余惠珍 高潔 鄭熙 朱鵬立

冠脈結(jié)扎法在大鼠急性心肌梗死模型制作中的應用

余惠珍 高潔 鄭熙 朱鵬立

目的 探討冠脈結(jié)扎法制作大鼠急性心肌梗死模型。方法 40只Sprauge-Dawley大鼠隨機分為冠脈結(jié)扎組和假手術(shù)組。大鼠經(jīng)麻醉后，氣管插管連接小動物呼吸機，打開左側(cè)胸腔，暴露心臟，結(jié)扎組結(jié)扎左冠狀動脈前降支，假手術(shù)組只用線穿過左前降支而不結(jié)扎。手術(shù)前后均行心電圖檢查，4周后行血流動力學檢測，取出心臟，觀察其外形變化，行HE染色后于顯微鏡下觀察其病理變化。結(jié)果 冠脈結(jié)扎組制作心梗模型成功率為100%，術(shù)后存活率為65%；假手術(shù)組術(shù)后存活率為80%。冠脈結(jié)扎組術(shù)后4周取出的心臟，左心室較假手術(shù)組擴大，缺血區(qū)室壁變薄。結(jié)論 冠脈結(jié)扎法制作大鼠心肌梗死模型，效果穩(wěn)定，成功率高，制作方便，經(jīng)濟易推廣。

急性心肌梗死；動物模型；大鼠

心肌梗死是一種嚴重危害人類健康的心血管疾病。國內(nèi)外眾多學者均曾借助家兔、大鼠等動物模型對人類心肌梗死進行研究，目前構(gòu)建急性心肌梗死模型的方法有冠脈結(jié)扎法、藥物法和冠脈冷凝法等[1]，但冠脈結(jié)扎法是最常用的方法。本研究通過探討冠脈結(jié)扎法在大鼠急性心肌梗死動物模型制作中的運用，為今后心梗后心肌重塑和基因治療的實驗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性Sprauge-Dawley（SD）大鼠 40 只，體質(zhì)量（250±20）g，由福建醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.1.2 實驗試劑及儀器 10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司）、注射用青霉素鈉（80萬單位/支，華北制藥股份有限公司）、動物呼吸機（江西省特力麻醉呼吸設(shè)備有限公司，TKR-200C型）、生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司，BL-420S型）及手術(shù)器械等。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 40只SD大鼠隨機分為冠脈結(jié)扎組（20只）和假手術(shù)組（20只）。

1.2.2 呼吸機參數(shù)設(shè)置 呼吸頻率60次/min，吸呼比1∶1.5，潮氣量約為3 ml/100 g，吸入氧氣濃度為100%。

1.2.3 動物麻醉 大鼠禁食禁水8 h稱重，10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射，注射前注射器回抽檢查是否有血回流，以防注入腸道。

1.2.4 心電圖檢測 麻醉滿意后，大鼠以仰臥位固定于手術(shù)操作板上，四肢皮下插入針電極（右前肢-負極，右后肢-接地線，左后肢-正極），記錄標準Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

1.2.5 氣管插管 頸部皮膚脫毛，碘伏消毒頸部手術(shù)野皮膚，取正中切口約2 cm，剪開皮膚，由淺入深鈍性分離下頜下腺、頸前肌肉，暴露氣管，于甲狀軟骨下3～4個氣管環(huán)用帶針芯的16G靜脈留置針平行插入氣管，后拔出針芯，進針深度約2 cm，插管成功后，針套連接已設(shè)好參數(shù)的呼吸機，見胸廓起伏平穩(wěn)后用膠帶固定。

