劉　帥,曹立民,林　洪,隋建新

(中國海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266003)

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胰脂肪酶特異性卵黃抗體對胰脂肪酶活性的抑制作用研究

劉帥,曹立民,林洪,隋建新*

(中國海洋大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266003)

肥胖對人類的健康構(gòu)成了極大的危害,胰脂肪酶抑制劑由于可以有效地預(yù)防和治療肥胖而受到了人們的廣泛關(guān)注。本研究首次以胰脂肪酶為抗原制備了胰脂肪酶特異性卵黃抗體(L-IgY),并分析了其對胰脂肪酶活性的抑制效果。結(jié)果表明,L-IgY可通過與胰脂肪酶的非競爭性結(jié)合發(fā)揮顯著的酶活抑制作用(p<0.05),計(jì)算得出其表觀半抑制濃度(IC50)為168.62 μg/mL。模擬胃液消化環(huán)境中10 min,L-IgY的活性幾乎完全喪失,但是在模擬腸液中2 h,L-IgY的免疫活性僅下降了約20%,表明其有望作為一種潛在的胰脂肪酶抑制劑應(yīng)用于肥胖的預(yù)防和治療。

卵黃抗體,胰脂肪酶,抑制,肥胖

肥胖會引發(fā)很多病理性疾病,嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。由于攝入多余脂肪會導(dǎo)致肥胖,因此抑制脂肪的消化吸收可有效阻止肥胖發(fā)生[3]。

胰脂肪酶(PL,EC 3.1.1.3)可水解50%～70%的膳食脂肪,是參與脂肪消化吸收的關(guān)鍵酶[4]。大量的PL抑制劑已被研究報(bào)道用以減少脂肪的消化吸收,大致可以分為三類:化學(xué)合成物質(zhì)、微生物代謝產(chǎn)物和天然產(chǎn)物提取物[5-6]。一些化學(xué)合成的物質(zhì)和微生物代謝產(chǎn)物,如奧利司他,已經(jīng)表現(xiàn)出良好的胰脂肪酶抑制效果并作為藥物上市生產(chǎn)。但是,近來文獻(xiàn)報(bào)道指出服用奧利司他會產(chǎn)生很大的副作用甚至造成肝臟損傷[7]。因此,天然PL抑制劑因其良好的安全性而得到極大關(guān)注,很多皂苷類、多酚類和萜烯類天然產(chǎn)物用于治療肥胖已有報(bào)道,但是這些天然產(chǎn)物抑制活性相對較低,阻礙了其進(jìn)一步成為功能性食品或藥物[8-9]。

目前,卵黃抗體(IgY)因其與抗原物質(zhì)結(jié)合后會有效抑制抗原物質(zhì)的活性,因此在醫(yī)藥和食品行業(yè)受到廣泛關(guān)注。作為從雞蛋中提取出來的天然無毒物質(zhì),IgY已被美國食品藥品管理局列為“一般公認(rèn)安全物質(zhì)”范疇[10-11]。此外,IgY的諸多優(yōu)點(diǎn)都通過大量的研究得到了驗(yàn)證,如特異性和高抑制活性[12-16],良好的溫度和pH穩(wěn)定性[17],不違反動物福利,易于提取[18],產(chǎn)量高[16],制備程序簡單成本低[19]。近年來,IgY已被廣泛用于多種感染性疾病的預(yù)防和治療[20-21]。也有相關(guān)研究表明,酪氨酸酶特異性IgY能使酪氨酸酶的活性顯著降低,可作為一種潛在的新型生物保鮮劑應(yīng)用于食品領(lǐng)域[22-23]。

然而關(guān)于IgY對人體消化酶活性的抑制作用的研究尚屬空白,本研究首次以胰脂肪酶為抗原免疫蛋雞,從蛋黃中制備分離了胰脂肪酶的特異性IgY,并對其抑制脂肪酶活性的效果和影響因素進(jìn)行初步分析,以期為下一步動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證肥胖抑制效果,開發(fā)相應(yīng)的功能性藥物提供前期工作基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

