黃海燕,陳　亮,陳　萍

(1.吉林工程職業(yè)學院,食品工程分院,吉林四平 136001;2.吉林農業(yè)大學,食品安全研究室,吉林長春 130118)

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雙抗體夾心ELISA法檢測食品中出血性大腸桿菌O157

黃海燕1,陳亮1,陳萍2

(1.吉林工程職業(yè)學院,食品工程分院,吉林四平 136001;2.吉林農業(yè)大學,食品安全研究室,吉林長春 130118)

以滅活重組基因工程菌EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)免疫新西蘭大耳白兔獲得的兔多抗作為捕獲抗體,以針對出血性大腸桿菌O157主要毒力因子的特異性單抗2H9為檢測抗體,建立雙抗體夾心ELISA方法并繪制標準曲線用于食品中出血性大腸桿菌 O157的定量分析。標準曲線線性方程為y=0.3479x-0.4121,R2=0.9862。該ELISA的重復性變異系數小于5%,穩(wěn)定性良好。應用該方法測得出血性大腸桿菌O157∶H7 EDL933的最小檢出限為103cfu/mL。食品樣品接種實驗表明:牛肉或豬肉樣品接種量為0.08 cfu/g,增菌8 h后可以檢出陽性反應;蔬菜和牛奶樣品接種量為0.12 cfu/g(mL),增菌10 h后可以檢出陽性反應。

出血性大腸桿菌O157,主要毒力因子,雙抗體夾心ELISA

對出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)O157 檢測方法的研究是防控該菌感染的重要環(huán)節(jié),EHEC O157對人的感染劑量可能低于10 個[1],所以建立敏感而特異的檢測方法用于食品檢驗、爆發(fā)調查、監(jiān)測與質量控制等領域就顯得尤為重要。常規(guī)的培養(yǎng)鑒別法費時費力且準確率低[2],結合生理生化鑒定和血清學鑒定,可大大提高檢測的準確率,但由于操作復雜耗時長,難于滿足快速、簡易的檢測要求[3]。分子生物學方法是一種有效的快檢及復檢方法,以PCR為主的現代分子生物學方法經不斷改進取得較滿意效果,但耗資大且實驗條件嚴苛,未能得到廣泛使用。免疫學方法經過近幾年不斷的研究改進可針對現場大量樣品實現快速篩查,具有高靈敏度、高特異性的優(yōu)點,受到各國學者的重視。

利用免疫學方法檢測EHEC O157的首要問題是抗體的特異性,單克隆抗體較多克隆抗體具有更為高效的篩選作用,可快速捕獲特異的EHEC O157菌株并與之結合。近年來,單克隆抗體用于EHEC O157檢測的研究取得了很大進展,主要有免疫層析法和ELISA法。免疫層析法如Qi Hui等[4]利用膠體金免疫層析配合免疫磁性捕獲的方法將 EHEC O157∶H7檢測靈敏度從105cfu/mL提高到103cfu/mL;崔希等[5]以免疫磁分離與膠體金免疫層析法相結合實現EHEC O157∶H7的快速檢測;劉程等[6]研制的免疫膠體金試紙條檢測出EHEC O157∶H7靈敏度為2.1×106cfu/mL;龐璐等[7]把PCR與免疫膠體金相結合用于快速檢測食品中的EHEC O157。ELISA法如吳大成等[8]、劉紅亮等[9]分別建立了雙抗夾心ELISA法,但此類研究檢測用單抗大多由熱滅活EHEC O157∶H7或其突變株全菌免疫而獲得的,為針對EHEC O157 LPS的抗體。

本研究是以工程菌EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)免疫大耳白兔獲得的多克隆抗體作為捕獲抗體,以前期制備的針對EHEC O157主要毒力因子(編碼志賀毒素的stx基因和編碼緊密素的eae基因)的特異性單克隆抗體2H9為檢測抗體,建立了雙抗體夾心ELISA方法并繪制了標準曲線,在食品接種實驗中取得了滿意效果,可用于食品中EHEC O157的快速檢測。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

重組工程菌EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)、EHEC O157∶H7標準菌株(EDL933)、特異性檢測用菌株均由解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所保存。雌性新西蘭大耳白兔(體重2.5 kg左右)、BALB/C健康雌性小鼠(8～10 W,用于腹水制備)購自衛(wèi)生部長春生物制品所。

