熊月豐,陳山喬,陶佳佳,肖新峰,倪　玲,包　斌,2,吳文惠

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院,上海 201306;3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

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LC-MS結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)鑒定真假白酒的研究

熊月豐1,陳山喬1,陶佳佳1,肖新峰1,倪玲1,包斌1,2,吳文惠2,3，*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)研究院,上海 201306;3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306)

本文研究了一種分析鑒定真假白酒的新方法。使用離心過濾方法處理某知名酒廠不同系列的白酒及其對應(yīng)的假酒酒樣,經(jīng)LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)檢測分析白酒酒樣化合物信息,運(yùn)用基于模式識別技術(shù)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法處理LC-MS數(shù)據(jù)集,對真假白酒數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。可以成功對真假白酒樣品進(jìn)行組學(xué)區(qū)分。LC-MS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)一級聚類分析(Cluster Analysis)能辨別真假白酒樣品,同時3類不同酒類品種之間形成吻合實(shí)際酒樣信息的聚類信息。主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)法從同系列真酒的不同批次處于同一95%置信區(qū)域(Hotelling T2test)區(qū)分了真假白酒樣品。PLS-DA分析(Partial Least Squares-Discriminate Analysis)法從特征性化合物MS信息顯示真假白酒樣品的差別,白酒真酒比白酒假酒處于更狹小的區(qū)域。結(jié)論顯示LC-MS結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)是鑒定真假白酒的有效方法,該方法不但能區(qū)分真假白酒,還能反映不同系列真酒的相近程度及其特征性化合物信息。

真假白酒,LC-MS,聚類分析,PCA,PLS-DA

假酒為小作坊仿冒名酒而生產(chǎn)出的劣質(zhì)產(chǎn)品。白酒摻假降低了產(chǎn)品品質(zhì),建立快捷可靠的摻假白酒區(qū)分方法具有非常重要的意義[1]。檢測白酒品質(zhì)的方法主要有傅里葉近紅外光譜法、紫外可見吸收光譜法、核磁共振光譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法和電子鼻法等[2]。光譜法的儀器使用成本低,操作簡單,但檢測靈敏度有待提高。而電子鼻法能夠滿足現(xiàn)場檢測的需要,但對模式識別的依賴性比較強(qiáng),且缺乏準(zhǔn)確性和定量檢測的能力。色譜法為應(yīng)用較為廣泛的常規(guī)分析方法,選擇性好,分離能力強(qiáng),特別是LC-MS的分析方法,酒樣預(yù)處理簡單,能保持酒樣的完整性,分析操作方便快捷,是優(yōu)良的檢測方法[2]。

基于LC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)綜合分析多種數(shù)據(jù)集的特征量或者目標(biāo)物,是一種高判別能力,高穩(wěn)健性的系統(tǒng)生物學(xué)方法,已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于疾病診斷、疾病機(jī)理、毒理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、環(huán)境檢測等領(lǐng)域[3]。代謝組學(xué)方法應(yīng)用于食品的鑒別和質(zhì)量控制的研究工作已有報(bào)道,因?yàn)榇x組學(xué)是基于全面分析食品成分組成的整體分析方法,在檢測非特定目標(biāo)物方面有其他檢驗(yàn)方法所沒有的優(yōu)勢[4]。Ogrinc等[5]利用同位素比質(zhì)譜法(Isotope Ratio Mass Spectrometry,IRMS)對摻假的果汁、葡萄酒和橄欖油進(jìn)行了分析研究,分析檢測結(jié)果可以通過主成分分析法(Principle Component Analysis,PCA)或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Artificial Neural Networks,ANN)處理來區(qū)分正常產(chǎn)品和摻假產(chǎn)品。

目前,代謝組學(xué)技術(shù)方法在國外葡萄酒研究中有所應(yīng)用[5],但是在國內(nèi)的食品檢測中應(yīng)用較少,特別在白酒檢測領(lǐng)域比較空白?，F(xiàn)在,酒類分析使用較多的還是光譜分析和色譜分析等方法。例如,孫素琴等[6]利用了傅里葉變換紅外光譜法區(qū)別鑒定了真假茅臺酒樣品,利用紅外光譜宏觀指紋性,建立白酒標(biāo)準(zhǔn)紅外指紋圖譜,達(dá)到了區(qū)分真假白酒的目的。萬益群[7]等人將高效液相色譜法與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合,成功區(qū)分了江西地區(qū)的五類不同酒樣。而范文來等[8]人將質(zhì)譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合進(jìn)行了白酒產(chǎn)地鑒定,并建立了相關(guān)模型。