1.2.6 手術(shù)操作 冠脈結(jié)扎組：高壓蒸汽滅菌法消毒手術(shù)器械。左胸前皮膚常規(guī)脫毛，鋪無菌手術(shù)巾，碘伏消毒手術(shù)區(qū)，以左胸前搏動最明顯處為中心，距胸骨中線約1 cm處縱向切開皮膚，長約3 cm，注意避開皮下血管，逐層鈍性分離皮下筋膜、肌肉，暴露肋骨，3～4肋間用血管鉗鈍性分離肋間肌，注意避開肋間血管，在分離的3～4肋間隙置入動物胸廓撐開器，注意避免損傷肺，固定好撐開器后，可見心臟暴露于手術(shù)視野，用眼科彎鑷輕輕扯開心包，暴露出左心耳、肺動脈圓錐，輕壓右側(cè)胸廓，擠出心臟，以左心耳和肺動脈圓錐的交界與心尖連線為縫扎中線，用5-0線縫針從左心耳右緣下方2 mm進針，進針深度為 1.5～2.0 mm，寬度 2～3 mm，結(jié)扎時力度適中，防止扯斷心肌。結(jié)扎后可見從結(jié)扎點起至心尖間的大面積心肌變白[1,2]，觀察結(jié)扎后心電圖較結(jié)扎前有無變化，若出現(xiàn)心律失常，于心臟表面滴1～2滴利多卡因，待轉(zhuǎn)復后將心臟輕輕回納胸腔，充分止血后，撤除胸廓撐開器，檢查肺是否損傷，置一橡膠軟管于胸腔中，一端連接注射器，用4-0縫合線逐層關(guān)胸后抽吸注射器，使胸腔形成負壓，再拔除橡膠軟管，待大鼠蘇醒后拔除氣管插管，以5-0縫合線逐層縫合頸前肌肉、皮膚。術(shù)后予10萬單位青霉素鈉溶液腹腔注射。假手術(shù)組只穿5-0縫合線過左前降支而不結(jié)扎，其余步驟均同冠脈結(jié)扎組。

1.2.7 術(shù)后處理 術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)24 h，保持環(huán)境溫暖干燥，飼料飲水充足，術(shù)后3 d均予腹腔注射青霉素鈉溶液10萬單位。

1.2.8 血流動力學檢測 4周后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，分離出右頸總動脈，避免誤傷迷走神經(jīng)，用5-0縫合線結(jié)扎已分離動脈遠心端，近心端置5-0縫合線備用，眼科剪斜剪該段動脈一V型小口，緩慢置入已被肝素浸潤的PE50壓力傳導管，扎緊近心端縫線，連接BL-420s生物機能實驗系統(tǒng)，導管不斷向前推進，直至進入左心室，待波形穩(wěn)定，采集左室舒張末壓、心率、左室收縮壓、左心室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左心室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmax）等。

1.2.9 心肌梗死模型鑒定 血流動力學檢測完畢，腹腔注射過量水合氯醛處死大鼠，按“V”字法打開胸腔，取出心臟，洗凈積血后觀察其外形、大小。

1.2.10 HE染色 將取出的心臟去除心房、右心室，左室用甲醛固定24 h后進行石蠟包埋制成蠟塊，3μm/片制成切片備用，按切片脫蠟至水→染色→脫水、透明→封固等步驟進行HE染色。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0分析軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)值變量以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠存活情況 冠脈結(jié)扎組大鼠共死亡7只，存活率為65%，其中有2只在術(shù)后1 h內(nèi)死亡，1只在術(shù)后24 h內(nèi)死亡，術(shù)后觀察4周，死亡4只。死亡原因：早期2只疑因術(shù)中失血過多、心律失常、麻醉過量所致，1只因腹脹，2只因肺部感染，2只疑因心力衰竭所致。假手術(shù)組大鼠共死亡4只，存活率為80%。死亡原因：1只因術(shù)中失血過多死亡，1只疑因麻醉過量死亡，2只因肺部感染死亡。

2.2 心臟外形變化 冠脈結(jié)扎組在術(shù)中結(jié)扎后，肉眼可見自結(jié)扎點起至心尖間的心肌顏色立即變淺（圖1），假手術(shù)組則無明顯變化。術(shù)后4周取出心臟，冠脈結(jié)扎組大鼠心臟較假手術(shù)組變大，左心室擴大，外形不規(guī)則，梗死區(qū)心室壁變薄，顏色較淺。

2.3 心電圖改變 因大鼠心電圖上無明顯ST段，冠脈結(jié)扎組左前降支結(jié)扎后，心電圖上可見R波和T波融合成帳篷波。假手術(shù)組進針前后無明顯變化（圖 2）。