OPD(鄰苯二胺)、BSA、Tween-20、改良EC肉湯培養(yǎng)基等購自長春鼎國生物技術公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HRP標記羊抗兔IgG、HRP標記羊抗鼠IgGSIGMA公司產品。離心機(Eppendorf 5417R)購自德國;酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK)、酶標板、恒溫培養(yǎng)搖床(SPH-100B)、蛋白純化儀(BioLogic TM LP 358BR5057)、雙人雙面垂直潔凈工作臺(SW-CJ-2F)購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2實驗方法

1.2.1EHEC O157兔抗的制備及鑒定將EHEC O157 Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6,收集菌體。用PBS緩沖液洗滌2次,進行菌落計數。56 ℃滅活30 min備用。雌性新西蘭大耳白兔(體重2.5 kg左右)2只,免疫前采0.5 mL血液分離后血清存于-20 ℃作陰性對照。耳緣靜脈注射滅活的EHEC O157(EDL933),0.5 mL/只(108cfu/只)。追加免疫5次,每次間隔2 W,免疫菌量為2×108～5×108cfu/只。耳緣靜脈采血測定效價,最末一次免疫后第8 d頸動脈采血。多克隆抗體的純化采用辛酸-硫酸銨法。間接ELISA法測定純化的兔抗效價(酶標抗體為HRP標羊抗兔IgG),直接ELISA法檢測制備的兔抗對EHEC O157(EDL933)的最小檢出限。

1.2.2單抗2H9的制備以純化融合蛋白Eae-Stx1/2B免疫BALB/C小鼠獲得的穩(wěn)定分泌抗EHEC O157主要毒力因子單抗的陽性雜交瘤細胞株2H9為lgG2b亞類[10]。采用動物體內誘生單克隆抗體的方法制備的腹水IgG采用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化。所得腹水純化后抗體濃度為3.16 mg/mL效價為1∶1.28×105,親和常數為2.9×106,對EHEC O157標準株的最小檢出限為:103～104cfu/mL。

1.2.3兔抗包被濃度和單抗2H9工作濃度的選擇兔抗EHEC O157為捕獲抗體,單克隆抗體2H9為檢測抗體,建立雙抗體夾心ELISA方法。純化兔抗從4000倍開始以包被液進行2倍稀釋至1.28×105倍,37 ℃橫向包被1 h,洗滌。加入106cfu/mL標準株EDL933 37 ℃反應1 h后洗滌。單抗2H9以PBS按同樣倍數稀釋縱向加入各孔,37 ℃反應1 h,以PBS作空白對照。酶標抗體為HRP標羊抗鼠IgG,加底物溶液TMB顯色后終止,測定各孔OD490值。以OD490值P/N>10,且與后稀釋度出現較大變化時,該孔對應的兔抗和單抗稀釋倍數初步確定為其最佳工作濃度。

1.2.4最佳反應時間的確定取4塊酶標板,以確定的兔抗最佳包被濃度包被酶標板,封閉后每孔分別加入100 μL濃度為102、103、104、105、106、107、108(cfu/mL)的 EHEC O157(EDL933)菌液,洗滌后每孔加入100 μL確定的2H9工作濃度液,37 ℃分別反應0.5、1、1.5和2 h,進行ELISA檢測,測定OD490值。以OD490值為縱坐標,以EDL933菌液對應濃度的對數值為橫坐標,繪制反應曲線。各反應時間經5次板間重復測定,計算板間變異系數。選擇線性最佳,斜率絕對值最大且CV≤10%者對應的時間為最佳反應時間。

1.2.5雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性被檢菌株:EHEC O157標準株EDL933(NCTC12900);普通大腸桿菌E.coliLE392(ATCC10798);李斯特菌listeriamonocytogenes(CICC 21603);金黃色葡萄球菌staphylococcusaureus(CMCC 122001);志賀氏菌Shigellasonnei(CMCC 51334);沙門氏菌salmonellaenteritidis(CCTCC AB 94018);副溶血性弧菌vibrioparahaemolyticus(ATCC 17805);臘樣芽孢桿菌waxybacillus(CMCC 108001);魏氏梭菌Clostridieumwelchii(CICC 22613);糞鏈球菌Streptococcusfeacalis(ACCC 124001);糞腸球菌Enterococcusfaecalis(CICC 23658);巴氏桿菌pastometerbacilus(CICC 10215);重組工程菌BL21(pET28::eae-stx1/2B)和EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)由陳萍博士構建;1株EHEC O157∶H7為吉林出入境檢驗檢疫局分離株,以上菌株均由解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所保存。用建立的ELISA方法對各菌株純培養(yǎng)菌液進行檢測。

