為5%～10%;7～10 min,B相為10%～20%;10～15 min,B相為20%～30%;15～20 min,B相為30%～40%;20～30 min,B相為40%～50%;30～40 min,B相為50%～50%。

1.2.5標準品的配制用萬分子一天平分別準確稱取咖啡酸等15個單體酚標準品1～10 mg移至10 mL的棕色容量瓶中,色譜級甲醇定容,作為混合標準母液,將此標準液稀釋成不同濃度的標準溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2　結果與分析

2.1標準曲線的制備

分別配制10～100 mg/L 5個不同質量濃度的15種單體酚混合標準溶液,進樣10 μL,按照上述確定的色譜條件進行測定,以峰面積為縱坐標、標準品濃度為橫坐標,計算得到15條標準曲線。將單體酚標準品用色譜級甲醇不斷稀釋至譜圖中信噪比為3,以此質量濃度為單體酚的最低檢測限。結果表明15種多酚物質的濃度和檢測響應值呈現(xiàn)出良好的線性關系,相關系數(shù)不小于0.9980,最低檢測限都較低,表明此方法靈敏度較高、準確度高、可行性好。結果見表1。

2.2流動相條件確定

按照1.2.3設定的條件15種標準品的色譜圖如圖1所示。

表1　15種酚類物質的回歸方程及相關參數(shù)(n=5)

圖1　采用流動相Ⅰ和Ⅱ下15種單體酚類液相色譜圖a和bFig.1　Chromatogram of 15 mono-phonels standardsunder the first and second gradient program注:1.沒食子酸,2.CAT,3.EC,4.EGCG,5.咖啡酸,6.香草酸,7.蘆丁,8.ECG,9.香豆酸,10.阿魏酸,11.楊梅黃酮,12.白藜蘆醇,13.水楊酸,14.槲皮素,15.堪非醇。

在梯度II條件下葡萄籽和葡萄皮樣品的液相色譜圖如圖2和圖3所示,從圖中可以看出兩種樣品在這一洗脫條件下15種單體酚類能夠有效的分離,可以作為測定這兩種樣品的洗脫條件。

圖2　葡萄籽樣品液相色譜圖Fig.2　Chromatogram of grape seeds

圖3　葡萄皮樣品液相色譜圖Fig.3　Chromatogram of grape skin

2.3回收率和相對標準偏差

將已知15種單體酚濃度的葡萄皮、籽樣品分別添加各標準品的混合標準溶液,按照1.2.1制備葡萄樣品(n=5)。吸取10 μL進樣,根據(jù)所測樣品中的15種單體酚的含量計算相應的精確度和回收率,結果見表2。從表2中可以看出,樣品回收率均大于85%,相對偏差也較低(在3%以內),方法精密度高,符合高壓液相色譜測定要求。

2.4葡萄樣品的測定

根據(jù)前述色譜條件,對蓬萊產區(qū)赤霞珠、小味兒多、品麗珠三個品種的葡萄樣品葡萄皮和葡萄籽中的15種單體酚含量進行測定,結果見表3、表4。

從表3可以看出,三個葡萄品種的葡萄籽中共檢測出12～15種單體酚,主要酚類是黃烷醇類,這與文獻[12]報道的相吻合。在黃烷醇類中,CAT是主要成分,其次是EC,這與溫鵬飛[2]等檢測結果也相吻合。種子中其它成分如蘆丁、阿魏酸、香草酸等含量也較高,咖啡酸、沒食子酸、槲皮素、ECG、EGCG、白藜蘆醇等也有檢出。

葡萄籽中單體酚含量與葡萄品種和年份有關[11],從檢測的三個品種中可以看出:小味兒多>赤霞珠>品麗珠,從年份來看2014>2013>2012,這與這三年的氣候條件相符合。2012年7月下旬、8月份、9月上中旬雨水較集中,陰雨天較多;2013年雨水集中在6月、7月,8、9、10月份較少;2014年和2013年類似,但10月份收獲季節(jié)下了些雨,因此果實品質是2014>2013>2012。