胰脂肪酶VI-S型、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑Sigma公司;胰脂肪酶II型、牛血清白蛋白(BSA)北京索萊寶公司;輔脂酶(7000 U/mg)Roche公司;奧利司他重慶華森制藥有限公司;萊亨蛋雞青島市城陽區(qū)萬盛源養(yǎng)殖場。

Z36HK高速冷凍離心機(jī)德國Hermal公司;Multiskan MK3酶標(biāo)儀Thermo Labsystems;Starter3100 pH計(jì)奧豪斯儀器(上海)有限公司;HH-1恒溫水浴鍋國華電器有限公司。

1.2卵黃抗體的制備

動物實(shí)驗(yàn)的各個操作步驟嚴(yán)格按照中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的指導(dǎo)規(guī)范進(jìn)行。將12只蛋雞隨機(jī)平均分成兩組,實(shí)驗(yàn)組取0.2 mg/mL胰脂肪酶和弗氏完全佐劑以體積比1∶1混合后充分乳化,在雞的胸前皮下散點(diǎn)注射(1 mL/只)。然后分別在第3、5、7、10周更換為弗氏不完全佐劑進(jìn)行強(qiáng)化免疫?？瞻捉M注射相同劑量的生理鹽水作為陰性對照。從第3周起,收集蛋雞所產(chǎn)雞蛋,以每周為一個計(jì)量周期,進(jìn)行特異性卵黃抗體的分離提取。

特異性卵黃抗體的分離提取參照黨昕的方法[23]進(jìn)行:以水稀釋法對蛋黃進(jìn)行預(yù)分離,硫酸銨兩步沉淀法提取特異性卵黃抗體,凍干后儲存于4 ℃?zhèn)溆谩Ｌ崛〉玫降膶?shí)驗(yàn)組IgY和陰性對照組IgY分別記作L-IgY和N-IgY。

1.3蛋白含量和純度測定

以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,用考馬斯亮藍(lán)染色法測定IgY的蛋白質(zhì)含量[24]。SDS-PAGE凝膠電泳鑒定抗體純度[24]。

1.4胰脂肪酶活力的測定

通過測定游離脂肪酸從乳液釋放的量計(jì)算胰脂肪酶活力,測定方法在前人的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)[25]。

反應(yīng)緩沖液(pH8.0):25 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,5 mmol/L CaCl2,4 mmol/L豬膽鹽。

胰脂肪酶溶液:胰脂肪酶溶于反應(yīng)緩沖液中至終濃度為1 mg/mL,5000 r/min離心5 min,收集上清液后用反應(yīng)緩沖液稀釋至0.2 mg/mL。

輔脂肪酶溶液:輔脂肪酶溶于反應(yīng)緩沖液中至終濃度為20 μg/mL。

底物溶液:含1%三油酸甘油酯的95%乙醇溶液用反應(yīng)緩沖液稀釋(v/v,1∶4.25)。

反應(yīng)過程:將50 μL胰脂肪酶溶液、50 μL的輔脂酶溶液和50 μL的反應(yīng)緩沖液加入到96孔板中,37 ℃孵育30 min后,加入50 μL三油酸甘油酯溶液,365 nm處測其吸光度值變化。

胰脂肪酶活力單位定義為:在37 ℃,pH為8.0條件下,胰脂肪酶每分鐘水解三油酸甘油脂生成1 μmol游離脂肪酸(FFA)所需的酶量為1個活力單位(1 U=1 μmol FFA/min)。

1.5胰脂肪酶活性抑制率的測定

L-IgY用反應(yīng)緩沖液溶解至終濃度為2.5 mg/mL,將50 μL的胰脂肪酶溶液、50 μL的輔脂酶溶液和50 μL L-IgY的溶液加入到96孔板中,如前述操作測定胰脂肪酶的活力。陰性對照采用同樣的方法測定,用相同濃度的N-IgY替換L-IgY。抑制率計(jì)算公式如下:

