田　申,李貽杰,曹文紅,3,*,祝亞輝,章超樺,3

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088;3.水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088)

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利用蝦頭內(nèi)源酶模擬胃腸道消化制備短肽的研究

田申1,2,李貽杰1,曹文紅1,2,3,*,祝亞輝1,章超樺1,2,3

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088;3.水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088)

本文利用蝦頭內(nèi)源性蛋白酶構(gòu)建模擬胃腸道的消化系統(tǒng),酶解蝦頭蛋白制備短肽。結(jié)果表明,在模擬消化過(guò)程中,蝦頭蛋白釋放量、水解度和水解產(chǎn)物低于3000 u分子量的組分呈現(xiàn)出兩次顯著增加趨勢(shì),顯示蝦頭內(nèi)源性類胃蛋白酶和類胰蛋白酶在模擬消化不同階段起到的酶解作用。在模擬胃部消化條件下制備的產(chǎn)物其分子質(zhì)量集中在2000～3000 u左右;在模擬腸道消化條件下制備的產(chǎn)物其分子量主要集中在1000 u以下。以上結(jié)果表明,利用蝦頭內(nèi)源性蛋白酶模擬胃腸道消化可制備高附加值的短肽產(chǎn)物,實(shí)現(xiàn)蝦頭蛋白的高效回收。

凡納濱對(duì)蝦,蝦頭,內(nèi)源酶,模擬消化,短肽

食源性短肽是以食品蛋白為原料,通過(guò)酶解或發(fā)酵制得的蛋白水解產(chǎn)品。食源性短肽不僅安全性極高,而且還具有很多生理調(diào)節(jié)功能特性[1-2],如參與機(jī)體的降血壓[3]、抗氧化[4]、抗血栓[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等,是當(dāng)前食品科技界熱門的研究課題。目前具有特殊生理活性的食源性短肽不斷被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于食品配方、功能食品以及食品添加劑等。但其口服后,容易被胃腸道消化系統(tǒng)酶系降解而失去原有的生理活性,這是制約食源性短肽研究開發(fā)與應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。有研究表明:食源性蛋白由消化系統(tǒng)酶水解制備的短肽有良好的抗消化酶降解能力[7],并且比相同組成的游離氨基酸更容易被機(jī)體吸收[8]。因此目前國(guó)內(nèi)外食品科技界主要采用商業(yè)蛋白酶模擬消化進(jìn)行制備短肽[9-10]。但使用商品酶制備短肽存在著成本高的問(wèn)題。

在對(duì)蝦加工過(guò)程中,占蝦體質(zhì)量30%～40%的蝦頭常被剔除成為加工廢棄物。對(duì)蝦生理結(jié)構(gòu)非常獨(dú)特,大部分消化器官集中在蝦頭,因此蝦頭含有豐富的內(nèi)源性蛋白酶[11]。有研究者從蝦頭中檢測(cè)出類胰蛋白酶[12]和類胃蛋白酶[13]兩種主要蛋白酶。利用蝦頭內(nèi)源性蛋白酶對(duì)蝦頭蛋白進(jìn)行降解,制備成短肽、氨基酸等小分子物質(zhì),將能實(shí)現(xiàn)蝦頭蛋白質(zhì)的回收。本課題組前期研究證實(shí)紫外輻射能顯著提高蝦頭內(nèi)源蛋白酶活性[14-15]。本文擬采用紫外輻射的方法充分激活蝦頭內(nèi)源酶酶活,在此基礎(chǔ)上利用蝦頭內(nèi)源性蛋白酶對(duì)蝦頭蛋白進(jìn)行模擬消化降解制備短肽,以提高蝦頭蛋白質(zhì)的利用價(jià)值,研究結(jié)果對(duì)水產(chǎn)品加工廢棄物蛋白質(zhì)的高值化利用具有重要的參考意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蝦頭:鮮活凡納濱對(duì)蝦購(gòu)于廣東省湛江市東風(fēng)市場(chǎng),取蝦頭,分裝放置于-75 ℃冰箱備用。多肽分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品:N-Hippuryl-His-Leuhydrate(429.47 u)購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司,Triosephosphate isomerase(26625 u),Myoglobin(16950 u),α-Lactalbumin(14437 u),Aprotinin(6512 u),Insulin b chain oxidized(MW 3496 u)和Bacitracin(1423 u)購(gòu)自于美國(guó)Biorad公司。其它分析試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