本文創(chuàng)新性的將LC-MS分析技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于白酒真假鑒定中。LC-MS方法樣品無需冷凍干燥處理,預(yù)處理簡單而迅速,可以更加充分的分析白酒酒體構(gòu)成,獲得盡可能多的化合物數(shù)據(jù),這是其他研究所無法達(dá)到的。同時運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù),除了可以成功鑒別出真假白酒之外,還可以得到PLS-DA分析中的變量重要性(VIP)圖,針對這些特征片段進(jìn)行深入研究。相比現(xiàn)有的白酒檢測方法,LC-MS結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢。

為了研究分析鑒定真假白酒的新方法,本文對某知名酒廠白酒的不同系列酒樣和假酒進(jìn)行檢測分析和多成分統(tǒng)計(jì)分析,顯示LC-MS結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)是鑒定真假白酒的有效方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

由知名白酒品牌廠商提供的白酒樣品:H系列酒樣,Y系列酒樣,S系列酒樣,以及三個系列對應(yīng)的假酒樣品(假酒樣品來源為廠商收繳所得的市場假冒商品),和該酒廠的基酒酒樣。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)美國Agilent公司:配有Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6538-UHD質(zhì)譜,配有電噴霧離子源,飛行時間質(zhì)量分析器,霧化器為氮?dú)?、工作站配有Agilent Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件;實(shí)驗(yàn)用水實(shí)驗(yàn)室自制超純水,Millipore Simplicity超純水系統(tǒng)上海彤迪科學(xué)儀器有限公司;用于高效液相色譜儀的甲酸、乙腈、氫氧化銨均為色譜純德國CNW科技公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

9個真酒和假酒的樣品分別取5 mL,在3000×g、25 ℃條件離心10 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,處理好的樣品用帶蓋玻璃離心管貯存于4 ℃冰箱備用。

樣品檢測的LC-MS條件列入表1。

表1　LC-MS實(shí)驗(yàn)參數(shù)表Table 1　LC-MS experimental parameters

1.3數(shù)據(jù)處理

LC-MS數(shù)據(jù)的歸一化,特征識別使用基于R[9]的XCMS[10]軟件包,模式識別方法HCA,PCA,PLSDA,使用MetaboAnalyst3.0[11]。其他統(tǒng)計(jì)分析由R軟件[9]完成。

2　結(jié)果與討論

2.1真酒和假酒的LC-MS分析

H系列酒樣,Y系列酒樣和S系列酒樣經(jīng)處理后,在優(yōu)化設(shè)定LC-MS條件下得到樣品總離子流圖(圖1)。

圖1　白酒樣品LC-MS總離子流圖Fig.1　Total ion chromatogram of liquor samples under the condition of LC-MS

基于代謝組學(xué)技術(shù),使用基于R的XCMS軟件包對LC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行了數(shù)據(jù)完整性檢查和缺失值填充的數(shù)據(jù)預(yù)處理。

表2顯示9個白酒樣品從LC-MS得到的化合物信號峰在1851～2236之間,消除錯誤和極小峰,進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾,得到有效的1428個信號峰,暗示著真假白酒相關(guān)化合物約700個。

表2　基于LC-MS的白酒樣品化合物相關(guān)信號峰Table 2　Compounds related signal peak of the liquor samples under the condition of LC-MS

另外,進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理(圖2),歸一化通過除以比例因子,將白酒樣品化合物相關(guān)信號峰中所得離子濃度同時縮放,使得不同酒樣的整體濃度水平恢復(fù)到相同的水平,以此放大被掩蓋的信號峰。創(chuàng)新性的將LC-MS分析技術(shù)和代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于白酒真假鑒定中。LC-MS可以更加充分的分析白酒酒體構(gòu)成,獲得盡可能多的化合物數(shù)據(jù),樣品無需冷凍干燥處理,白酒樣品經(jīng)過離心和微孔濾膜處理后能直接進(jìn)行LC-MS分析,樣品預(yù)處理簡單而迅速。LC-MS檢測分析白酒樣品60 min,主要物質(zhì)的保留時間是1～55 min,能分析約700種化合物,分析過程高效快捷。

圖2　歸一化數(shù)據(jù)處理的白酒樣品化合物相關(guān)信號峰Fig.2　Normalized data processing of liquor samples compounds related signal peak

