楊京霞,李　靜,吳　婷,張自備,石亞男,黃銀生

(1.阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽阜陽(yáng) 236037;2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽阜陽(yáng) 236037;3.阜陽(yáng)師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，安徽阜陽(yáng) 236037)

?

太和香椿水提物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生物學(xué)特征的影響及清除自由基作用的研究

楊京霞1,2,李靜1,吳婷1,張自備1,石亞男1,黃銀生3,*

(1.阜陽(yáng)師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽阜陽(yáng) 236037;2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽阜陽(yáng) 236037;3.阜陽(yáng)師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，安徽阜陽(yáng) 236037)

目的:探討太和香椿水提物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生物學(xué)特征的影響,并研究水提物清除線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)自由基的作用。方法:用太和香椿水提物配制三種不同濃度的NGM培養(yǎng)基,檢測(cè)每組線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng),壽命,體內(nèi)氧自由基含量以及一分鐘活動(dòng)次數(shù),分析太和香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)生物學(xué)特征及抗氧化作用的影響。結(jié)果:濃度為0.5 mg/mL香椿水提物的實(shí)驗(yàn)組中線(xiàn)蟲(chóng)的平均體長(zhǎng)、壽命、一分鐘活動(dòng)次數(shù)和體內(nèi)氧自由基的含量與空白對(duì)照組相比,差異均極顯著(p<0.01);表明該濃度下太和香椿水提物能夠促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng),并具有明顯的清除自由基作用。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng),太和香椿水提物,延緩衰老

香椿是一種古老的菜用樹(shù)種,除了可食用外,它還具有清熱解毒、健胃理氣、潤(rùn)膚明目等功效[1-2]。近代中醫(yī)多以樹(shù)皮、根皮入藥,具有驅(qū)風(fēng)祛濕、收斂止血、抗菌止痛等功效[3],多用于治療肺咳、便血、菌痢、腸炎、崩漏等癥。近年來(lái)人們對(duì)香椿藥學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究,使得香椿的藥用及保健價(jià)值越來(lái)越被人們所認(rèn)識(shí),促進(jìn)了香椿資源的更深層次的開(kāi)發(fā)。安徽省太和縣栽種香椿的歷史悠久,且品質(zhì)較高,唐代時(shí)曾用此物作為貢品,清朝時(shí)被御封為“貢椿”[4]。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生命周期較短為2～3周,是國(guó)際上研究衰老相關(guān)實(shí)驗(yàn)的典型模式生物[5-6]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的對(duì)太和香椿藥用價(jià)值的研究較少,而關(guān)于香椿藥用活性成分的研究主要集中在香椿總黃酮物質(zhì)、酚類(lèi)物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)上,對(duì)香椿水提物中的具體成分目前并未有研究。本實(shí)驗(yàn)以太和香椿為材料,研究其水提物對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)、一分鐘活動(dòng)次數(shù)、體內(nèi)氧自由基含量和壽命等指標(biāo),考察太和香椿在延緩衰老方面的作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

N2野生型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)及大腸桿菌OP50中科院等離子體物理研究所吳李君研究員惠贈(zèng);太和香椿安徽省太和縣;5-Fu尿嘧啶，DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)美國(guó)Sigma公司;M9緩沖液(1 L水中加入3 g KH2PO4,6 g Na2HPO4,5 g NaCl和1 mL 1 mol/L的MgSO4);PBS緩沖液ThermoFisher公司;NaN3上海誠(chéng)稟生物科技有限公司。

DM1000倒置熒光顯微鏡德國(guó)徠卡;RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;HVE-50高壓滅菌鍋日本Hirayama公司;ZSD-A1270生化培養(yǎng)箱上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1太和香椿水提物的制備將購(gòu)買(mǎi)的太和香椿曬干后粉碎,準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒重的粉末5.0000 g,加去離子水400 mL,60 ℃水浴加熱1 h,取濾液。濾渣加水后再提取一次,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,最后定容至50 mL,得0.1 g/mL的香椿水提物,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2NGM(Nematode Growth Medium,線(xiàn)蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的配制線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)使用標(biāo)準(zhǔn)的NGM培養(yǎng)基,具體的配制方法參照文獻(xiàn)[7],三個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別用移液槍加入0.1、1、10 mL上述香椿水提物,121 ℃滅菌30 min,得到分別含有0.05、0.5、5 mg/mL不同濃度香椿水提物的實(shí)驗(yàn)組NGM培養(yǎng)基200 mL。