PHS-3C型精密pH計(jì)上?？祪x儀器股份有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇金壇市佳美儀器有限公司;CR22G Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)日本日立有限公司;UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司;LC-20AD高效液相色譜儀日本島津公司;高效液相凝膠色譜柱Protein-PAK60(WAT085250)美國(guó)waters公司;BIFLEX Ⅲ型MALDI-TOF質(zhì)譜儀美國(guó)Bruker Daltonics公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蝦頭紫外輻射的方法紫外輻射蝦頭促進(jìn)內(nèi)源酶活力工藝參考Cao等[15]的方法,并作一定的改進(jìn)。取適量凡納濱對(duì)蝦蝦頭勻漿,平鋪于托盤上(蝦漿厚度小于5 mm),置于紫外燈下輻射激活內(nèi)源酶(紫外輻射條件為:紫外燈波長(zhǎng)253.7 nm、功率30 W,紫外燈高于托盤20 cm,輻射時(shí)間為20 min)。

1.2.2蝦頭內(nèi)源性蛋白酶模擬胃部消化紫外輻射后的蝦漿分裝30 g于廣口瓶中,按固液比1∶3(m∶v)加入4 ℃蒸餾水,震蕩混勻,調(diào)節(jié)pH為3,置于50 ℃恒溫水浴中保溫,每10 min震蕩一次,并于0、0.5、1、2、3、4、5 h時(shí)間點(diǎn)取樣,檢測(cè)酶活。

1.2.3蝦頭內(nèi)源性蛋白酶模擬腸道消化將凡納濱對(duì)蝦蝦頭勻漿,紫外輻射后,分裝30 g于廣口瓶中,固液比1∶3(m∶v)加入4 ℃蒸餾水,震蕩混勻,調(diào)節(jié)pH為8.5,置于到55 ℃恒溫水浴中保溫,每10 min震蕩一次,于0、0.5、1、2、3、4、5 h時(shí)間點(diǎn)取樣,檢測(cè)酶活。

1.2.4利用蝦頭內(nèi)源酶模擬胃腸道消化模擬胃腸道消化參照J(rèn)ohn[16]的方法并加以改進(jìn)。將凡納濱對(duì)蝦蝦頭勻漿,紫外輻射后,分裝30 g于廣口瓶中,固液比1∶3(m∶v)加入90 mL 4 ℃蒸餾水,震蕩混勻,調(diào)節(jié)pH為3,置于到50 ℃恒溫水浴中保溫,每10 min震蕩一次,根據(jù)類胃蛋白酶酶活變化規(guī)律,選擇1.5 h后轉(zhuǎn)入模擬腸道消化條件,調(diào)節(jié)樣品pH為8.5,水浴溫度調(diào)整為55 ℃繼續(xù)自降解。于0、0.5、1、1.5、2、3、4、5 h時(shí)間點(diǎn)取樣,沸水浴15 min滅酶,冷卻后離心(9000 r/min、4 ℃、20 min),上清液收集于廣口瓶中備用。

1.2.5酶活的檢測(cè)方法將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取的樣品高速離心(9000 r/min、4 ℃、20 min),取上清液即粗酶液,采用福林酚試劑法[17]檢測(cè)酶活,平行檢測(cè)三次。

1.2.6蛋白含量檢測(cè)微量凱氏定氮法[18]。

1.2.7自降解水解度(DH)的檢測(cè)采用甲醛滴定法測(cè)定酶解前后體系中α-氨基態(tài)氮的含量[19];原料總氮和非蛋白氮含量采用微量凱氏定氮法[18]測(cè)定,計(jì)算公式[20]如下:

式中:A為原料中總氮量;B為水解液中的氨基氮量;C為原料中游離的氨基氮量;D為原料中的非蛋白氮量。

1.2.8蝦頭模擬消化酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的測(cè)定采取高效體積排阻色譜法檢測(cè)蝦頭模擬消化酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。以0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.2)緩沖溶液作為流動(dòng)相,流動(dòng)相流速為0.7 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm,柱溫25 ℃。將自降解產(chǎn)物的上清液配制成可溶性蛋白含量為5 mg/mL的溶液,經(jīng)針頭式濾頭過(guò)濾后,上樣20 μL至Waters-Protein-Pak 60柱進(jìn)行洗脫。利用由蛋白標(biāo)品建立的分子質(zhì)量回歸方程考察紫外脅迫下蝦頭自降解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布?；貧w方程為log M=-0.2448t+6.4433,決定系數(shù)為0.99。

1.2.9蝦頭模擬消化酶解產(chǎn)物的肽質(zhì)譜分析將樣品液與適量的基質(zhì)溶液混合后,取約1 μL溶液,滴加在樣品靶上,待溶劑揮發(fā),樣品結(jié)晶后,送入質(zhì)譜儀,進(jìn)行質(zhì)譜分析:激光波長(zhǎng)為337 nm,采用延時(shí)引出(Delayed extraction)和反射(Reflection)的工作方式,加速電壓 19.5 kV,反射電壓 20 kV,延時(shí)引出電壓14.5～16.5 kV,延時(shí)時(shí)間為50～200 ns,正離子檢測(cè)。累加10～50次單次掃描信號(hào)得到肽質(zhì)譜圖。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用“平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示,重復(fù)三次。顯著性采用SPSS20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,p<0.05為顯著差異。

2　結(jié)果與討論

2.1模擬胃部消化和腸道消化過(guò)程中蝦頭內(nèi)源性蛋白酶酶活變化

由圖1與圖2可得,凡納濱對(duì)蝦蝦頭在模擬胃部消化和腸道消化的條件下,內(nèi)源性蛋白酶均顯示酶活。圖1顯示,在模擬胃部條件消化過(guò)程中,類胃蛋白酶酶活在1～2 h內(nèi)下降較快,因此模擬胃部消化可在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。圖2顯示,在模擬腸道條件消化過(guò)程中,類胰蛋白酶酶活在1～3 h內(nèi)下降較快,但在3～5 h仍保持400～600 U/g蝦頭的較高酶活。因此利用蝦頭內(nèi)源性蛋白酶模擬胃腸道消化制備短肽的過(guò)程設(shè)計(jì)為:模擬胃部條件消化1.5 h,隨后轉(zhuǎn)入模擬腸道條件消化1.5～5 h制備短肽。

圖1　模擬胃部消化過(guò)程中蝦頭類胃蛋白酶酶活變化Fig.1　Activity change of pepsin-like protease during the simulated gastro digestion of shrimp head

圖2　模擬腸道消化過(guò)程中類胰蛋白酶酶活變化Fig.2　Activity change of trypsin-like protease during the simulated intestinal digestion of shrimp head

2.2利用蝦頭內(nèi)源蛋白酶模擬消化制備短肽

2.2.1模擬消化過(guò)程中蝦頭蛋白質(zhì)的釋放規(guī)律在內(nèi)源蛋白酶的催化作用下,蝦頭中的蛋白質(zhì)被降解,以蛋白質(zhì)、肽和氨基酸的形式釋放出來(lái)。圖3是蝦頭在模擬胃腸道消化過(guò)程中在不同時(shí)間釋放的蛋白質(zhì)量。由圖3可以看出蝦頭蛋白釋放量在0～1 h的模擬消化降解中迅速增加,每克蝦頭的蛋白質(zhì)釋放量達(dá)103.4 mg,此時(shí)起作用的是以類胃蛋白酶活性為主體的酸性蛋白酶。在消化系統(tǒng)中,胃蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的專一性較寬,主要將蛋白質(zhì)水解成分子量較大的肽類產(chǎn)物,供后續(xù)腸道酶系的進(jìn)一步水解。隨后轉(zhuǎn)入模擬腸道消化條件,從圖3可以看出1.5～4 h內(nèi)蝦頭釋放蛋白量仍有明顯上升趨勢(shì),這是因?yàn)樵谀M腸道消化階段中,蝦頭內(nèi)源性類胰蛋白酶處于最適條件,酶活力達(dá)到最大值,對(duì)酸性條件下溶出的蛋白質(zhì)和肽進(jìn)行酶解,也繼續(xù)分解殘?jiān)械鞍?。但上升趨?shì)明顯減緩,這可能是由于蛋白酶具有專一性,此時(shí)殘?jiān)械鞍滓呀?jīng)殘留不多,并且內(nèi)源性類胰蛋白酶酶活已經(jīng)有所降低。模擬消化進(jìn)行到4 h后,蝦頭釋放的總蛋白含量增加趨勢(shì)趨于平緩,表明酶促降解反應(yīng)結(jié)束。