1.2.6敏感性測定及標準曲線的建立以建立的雙抗體夾心ELISA方法,對濃度分別為102、103、104、105、106、107、108(cfu/mL)的EHEC O157菌液進行檢測,測定OD490值,確定該方法的敏感性。以EHEC O157菌液對應濃度的對數值為橫坐標,各對應濃度測得的OD490值為縱坐標,制作反應曲線,計算曲線段的回歸方程及相關系數。板內每個濃度重復測定5次,根據測定結果計算板內變異系數;取5塊板不同時間重復檢測,根據不同時間的測定結果在同一坐標中繪制標準曲線,考察標準曲線的可重復性。如果隨著菌液濃度的升高,OD490值呈明顯梯度增加,多次重復后板內變異系數CV≤5%,曲線線性良好,則表明建立的檢測標準曲線具有較好的可重復性。

表1　兔抗EHEC O157和單克隆抗體2H9工作濃度的選擇

1.2.7食品中EHEC O157 的檢測取牛肉、豬肉、蔬菜、牛奶各25 g(mL),固體絞碎。將 EHEC O157(EDL933)于LB中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4,離心收集菌體,以生理鹽水重懸10倍系列稀釋,LB平板計數。按計數結果調整菌數為10 cfu/mL,分別取1、2、3、4、5 mL至9、8、7、6、5 mL生理鹽水中,使EHEC O157(EDL933)菌液濃度依次為1、2、3、4、5 cfu/mL。分別取1 mL上述菌液接種于各份食品樣品中即EHEC O157(EDL933)的接種量分別為1、2、3、4、5 cfu,攪拌均勻后加入225 mL改良EC(含25 mg/L新生霉素)肉湯[11],37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)4～16 h。在培養(yǎng)4、6、8、10、12、14、16 h時,從每份樣品中取3份增菌液,每份1 mL,用建立的雙抗體夾心ELISA方法分別檢測各樣品,測定OD490值。當測定的OD490值≥菌液103(cfu/mL)對應的OD490值時,所檢樣品即為陽性;所對應的橫坐標值即為增菌樣品中EHEC O157菌液濃度值。

2　結果與分析

2.1兔抗EHEC O157效價及檢出限的測定

兔抗EHEC O157多抗血清純化后質量濃度為12.8 g/L。以未免疫兔血清為陰性對照,隨著抗體稀釋倍數的增加OD490值下降,以測定孔OD490值P/N>2.1為判斷標準,測定其效價為1.28×105。直接ELISA測得兔抗對EHEC O157(EDL933)的最小檢出限為104cfu/mL。

2.2兔抗EHECO157和單抗2H9工作濃度的確定

初步選擇如表1。當OD490值P/N>10呈強陽性,且與后稀釋度對比出現較大變化時,該孔對應的兔抗:1.6×104倍為最佳包被濃度,單抗2H9:3.2×104倍為最佳檢測濃度。

2.3最佳反應時間的確定

以建立的雙抗體夾心ELISA法檢測EHEC O157(EDL933)菌液,分別反應 0.5、1、1.5和2 h,測定OD490值。從圖1可以看出4條反應曲線中,反應時間為0.5 h和1 h時的兩條曲線基本重合,斜率大且線性佳。各反應時間經5次板間重復測定,0.5、1、1.5和2 h的平均變異系數CV%分別為4.62%、4.38%、8.59%和11.42%,綜合考慮時效性,確定最佳反應時間為0.5 h。

圖1　不同反應時間的ELISA結果Fig.1　Results of different reaction time

2.4雙抗體夾心ELISA檢測方法的特異性

結果表明該方法僅對EHEC O157(EDL933)、EHEC O157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)、BL21(pET28::eae-stx1/2B)、EHEC O157∶H7(吉林出入境檢驗檢疫局分離株)4株大腸桿菌為陽性,其他血清型大腸桿菌及其他屬參考菌株均為陰性。

2.5標準曲線的建立與敏感性測定

以上述優(yōu)化的雙抗體夾心ELISA條件測定不同濃度的EHEC O157菌液,結果顯示當菌液濃度為103cfu/mL時仍能檢出陽性,即EHEC O157的最小敏感檢出限為103cfu/mL。以OD490值為縱坐標,菌液濃度對數值為橫向坐標制作標準曲線,如圖2。