1.2.3線(xiàn)蟲(chóng)同步化用200 μL的M9緩沖液沖洗線(xiàn)蟲(chóng),3000 r/min,離心1 min,去上清,然后加入裂解液1 mL于EP管中,靜置10 min后,5000 r/min,離心1 min,最后用M9緩沖液沖洗3次,3000 r/min,離心1 min后,取下層,置于25 ℃下孵化12 h得L1幼蟲(chóng),將L1幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到已培養(yǎng)好OP50的實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組的NGM培養(yǎng)基中;25 ℃培養(yǎng)30 h,得L4期成蟲(chóng)[8]。

1.2.4線(xiàn)蟲(chóng)壽命的測(cè)定挑選L4期的線(xiàn)蟲(chóng)15只[9],轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)組NGM培養(yǎng)基中,各培養(yǎng)基中均加入12.5 mg/L 5-Fu尿嘧啶以抑制子代線(xiàn)蟲(chóng)孵育[10]。每天記錄線(xiàn)蟲(chóng)生存狀況和存活個(gè)數(shù),轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為壽命實(shí)驗(yàn)第0 d,全部線(xiàn)蟲(chóng)死亡則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.5線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)的測(cè)定在線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)到L4期后的第2 d,從每組中隨機(jī)挑取5只線(xiàn)蟲(chóng),經(jīng)NaN3麻醉后放在顯微鏡下拍照,對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。

1.2.6線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基含量的測(cè)定在線(xiàn)蟲(chóng)長(zhǎng)到L4期后的第2 d,每組挑取5只線(xiàn)蟲(chóng)用熒光試劑盒染色[11-13](DCFH-DA),在倒置熒光顯微鏡下拍照,并用ipp圖像分析軟件分析照片中線(xiàn)蟲(chóng)熒光光密度,熒光光密度越強(qiáng)說(shuō)明其體內(nèi)氧自由基含量越多。

1.2.7線(xiàn)蟲(chóng)一分鐘活動(dòng)次數(shù)的測(cè)定每組分別隨機(jī)挑取15只線(xiàn)蟲(chóng)置于含過(guò)量M9的培養(yǎng)皿中,在顯微鏡下觀察并記錄其每分鐘活動(dòng)次數(shù)。

1.2.8數(shù)據(jù)處理分析將不同濃度條件下得到的各組數(shù)據(jù)即線(xiàn)蟲(chóng)壽命、體長(zhǎng)、線(xiàn)蟲(chóng)一分鐘活動(dòng)次數(shù)和線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)熒光光密度等數(shù)據(jù)進(jìn)行X檢驗(yàn),計(jì)算結(jié)果由p值來(lái)表示顯著性差異,如果p值小于0.05表示差異顯著,p值小于0.01表示差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度太和香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響

從表1中可以看出,香椿水提物可以延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)的壽命,但并不與濃度呈正相關(guān),當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí),與其他三組差異極顯著p<0.001,線(xiàn)蟲(chóng)平均壽命最長(zhǎng)為(8.06±1.01)d,平均壽命指每組中各線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)際壽命的平均值[14],說(shuō)明該濃度的太和香椿水提物可以顯著的延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命,對(duì)于研究衰老具有積極意義。

表1　不同濃度香椿水提液對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的影響

表2　不同濃度香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)(μm)的影響

2.2不同濃度太和香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)的影響結(jié)果

從圖1、表2中可以看出,0.05 mg/mL組和5 mg/mL組對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)的增長(zhǎng)效果并不明顯,而0.5 mg/mL組效果極顯著(p<0.01)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出,濃度過(guò)低或者過(guò)高對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)促進(jìn)作用并不明顯,原因可能是濃度低時(shí)不能有效的促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng),濃度高時(shí)可能抑制了線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng),只有濃度適中時(shí)才能顯著促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng),使線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)明顯增加。

圖1　不同濃度香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體長(zhǎng)的影響Fig.1　Effect of different concentrations of Cedar aqueous extract on the body length of nematodes