抑制率(%)=空白組酶活力-實(shí)驗(yàn)組酶活力/空白組酶活力×100

雙倒數(shù)作圖法分析L-IgY對胰脂肪酶的抑制類型,不同濃度的L-IgY(0、0.5、1 mg/mL)在不同三油酸甘油酯濃度下(1.129、2.259、4.518、6.776、9.035 mmol/L測定胰脂肪酶活性,以酶反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖[27]。

1.6L-IgY穩(wěn)定性的測定

將L-IgY溶解至5 mg/mL(以L-IgY提取物蛋白含量計(jì))分別于30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴中孵育30 min以測定其熱穩(wěn)定性[24]。各孵育溶液冷卻至室溫后,分別測定其對胰脂肪酶的抑制率。

將L-IgY分別用pH1～14的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解至5 mg/mL(蛋白含量),于4 ℃孵育60 min,測定其pH穩(wěn)定性[24]。將各溶液pH調(diào)至中性并稀釋至1 mg/mL測其抑制率。

對于胃蛋白酶穩(wěn)定性的測定,將L-IgY溶解在模擬胃液(SGF)中至終濃度為5 mg/mL,于37 ℃進(jìn)行酶解[28]。分別在酶解的第1、2、5、10、15、30、60、90、120 min時各取出1 mL溶液加入0.5 mL 0.1 mol/L碳酸鈉緩沖液(pH9.6)以使胃蛋白酶失活,分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析和抑制率測定[24]。

對于胰蛋白酶穩(wěn)定性的測定,將L-IgY溶解在模擬腸液(SIF)中至終濃度為5 mg/mL,于37 ℃進(jìn)行反應(yīng)[29]。分別在反應(yīng)的第1、2、5、10、15、30、60、90、120 min時取出1 mL溶液置于冰盒中5 min以使胰蛋白酶失活,分別測其抑制率和SDS-PAGE電泳分析[24]。

2　結(jié)果

2.1特異性IgY的制備及性質(zhì)

首次免疫后第八周的蛋黃提取物對胰脂肪酶活性顯示出顯著的抑制效應(yīng),表明免疫蛋雞成功產(chǎn)生了胰脂肪酶特異性IgY。隨著免疫時間的增加,L-IgY的抑制活性不斷增強(qiáng),并在第13周達(dá)到最大(約95%)且持續(xù)保持穩(wěn)定至第16周(圖1);而陰性對照組IgY(N-IgY)也表現(xiàn)出對較低的胰脂肪酶的抑制活性(小于8%),其原因可能是提取的蛋白質(zhì)組分中的一些非特異性成分干擾了酶與底物之間的相互作用,如空間位阻和電子特性的變化等。

圖1　免疫周期內(nèi)的抑制率Fig.1　Inhibition rate during immunisation period

考馬斯亮藍(lán)染色法測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=5.7971x+0.4309,相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖2),所得的特異性IgY純度較高,除在66.2 ku和25.0 ku左右處分別出現(xiàn)抗體的重鏈和輕鏈外,僅在35.0 ku左右處出現(xiàn)一條未知的蛋白條帶。在本研究中,此未知條帶并未對胰脂肪酶特異性IgY的活性評價產(chǎn)生顯著影響,這與前人的研究一致[30]。

圖2　L-IgY的SDS-PAGE電泳圖Fig.2　SDS-PAGE patterns of L-IgY purified from egg yolk注:1:marker;2:N-IgY;3:L-IgY。

2.2L-IgY對胰脂肪酶的體外抑制率

L-IgY對胰脂肪酶活性的體外抑制效應(yīng)顯示,L-IgY抗體的抑制率表現(xiàn)為濃度依賴性,抑制率隨濃度增大而升高,并在1 mg/mL濃度下顯示出最大抑制率(92.5%±0.5%)(圖3),計(jì)算得其IC50為168.62 μg/mL。而陽性對照奧利司他在5 μg/mL的濃度下抑制率達(dá)到102.6%±3.2%,其IC50計(jì)算得0.41 μg/mL(圖4)。

圖3　不同濃度下L-IgY和N-IgY的抑制率Fig.3　Inhibition activity of L-IgYand N-IgY at different concentrations