圖3　模擬消化過(guò)程中蝦頭蛋白釋放量的變化Fig.3　Protein released during the simulated digestion of shrimp head

2.2.2模擬消化過(guò)程中蝦頭蛋白水解度的變化蛋白質(zhì)被酶水解時(shí)的水解度能體現(xiàn)酶解產(chǎn)物的大致組成,水解度越高,則酶解產(chǎn)物中低分子組分越多。如圖4所示,在模擬消化的0～1 h內(nèi),蝦頭內(nèi)源性類胃蛋白酶酶活處于較高值,此時(shí)水解度上升很快,隨后1～1.5 h水解度增加趨勢(shì)變緩,原因可能是蝦頭內(nèi)源性類胃蛋白酶的作用底物變少并且酶活降低導(dǎo)致。隨后調(diào)整到模擬腸道消化條件,蝦頭內(nèi)源性類胰蛋白酶被激活,開始分解蛋白、多肽等,水解度增加速度隨之變大。在模擬腸道消化階段3～5 h內(nèi)水解度增加趨勢(shì)逐漸變緩,這可能是由于內(nèi)源酶專一性作用底物已經(jīng)殘余較少,酶活有所降低。利用內(nèi)源酶模擬胃腸道消化降解蝦頭蛋白制備短肽基本進(jìn)行完成,水解度達(dá)到35.2%,與戴程程等[21]研究南極磷蝦自溶酶解結(jié)果接近。

圖4　模擬消化過(guò)程中蝦頭蛋白水解度的變化Fig.4　Degree of hydrolysis during the simulated digestion of shrimp head

2.2.3蝦頭模擬消化過(guò)程中產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布在利用蝦頭內(nèi)源蛋白酶模擬胃腸道消化制備短肽的過(guò)程中,蝦頭蛋白經(jīng)歷了內(nèi)源性類胃蛋白酶以及類胰蛋白酶的先后作用,最終生成肽和氨基酸產(chǎn)物。圖5為蝦頭模擬胃腸道消化過(guò)程中產(chǎn)物的高效體積排阻色譜圖。從圖5中可以看出,在0～5 h模擬消化過(guò)程中大分子峰明顯減小,小分子峰則逐步增大。低于3000 u以下酶解產(chǎn)物在模擬胃部消化和腸道消化兩個(gè)階段均呈現(xiàn)出增加趨勢(shì),說(shuō)明在兩個(gè)階段初期,內(nèi)源性類胃蛋白酶和類胰蛋白酶分別被激活,分解大分子物質(zhì)速率快。3～5 h增加趨勢(shì)變緩,可能是因?yàn)榇穗A段作為底物的大分子蛋白質(zhì)已被大部分分解,并且蝦頭內(nèi)源性蛋白酶在長(zhǎng)時(shí)間處于較高溫度下逐漸失活。模擬消化5 h后3000 u以下組分含量占酶解產(chǎn)物的78.51%(圖6)。與朱國(guó)萍等[22]僅在堿性條件下利用自溶酶酶解凡納濱對(duì)蝦蝦頭相比,效果較好。

圖5　蝦頭模擬消化過(guò)程中酶解產(chǎn)物的高效液相色譜圖Fig.5　HPSEC of the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of shrimp head

圖6　蝦頭模擬消化過(guò)程中3000 U 以下組分在酶解產(chǎn)物中的比例Fig.6　Proportion of the components under 3000 U in the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of shrimp head