2.4 血流動力學變化 冠脈結(jié)扎組與假手術(shù)組相比，左室舒張末壓升高（P＜0.05），等容收縮期+dp/dtmax降低（P＜0.05），等容舒張期-dp/dtmax降低（P＜0.05），表明冠脈結(jié)扎組大鼠左心室舒張與收縮功能較假手術(shù)組降低，見圖3。

2.5 組織病理學 心肌組織切片HE染色鏡下觀察，假手術(shù)組鏡下心肌細胞排列整齊，左心室壁厚薄一致，未見明顯梗死區(qū)，無明顯炎癥細胞浸潤；冠脈左前降支結(jié)扎組中，鏡下左室壁心肌厚薄不均勻，梗死區(qū)明顯變薄，成纖維細胞增多，心腔較假手術(shù)組擴大，心肌梗死區(qū)與非梗死區(qū)交界處心肌細胞排列紊亂。見圖4。

3 討論

對于人類心肌梗死疾病臨床前期的探討，現(xiàn)多采用心肌梗死動物模型來研究，國際上制備心梗動物模型的方法有冠脈結(jié)扎法、藥物法、冠脈冷凝法、介入法等[1]，還有采用基因敲除的方法來造成動物心肌梗死[3]，但應用最多的還是冠脈結(jié)扎法。結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作心梗模型在20世紀50年代已基本成熟[4]。較其他方法，冠脈結(jié)扎法制作心梗模型操作簡單、制作方便、容易推廣。大鼠、家兔、豬、牛、羊等動物曾均有報道被用來制作心肌梗死模型[1]。與其他動物相比，大鼠體積小，飼養(yǎng)方便，可單人操作，且有研究發(fā)現(xiàn)大鼠心臟動脈走行分布與人類心臟相似[5]，故本實驗采用SD大鼠作為研究對象。

我們采用冠脈結(jié)扎法制作急性心梗動物模型。冠脈結(jié)扎組術(shù)中均肉眼可見穿線處以下心肌顏色變淺，結(jié)扎后心電圖上可見R波和T波融合形成的帳篷波出現(xiàn)，提示急性心梗模型制作成功。冠脈結(jié)扎的進針位置是影響急性心肌梗死動物模型是否成功的關(guān)鍵因素，且直接影響術(shù)后大鼠的存活率。近年來，有學者研究高位冠脈結(jié)扎及低位冠脈結(jié)扎對急性心梗動物術(shù)后存活率的影響，均認為低位結(jié)扎組（約左心耳尖端下0.6～2 mm）存活率明顯較高位結(jié)扎（主動脈根部下3 mm或緊鄰左心耳邊緣處）存活率高[1,6]。王勇等[6]的研究結(jié)果表明，高位結(jié)扎組與低位結(jié)扎組術(shù)后4周存活率分別為13.3%與66.7%。我們在左心耳下方2 mm處結(jié)扎左前降支，術(shù)后4周存活率為65%，與低位結(jié)扎組數(shù)據(jù)較為接近。

為保證術(shù)后大鼠的存活率，開胸時應盡量避免損傷肺，且呼吸機參數(shù)設(shè)置恰當較為關(guān)鍵，術(shù)畢大鼠尚未完全清醒不宜過早撤離呼吸機，術(shù)后大鼠的呼吸道管理是影響大鼠存活率的重要因素，術(shù)后將大鼠置于溫暖干燥環(huán)境中12 h，連續(xù)3 d腹腔注射青霉素鈉溶液，可防止肺炎的發(fā)生，還可將大鼠舌頭輕輕拉出以防舌后墜阻塞呼吸道。此外，麻醉藥物的選擇也是影響大鼠術(shù)后存活率高低的關(guān)鍵因素，水合氯醛對術(shù)中大鼠的體溫、呼吸、心率等影響較小，故本實驗選擇水合氯醛作為麻醉藥物。

近年來，Gao等[7,8]成功利用冠脈結(jié)扎法制作小鼠心梗模型而不借助呼吸機等通氣設(shè)備，較借助呼吸機及大范圍開胸制作急性心梗動物模型的傳統(tǒng)方法來說術(shù)后存活率更高，且減少了術(shù)中心律失常的發(fā)生，術(shù)后小鼠恢復也較傳統(tǒng)手術(shù)組快。隨著該方法的逐漸成熟、模型穩(wěn)定性的進一步提高，將來可以作為制作心肌梗死動物模型的新選擇。