表2　樣品和標樣加標回收率及相對標準偏差(n=5)

注:/表示未檢測出。

表3　蓬萊產區(qū)葡萄籽中15種單體酚的含量和均值(mg/100 g(干重))(n=3)

注:/表示未檢測出。

表4　蓬萊產區(qū)葡萄皮中15種單體酚的含量和均值(mg/100 g(干重))(n=3)

紅色品種葡萄皮的主要多酚是花色苷,本方法是測定除花色苷外其它種類的酚類物質。從表4中可以看出,黃烷醇類是葡萄果皮的重要多酚之一,在這三個葡萄品種中都存在黃烷-3-醇單體及聚合體,其中EC和CAT是主要的單體,也有少量的ECG和EGCG。另外,在葡萄皮中酚酸類(咖啡酸、阿魏酸、沒食子酸、香草酸等)、白藜蘆醇、黃酮類(楊梅黃酮、蘆丁、槲皮素等)等多酚也被檢測出。從品種看,葡萄皮中單體酚含量最高的是小味兒多,其次是赤霞珠,然后是品麗珠。從年份看,三個品種都是以2014年單體酚含量最高。

3　結論與討論

本文建立一種新的同時測定葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚含量的HPLC方法。通過對流動相的選擇和優(yōu)化,在選定的液譜條件下,15種酚類物質在30 min內得到了很好地分離,且回收率均在85%以上,最低檢測限也較低。該方法簡單、實用,且準確度、靈敏度較高,重復性好。

針對3個葡萄品種連續(xù)三年對葡萄皮、葡萄籽中15種單體酚進行測定,通過比對本次實驗結果與文獻報道結果可以發(fā)現(xiàn),本次實驗數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)相吻合,進一步說明本實驗方法能夠對葡萄皮和葡萄籽中的15種酚類進行檢測。在本方法對葡萄籽中酚類物質測定時發(fā)現(xiàn),基線有點飄移,說明在前處理時有些雜質尚未被去除,在今后的工作中可以繼續(xù)探索更有效的前處理方法。另外,本次實驗只選取幾種代表性的單體酚類,不能了解其他酚類的含量,為了更全面的測定葡萄中單體酚的含量,在今后工作中可以根據(jù)多酚類別有分步測定。

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Determination of 15 mono-phenols in grape skin and seeds by high performance liquid chromatography

SHI Hong-mei1,WANG Heng-zhen2,*,SUN Yu-xia2,WANG Yong-mei1,ZHOU Pan3

(1.Shandong Academy of Grape,Ji’nan 250100,China;2.Institute of Agro-food Science and Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences(SAAS),Ji’nan 250100,China;3. Chateau changyu castel co.,LTD.Yantai,Yantai 264000,China)

A high performance liquid chromatograohic(HPLC)method was established for the determination of 15 mono-phenols in grape skin and grape seeds. The ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)was used as chromatographic column with column temperature of 30 ℃. Acetonitrile and formic acid aqueous solution was used as the mobile phase by gradient elution with a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 280 nm. A good linearity was obtained for 15 mono-phenols in the range of 0.01～0.10 mg/L. The correlation coefficients were in range of 0.9980～0.9999. The recoveries of standard samples were in the range of 93.25%～109.12%. The method was rapid,simple and high senstivity and was suitable for the determination of 15 mono-phenols in grape skin and grape seeds.

HPLC;grape seeds;grape skin;mono-phenols

2015-11-16

史紅梅(1979-)，女，碩士，高級工程師，研究方向：葡萄酒釀造新工藝及風味物質的分析測定,E-mail:hm.sh@163.com。

王恒振(1978-)，男，碩士，農藝師，研究方向：葡萄栽培技術及風土條件和微域環(huán)境對葡萄品質的影響,E-mail:chinajinan@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2016)11-0318-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.057