圖4　Orlistat的劑量反應(yīng)曲線Fig.4　Dose-response curves of orlistat

為進(jìn)一步探究L-IgY對胰脂肪酶活性的抑制類型,測定了在不同濃度底物溶液中不同L-IgY濃度的抑制率,并且用雙倒數(shù)法作圖。如圖5所示,隨著L-IgY濃度的升高,胰脂肪酶的反應(yīng)速率Vmax值下降,但Km值保持不變,這與非競爭性抑制作用的特點(diǎn)相符,說明L-IgY是胰脂肪酶的非競爭性抑制劑[31]。

圖5　L-IgY的Lineweaver-Burk圖Fig.5　Lineweaver-Burk plot of the reaction of lipase in the presence of L-IgY

2.3L-IgY的溫度、pH、胃蛋白酶、胰蛋白酶穩(wěn)定性

如圖6所示,L-IgY對胰脂肪酶活性在30～60 ℃的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定,但是當(dāng)溫度升高至70 ℃以上時活性喪失了約80%以上。L-IgY在pH4～12的范圍內(nèi)也有良好的穩(wěn)定性;但當(dāng)pH低于4或高于12時,活性急劇下降(圖6)。這些結(jié)果表明L-IgY具有良好的溫度和酸堿穩(wěn)定性,可以適應(yīng)人體腸道內(nèi)的溫度和pH[11,17,24]。

圖6　不同溫度條件下L-IgY對胰脂肪酶抑制作用的影響Fig.6　Effect of temperature on the inhibition ability of L-IgY against pancreatic lipase

圖7　不同pH條件下L-IgY對胰脂肪酶抑制作用的影響Fig.7　Effect of pH on the inhibition ability of L-IgY against pancreatic lipase

為了探究L-IgY經(jīng)口服方式進(jìn)入人體腸道發(fā)揮功能的可能性,對L-IgY在模擬胃腸條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。在模擬胃液中37 ℃孵育后,其活性隨著孵育時間增加迅速降低,2 min內(nèi)活性喪失約80%,10 min后幾乎完全喪失(圖8)。SDS-PAGE電泳圖顯示其重鏈和輕鏈在反應(yīng)2 min后逐漸降解成小片段(圖9),這與其活性迅速降低的結(jié)果相符,說明其在模擬胃液環(huán)境下的穩(wěn)定性差,極易被胃蛋白酶水解。不過,在模擬腸道條件下結(jié)果是完全不同的:37 ℃溫育2 h后L-IgY的重鏈和輕鏈均保持較為完好,只有部分水解(圖10),抑制活性也只是在前20 min內(nèi)略有下降(約20%),此后基本保持不變(圖11)。

圖8　L-IgY在模擬胃液中反應(yīng)不同時間的抑制率Fig.8　Inhibition rate of L-IgY treated in simulated gastric fluid for different time

圖9　L-IgY在模擬胃液中反應(yīng)不同時間的SDS-PAGE電泳圖Fig.9　SDS-PAGE patterns of L-IgY treated in simulated gastric fluid for different time注:1:marker;2～11:反應(yīng)時間1,2,5,10,15,30,60,90,120 min,圖10同。

圖10　L-IgY在模擬腸液中>反應(yīng)不同時間的SDS-PAGE電泳圖Fig.10　SDS-PAGE patterns of L-IgY treated in simulated intestinal fluid for different time

圖11　L-IgY在模擬腸液中反應(yīng)不同時間的抑制率Fig.11　Inhibition rate of L-IgY treated in simulated intestinal fluid for different time

3　討論

對比L-IgY和其他天然產(chǎn)物對胰脂肪酶的抑制率可以發(fā)現(xiàn),L-IgY的IC50(168.62 μg/mL)比其他的植物來源天然產(chǎn)物胰脂肪酶抑制劑低很多,如從荷葉中提取的多酚類物質(zhì)的IC50值為460 μg/mL[32],從無梗五加中提取的皂苷類物質(zhì)的IC50值的為750 μg/mL[33],從獼猴桃中提取的萜烯類化合物的IC50值為614 μg/mL[34]。值得注意的是,硫酸銨沉淀法提取的特異性IgY僅為全部提取物的25%,在這25%的特異性IgY中又僅有20%為L-IgY[11,35-36]。照此計(jì)算,L-IgY對胰脂肪酶的實(shí)際IC50值約為8.43 μg/mL;雖然這樣的抑制活性仍比奧利司他的IC50值(0.41 μg/mL)高很多,但比目前報(bào)道的一些天然產(chǎn)物提取物具有顯著優(yōu)勢,也表明其具備成為一種新型安全的抗肥胖功能因子的潛力。