2.2.4蝦頭模擬消化過(guò)程中產(chǎn)物的肽質(zhì)譜分析圖7為蝦頭模擬消化過(guò)程中產(chǎn)物的飛行時(shí)間質(zhì)譜。從質(zhì)譜圖中可以看出,在利用蝦頭內(nèi)源性蛋白酶模擬胃腸道消化制備短肽的過(guò)程中,0～1.5 h是模擬胃部條件自降解階段,模擬消化開始時(shí)分子質(zhì)量0～5000 u范圍內(nèi)各種肽分布較平均,0～1 h內(nèi)分子質(zhì)量2000～4000 u左右肽迅速增加,并且5000 u以上多肽也有所增加,這是由于此過(guò)程中殘?jiān)泄腆w蛋白被內(nèi)源性類胃蛋白酶分解成水溶性的多肽和氨基酸等,1～1.5 h自降解過(guò)程,5000 u以上多肽含量減少,分子量2000～3000 u范圍肽含量增多;1.5～5 h是模擬腸部消化過(guò)程,在此模擬消化過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量1000 u左右肽含量增加比較迅速,說(shuō)明此時(shí)內(nèi)源性類胰蛋白酶被激活,分解多肽,使小分子質(zhì)量的短肽增加,與此同時(shí)分子質(zhì)量在5000 u的多肽含量有微量增加,這是由于內(nèi)源性類胰蛋白酶被激活,繼續(xù)分解殘?jiān)鞍姿隆ｋ馁|(zhì)譜圖變化與模擬消化產(chǎn)物分子量分布變化相吻合。

圖7　蝦頭模擬消化酶解產(chǎn)物的飛行時(shí)間質(zhì)譜圖Fig.7　TOF-MS of the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of shrimp head

3　結(jié)論

利用蝦頭內(nèi)源性蛋白酶可模擬胃腸道對(duì)蝦頭蛋白質(zhì)的消化作用,實(shí)現(xiàn)蝦頭蛋白質(zhì)的高值化回收利用。在模擬胃腸道消化過(guò)程中,蝦頭蛋白釋放量、水解度和低于3000 u以下水解產(chǎn)物含量均有兩次增加趨勢(shì)。蝦頭蛋白經(jīng)過(guò)模擬消化1.5 h,生成產(chǎn)物大部分分子量集中在2000～3000 u左右,經(jīng)過(guò)模擬消化4～5 h后,3000 u以下組分占酶解產(chǎn)物的比重達(dá)78.51%,且多集中在分子質(zhì)量1000 u左右。利用蝦頭內(nèi)源酶構(gòu)建模擬胃腸道消化體系降解蝦頭蛋白制備短肽,進(jìn)而進(jìn)一步開發(fā)肽類保健品或營(yíng)養(yǎng)品,可極大提高蝦頭蛋白質(zhì)的利用價(jià)值。

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Preparation for short peptides from shrimp head in a simulated gastrointestinal tract digestion system based on its endogenous enzymes

TIAN Shen1,2,LI Yi-jie1,CAO Wen-hong1,2,3,*,ZHU Ya-hui1,ZHANG Chao-hua1,2,3

(1.College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety,Zhanjiang 524088,China;3.Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,Zhanjiang 524088,China)

Gastrointestinal tract digestion system was simulated,in which endogenous protease from shrimp head was used to obtain short peptides by degrading protein in shrimp head.The results demonstrated that the release amount of shrimp head protein,the degree of hydrolysis and the proportion of the components under 3000 u in the hydrolysate showed all significantly increase twice during the process of simulated digestion,which meant that endogenous pepsin-like protease and trypsin-like protease worked in different stages of simulated digestion process,respectively.In simulated gastric digestion process,the molecular weight of the autolysis in shrimp head mainly focused on 2000～3000 u,and in simulated intestinal digestion process it focused on 1000 u or less.The results suggested that short peptides with high added values can be obtained by using endogenous proteases in shrimp head to simulate gastrointestinal digestion and in this way,proteins in shrimp head can be retrieved efficiently.

Litopenaeus vannamei;shrimp head;endogenous enzymes;simulated digestion;peptides

2015-09-24

田申(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品深加工及貯藏工程，E-mail:tianshen9103@163.com。

曹文紅(1977-)，男，博士，教授，主要從事海洋生物活性物質(zhì)研究， E-mail:cchunlin@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(41576151)；廣東省自然科學(xué)基金(S2013010012459)；廣東海洋大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(CXXL2014029)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)09-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.010