本實驗采用冠脈結(jié)扎法制作大鼠急性心肌梗死模型成功率高、模型穩(wěn)定、操作簡單、術(shù)后易存活、經(jīng)濟易推廣，為今后關(guān)于心梗后心臟重塑方面的探討提供了可靠的模型。

圖1 左前降支結(jié)扎前后心肌變化

圖2 兩組左前降支結(jié)扎前后心電圖變化

圖3 兩組大鼠血流動力學參數(shù)測定結(jié)果比較

圖4 兩組心肌組織學特點（HE染色，×100倍）

［1］Degabriele NM，Griesenbach U，Sato K，et al.Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarct ion.Exp Physiol，2004，89：497-505.

［2］Yao YY，Yin H，Shen B，et al.Tissue Kallikrein and Kinin Infusion Rescues Failing Myocardium After Myocardial Infarction.J Card Fail，2007，13：588-596.

［3］Braun A，Trigatti BL，Post ML，et al.Loss of SR-BI expression leads to the early onset of occlusive atherosclerot ic coronary artery disease，Spontaneous myocardial infarctions，severe cardiac dysfunction，and premature death in apolipoprotein E-deficient mice.Cire Res，2002，90：270-276.

［4］Ohns T，Olson B.Experimental myocardial infarction：A method of coronary occlusion in small animals.Ann Surg，1954，140：675-682.

［5］Spadaro J，F(xiàn)ishbein MC，Hare C，et al.Characterizat ion of myocardial infarcts in the Rat.Arch Pathol Lab Med，1980，104：179-183.

［6］王勇，高大中，殷躍輝，等.大鼠心肌梗死模型建立方法選擇及心電圖表現(xiàn).中國實驗動物學報，2011，19：525-529.

［7］Gao E，Lei YH，Shang X，et al.A Novel and Efficient Model of Coronary Artery Ligationand Myocardial Infarction in the Mouse.Circ Res，2010，107：1445-1453.

［8］Gao E，Koch WJ.A Novel and Effi cient Model of Coronary Artery Ligation in the Mouse.Methods Mol Biol，2013，1037：299-311.

The model of acute myocardial infarction in rats by ligation of coronary artery

YU Hui-zhen＊，GAO Jie，ZHENG Xi，et al.＊Geriatric Medicine Research Institution of Fujian Provincial Hospital，Internal medicine，South hospital of Fujian Provincial Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China

ZHU Peng-li，E-mail：zpl7755@126.com

Objective To investigate the acute myocardial infarction model in rats by ligation of coronary artery.Methods 40 Sprauge-Dawley rats were randomly divided into sham operation group or coronary ligation group.After anesthesia，the rats were tracheal intubated with small animal ventilator，then opened the left chest with left anterior descending coronary artery was ligated.Sham operation group just wear line not ligation.All the rats underwent ECG examination before and after operation.After 4 weeks，the Hemodynamic parameters was detected and the heart was taken out to observe the shape changes，and the pathological changes were observed after HE staining.Results The success rate of acute myocardial infarction model was 100%，the operation group survival rate was 65%，and the sham operation group survival rate was 80%after operation.After 4 weeks of operation，the left ventricle was enlarged and the ventricular wall was thinned in the ischemic region.Conclusion The coronary artery ligation method can make rat myocardial infarction model.Its effect is stable with high success rate，and the production is convenient，economical.

Acute myocardial infarction；Animal model；Rats

福建省自然科學基金面上項目（項目編號：2011J01134）；福建省衛(wèi)生廳青年骨干培養(yǎng)人才項目（項目編號：2013-ZQN-ZD-2）

350001 福建省福州市，福建省立醫(yī)院老年醫(yī)學研究室，福建省臨床老年病研究所（余惠珍、高潔、鄭熙、朱鵬立）福建省立醫(yī)院南院內(nèi)科（余惠珍）；福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院（高潔、鄭熙）

朱鵬立，E-mail：zpl7755@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.020

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）08-0752-03

2016-02-29）