2.3不同濃度太和香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基的影響

氧自由基具有強(qiáng)氧化性,可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞,進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。DCFH-DA(2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽)是非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針[15-16],DCFH-DA本身沒(méi)有熒光,可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞后,可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH可以迅速被自由基氧化成為具高熒光的物質(zhì)—DCF。其氧化過(guò)程生成的DCF量與自由基的含量成正比,通過(guò)圖像分析軟件可以分析出檢測(cè)DCF的熒光光密度以判定細(xì)胞內(nèi)氧自由基的水平。圖2為線(xiàn)蟲(chóng)光密度的熒光染色照片。

對(duì)四組線(xiàn)蟲(chóng)平均熒光光密度進(jìn)行分析顯示,0.5 mg/mL組與其他三組差異極顯著(p<0.01),0.05 mg/mL組與0.5 mg/mL組差異顯著(p<0.05)。通過(guò)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)熒光光密度的分析,熒光光密度越低,氧自由基含量越低,可見(jiàn)太和香椿水提物可以清除線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)氧自由基的含量。關(guān)于衰老的自由基學(xué)說(shuō)早已被廣大研究學(xué)者接受和認(rèn)同,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明0.5 mg/mL香椿水提物的熒光光密度與空白組相比具有顯著的清除自由基的功能,而早在1955年,Dr. Harman發(fā)表的 “衰老的自由基理論”就提出,體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多自由基是引起衰老的重要因素[17],這一理論也得到科研工作者的廣泛認(rèn)同。本實(shí)驗(yàn)中香椿水提物能夠有效的清除線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的氧自由基,因此香椿水提物是一種很好的抗氧化劑,在延緩衰老方面有著積極的作用。

表3　不同濃度香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)熒光光密度的影響

圖2　不同濃度香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)熒光光密度的影響Fig.2　Effect of different concentrations of Cedar aqueous extract on the fluorescence optical density of nematodes

2.4不同濃度太和香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)一分鐘活動(dòng)次數(shù)的影響

對(duì)四組線(xiàn)蟲(chóng)每分鐘平均活動(dòng)次數(shù)進(jìn)行分析得到0.5 mg/mL組與其他三組差異極顯著(p<0.01)。說(shuō)明0.5 mg/mL的太和香椿水提物可以增強(qiáng)線(xiàn)蟲(chóng)的活動(dòng)能力,明顯促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)的每分鐘活動(dòng)次數(shù),對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng)有積極作用。

表4　不同濃度香椿水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)活動(dòng)次數(shù)(次/min)的影響

3　結(jié)論與討論

本文中關(guān)于香椿水提物的濃度參考查閱了相關(guān)文獻(xiàn),文獻(xiàn)對(duì)于香椿提取物的研究濃度多集中在0.01～10 mg/mL的范圍內(nèi)。臺(tái)灣學(xué)者對(duì)香椿萃取物進(jìn)行研究,體外實(shí)驗(yàn)顯示,香椿葉、樹(shù)皮和根皮的萃取物在濃度為0.625 mg/mL時(shí)香椿清除DPPH自由基能力達(dá)80%[18]。故本實(shí)驗(yàn)研究的低中高三個(gè)濃度定為0.05、0.5和5 mg/mL,通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究表明,濃度過(guò)低或者過(guò)高都不適于線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng),當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)各個(gè)生物學(xué)特征的指標(biāo)最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示太和香椿水提物可以促進(jìn)線(xiàn)蟲(chóng)的生長(zhǎng),在抗氧化和延緩衰老方面有著積極作用。但對(duì)于水提物的具體成分還有待于進(jìn)一步分析研究。

[1]劉忠良.香椿的研究概況[J].基層中藥雜志,2001,16(4):57-58.

[2]郝繼偉.淺談香椿的資源價(jià)值與利用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2003(5):102-103.

[3]陳鐵山,羅忠萍,崔宏安,等.香椿化學(xué)成分的初步研究[J].陜西林業(yè)科學(xué),2000,(2):1-2,22.

[5]蔡外嬌,張新民,黃建華,等.淫羊藿總黃酮延緩秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)衰老的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,28,(6):522-523.

[6]秦峰松,楊崇林.小線(xiàn)蟲(chóng),大發(fā)現(xiàn):Caenorhabditis elegans在生命科學(xué)研究中的重要貢獻(xiàn)[J].生命科學(xué),2006;18(5):419-424.