表2　標準曲線的變異性分析(n=5)

圖2　雙抗體夾心ELISA標準曲線Fig.2　Standard curve of double antibody sandwich ELISA

標準曲線在EHEC O157菌液濃度為103～108(cfu/mL)的范圍內線性良好,線性方程為y=0.3479x-0.4121,相關系數R2=0.9862。板內5次重復測定,結果如表2所示,板內變異系數為0.839%～1.952%,平均變異系數為1.20%,符合要求,且不同時間制作的標準曲線基本重合,說明標準曲線的重復性較好,可以作為檢測EHEC O157的定量標準。

ELISA檢測結果的準確性受諸多因素諸如試劑、材料、操作方法以及環(huán)境等方面的影響,變異系數往往較大,本實驗通過多次實驗優(yōu)化檢測條件并結合同類研究成果[12],使板內變異系數降低到2%以內。

2.6食品中EHEC O157的檢測

食品樣品接種培養(yǎng)后用建立的ELISA方法進行檢測,結果表明:25 g牛肉或豬肉樣品接種EHEC O157(EDL933)量為2 cfu即0.08 cfu/g時在40 ℃增菌8 h后可以檢出陽性反應;25 g(mL)蔬菜和牛奶樣品接種量為3 cfu即0.12 cfu/g(mL)在40 ℃增菌10 h后可以檢出陽性反應。

3　結論

本研究建立的雙抗體夾心ELISA法所用檢測抗體2H9為針對EHEC O157主要毒力因子(LEE致病島上eae基因編碼的腸粘附因子-緊密素(Intimin)和整合到細菌基因組中的原噬菌體編碼的志賀毒素Stx)的特異性單抗,2H9是以stx基因和eae基因構建并表達的Eae-Stx1/2B融合蛋白免疫BALB/C小鼠經細胞融合而獲得,捕獲兔抗是以基因工程菌EHEC O157 Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)免疫獲得,此方法不與其他血清型大腸桿菌及其他屬參考菌株發(fā)生交叉反應,具有較高特異性,且對EHEC O157(EDL933)純培養(yǎng)菌液的最小檢出限為103cfu/mL,可以滿足低劑量感染樣品快速增菌后EHEC O157的檢出。依據此方法的檢測結果繪制出標準曲線并推出線性方程,經板內及板間多次重復后變異系數小于5%,線性基本重合,證明其穩(wěn)定性良好。

在食品樣品接種實驗中EHEC O157(EDL933)采用改良EC肉湯增菌后,牛肉或豬肉樣品接種量為0.08 cfu/g在40 ℃增菌8 h后可以檢出陽性反應;蔬菜和牛奶樣品接種量為0.12 cfu/g(mL)在40 ℃增菌10 h后可以檢出陽性反應,證明本實驗建立的雙抗體夾心方法可實現食品中EHEC O157的快速檢測,且可依據標準曲線定量分析染菌程度,可作為食品感染EHECO157風險評估的依據。

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Establishment of double-antibody sandwich ELISA for detection of EHEC O157 in food

HUANG Hai-yan1,CHEN Liang1,CHEN Ping2

(1.Institute of Food Engineering,Jilin Engineering Vocational College,Siping 136001,China;2.Institute of Food Security,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)

The polyclonal antibody of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157(EHEC O157)IgG was prepared by intravenous injection into New Zealand rabbit with inactivated engineered bacteriaE.coliO157 Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae).A double-antibody sandwich ELISA was developed to detectE.coliO157 in food samples,which using polyclonal antibody IgG as the capture antibody,and monoclonal antibody 2H9against main virulence factors of EHEC O157 as the detection antibody. Linear equation of standard curve was y=0.3479x-0.4121,R2=0.9862,and variation coefficient less than 5%. The detection limit of this sandwich ELISA was 103cfu/mLE.coliO157 in pure culture. Inoculation test of EHEC O157 in food samples indicated that the positive result could be detected when inoculated levels were 0.08 cfu/g with 8 h enrichment in negative beef or pork and 0.12 cfu/g(mL)with 10 h enrichment in negative vegetables and milk.

EHEC O157;main virulence factors;double-antibody sandwich ELISA.

2015-11-19

黃海燕(1984- )，女，碩士研究生，講師，研究方向：食品安全與檢測，E-mail:hhycjx@163.com。

TS207.3

B

1002-0306(2016)11-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.030