L-IgY對胰脂肪酶的抑制類型為非競爭性抑制,表明L-IgY不會結(jié)合至胰脂肪酶的活性位點(diǎn)組氨酸-263,天冬氨酸-176和絲氨酸-152三元組[37],而是與酶-底物復(fù)合物結(jié)合形成酶-底物-抑制劑三元復(fù)合物(ESI)。因此與一些天然產(chǎn)物的競爭性抑制類型不同,L-IgY的抑制作用不會隨底物的增加而降低和消除,這為L-IgY成為胰脂肪酶抑制劑加以有效利用提供了有利的理論依據(jù)。

L-IgY在的胃腸道條件下保持穩(wěn)定是其通過口服方式在體內(nèi)發(fā)揮實(shí)際功能的關(guān)鍵點(diǎn)。雖然胃液構(gòu)成了L-IgY發(fā)揮作用的屏障,但是,腸道條件對L-IgY的結(jié)構(gòu)和活性的影響不大,可以保持很好的活性。為了有效地防止L-IgY在胃液中的降解,保證其在腸道內(nèi)正常發(fā)揮作用,可以使用膠囊、微膠囊、多重乳液、脂質(zhì)體包埋等技術(shù)手段加以解決[38],我們將在下一步研究中進(jìn)行探討。

4　結(jié)論

本研究首次從蛋黃中分離提取了針對胰脂肪酶的特異性L-IgY,并對L-IgY對胰脂肪酶活性的抑制效果進(jìn)行了系統(tǒng)研究,結(jié)果表明特異性L-IgY是胰脂肪酶的一種非競爭性抑制劑,表觀IC50值為168.62 μg/mL,實(shí)際IC50值為8.43 μg/mL,對酶活的抑制效果顯著高于許多從植物中提取的天然產(chǎn)物。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示L-IgY具有良好的溫度和pH穩(wěn)定性,在模擬胃液環(huán)境中會因降解而喪失活性,但在模擬腸液條件下顯示出良好的穩(wěn)定性。這些結(jié)果表明,只要通過有效的屏障保護(hù)避免L-IgY在胃液中的降解,L-IgY可有望作為一種新型、天然、安全的脂肪酶抑制劑,用于肥胖癥的預(yù)防和治療。

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Inhibitory effect of the specific chicken egg yolk antibody on pancreatic lipaseinvitro

LIU Shuai,CAO Li-min,LIN Hong,SUI Jian-xin*

(Food Safety Laboratory,Ocean University of China,Qingdao 266003,China,)

Obesity is one of the most serious risks for human health,and the development of pancreatic lipase inhibitors is attracting increasing attention as a useful approach for the prevention and treatment of obesity. Egg yolk antibody(L-IgY)against pancreatic lipase was raised by the immunization of chicken successfully for the first time. Results showed that the specific IgY was a non-competitive pattern inhibitor with the IC50value calculated as 168.62 μg/mL. The IgY would be degraded in the gastric digestion in 10 min,but was stable in simulated intestinal conditions activity decreased about 20% in 2 h,which suggested the IgY was a safe,novel and promising candidate for the prevention and treatment of obesity.

egg yolk antibody;pancreatic lipase;inhibition;obesity

2015-12-10

劉帥(1990-),男,碩士研究生,研究方向:食品安全,E-mail:liu888shuai888@126.com。

隋建新(1981-),男,博士，副教授,研究方向:食品安全,E-mail:suijianxin@ouc.edu.cn。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(201413061)。

TS201.6

A

1002-0306(2016)11-0350-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.064