[4]楊京霞,楊陽(yáng),李文雍,等.高效液相色譜法測(cè)定太和香椿中槲皮素的含量,藥物生物技術(shù),2010,17(6):513-515.

[7]Stiernagle T.Maintenance of C.elegans[M].Oxford University Press,2006:1-11.

[8]Wen SH,Zhang T,Tan T W.Utilization of am ino acids to enhance glutathione production in Saccharom yces cerevisiae[J].Enzyme MicroTech,2004,31(1):122-126.

[9]陳詠竹.孫啟玲.γ-多聚谷氨酸的性質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào),2004,31(1):122-126.

[10]王香婷,朱曉紅,魏民,等.補(bǔ)氣活血方藥對(duì)衰老性急性肺損傷大鼠SOD及MDA的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2009(06):434-436.

[11]于文濤,張一昕,吳中秋,等.補(bǔ)腎活血方對(duì)血管性癡呆小鼠行為學(xué)及腦海馬自由基代謝的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2009(12):1478-1479.

[12]楊靜,雷燕,崔巍,等.人參三七川芎提取物延緩內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)制性衰老的機(jī)制研究[J].中國(guó)中藥雜志,2009(12):1545-1547.

[13]Harman D. Aging:a theory based on free radical and radical and radiation chemistry[J].J Gerontol,1956,11:298-300.

[14]許湘,許巧,郭嵐,等.六味地黃丸對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)壽命及daf-2mRNA、daf-16mRNA表達(dá)的影響[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2015,17(1):73-75.

[15]M. Kobayashi.Invivoantioxidant role of astaxanthin underoxidative stress in the green alga Haematococcus pluvialis.Appl[J]. Microbiol Biotechnol,2000,54:550-555.

[16]Smith J A,W eidemann M J. Further characterization oftheneutroph il oxidative burst by flow cytometry[J].Immunol Methods,1993,162:261-268.

[17]趙保路.自由基、營(yíng)養(yǎng)、天然抗氧化劑與衰老[J].生物物理學(xué)報(bào),2010,26(1):26-36.

[18]臺(tái)灣香椿研究團(tuán)隊(duì),臺(tái)灣香椿同好.繼往開(kāi)來(lái)-臺(tái)灣之椿[M].香椿鄉(xiāng)村研發(fā)俱樂(lè)部,2014,139-144.

Effects of Taihe Cedar aqueous extract onC.Elegansbigoloical characteristics and scavenging free radicals

YANG Jing-xia1,2,LI Jing1,WU Ting1,ZHANG Zi-bei1,SHI Ya-nan1,HUANG Yin-sheng3,*

(1.College of biological and food engineering,Fuyang normal college，F(xiàn)uyang 236037,China;2.Anti-aging Chinese herbal medicine in anhui province engineering technology research center，F(xiàn)uyang 236037,China;3.College of physics and electronic engineering,Fuyang Normal College，F(xiàn)uyang 236037,China)

Objective:To study the influence of Taihe Cedar aqueous extract on Caenorhabditis elegans(C.Elegans)biological characteristics and the scavenging free radicals ability in the body of the water extract clear nematodes. Methods:The length,life span,activity and content of oxygen free radicals of nematodes which cutlured by NGM culture medium with three different concentration of the Taihe cedar aqueous extract were measured to investigated the effect of Taihe Cedar aqueous extract on the biological characteristics and the antioxidant ability of nematodes.Results:Compared with control,significant differences were observed on the average length,longevity,activity times per minute and the content of oxygen free radicals of nematodes cultured with concentration of 0.5 mg/mL cedar aqueous extract(p<0.01).The experimental results showed that the concentration of Taihe Cedar water extract could promote the growth ofC.Elegans,and possess obvious effect of scavenging free radicals.

C.Elegans;Cedar aqueous extract;anti-aging

2015-07-13

楊京霞(1982-),女,碩士,講師,主要從事中草藥成分及活性研究,E-mai:yangjingxia1228@126.com。

黃銀生(1978-),男,碩士,講師,主要從事計(jì)算物理和生物物理學(xué),E-mai:81313140@qq.com。

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2016A872);安徽省教育廳自然科學(xué)一般項(xiàng)目(2014KJ009);安徽高校科研平臺(tái)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目;安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(AH201310371051,201510371059,20151062,20151068);阜陽(yáng)師范學(xué)院校級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2013FSKJ17)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)11-0328-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.059