2.2白酒樣品LC-MS相關(guān)化合物分層聚類分析

聚類分析是一種無監(jiān)督的模式識別方法,對于樣品的判別不進(jìn)行預(yù)設(shè)的分組,對于測試數(shù)據(jù)的有效性驗(yàn)證,有價值信息的挖掘,預(yù)測模型的建立都是一種有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)工具。涉及白酒的鑒定方面,所得到的分析圖更是直接鮮明的得到真假白酒的區(qū)別[12]。

從圖3中可以看到,第一級聚類就把真酒和假酒樣品明顯的區(qū)分開了,這印證了該方法具有直觀的分辨效果。在假酒的三個樣品中,把S系列酒樣的假酒和Y系列酒樣的假酒歸為了一類,說明這兩瓶假酒具有相似性。真酒酒樣中同一系列的H1,H2和Y1,Y2各自被分為了同一類聚類,說明分層聚類分析的結(jié)果很好的把同一系列的不同批次的酒樣歸為一類,和實(shí)際的酒樣信息吻合長方形區(qū)域右側(cè)的數(shù)據(jù)值,為聚類分析所得白酒樣品特征片段的質(zhì)荷比/保留時間,其中顏色深代表該特征片段對應(yīng)的化合物含量高,顏色淺代表其含量低?？梢钥吹交茦悠贩衷谡婢频念悇e當(dāng)中,但是被單獨(dú)歸為一類,其化合物組成也較為特殊,是酒樣品中比較獨(dú)立的類別。

圖3　白酒樣品LC-MS相關(guān)化合物分層聚類 分析熱投射圖(HEAT-MAP)Fig.3　The hierarchical clustering analysis results of thermal projection diagram(HEAT-MAP)注:熱圖上端灰色長方形區(qū)域(HF,YF,SF)代表假酒, 黑色長方形區(qū)域(JICHU,S1,H1,H2,Y1,Y2)代表真酒。

2.3白酒樣品LC-MS相關(guān)化合物主成分分析

PCA是一種基于最大統(tǒng)計(jì)學(xué)距離投影的降維方法,使用少量的綜合變量(主成分)來取代原先的復(fù)雜多變量從而能在最大程度保留數(shù)據(jù)原有信息的情況下,降低數(shù)據(jù)復(fù)雜度,同時對數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理[13]。

從圖4中可以看出,同一95%置信區(qū)域(Hotelling T2test)即淺色和深色橢圓區(qū)域,顯示假酒樣品和真酒樣品得到了明顯的區(qū)分,同時假酒里面S系列和Y系列的假酒較為相似,這和聚類分析的結(jié)果一致。而真假的三個系列中,H1、H2兩瓶酒位置基本重疊,Y1、Y2位置也基本接近,可得該方法對同系列不同批次的酒樣檢測的穩(wěn)健性,而S系列酒樣,和Y系列酒樣很接近,可推斷它們的酒體結(jié)構(gòu)上有一定的相似性。比較明顯的是基酒,未被分類為假酒,離真酒樣品集中區(qū)域也有一定距離,可推斷基酒是酒廠酒樣中比較特殊和獨(dú)立的酒體系,這一信息也得到了酒廠的證實(shí)。結(jié)果分析可表明這種代謝組學(xué)技術(shù)可以很好地應(yīng)用在白酒的真假酒區(qū)分和品質(zhì)鑒定中。

圖4　白酒樣品LC-MS相關(guān)化合物主成分分析圖Fig.4　Principal component analysis of liquor samples

2.4白酒樣品LC-MS相關(guān)化合物偏最小二乘判別分析

為了進(jìn)一步對特征化合物進(jìn)行發(fā)現(xiàn)和篩選,引出一種有監(jiān)督模式的識別方法,偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。和PCA相似,PLS-DA也是基于降維的多維向量分析方法,但是可以預(yù)設(shè)分類,其優(yōu)勢是可以盡量去除未控制變量對數(shù)據(jù)分析的影響,進(jìn)一步挖掘數(shù)據(jù)中的信息,同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度[14]。

圖5　白酒樣品LC-MS相關(guān)化合物PLS-DA圖Fig.5　PLS-DA and chart

圖6　去除基酒后的PLS-DA圖Fig.6　PLS-DA after removal of base liquor and chart

考慮到基酒體系的獨(dú)立性,所以在有監(jiān)督模式下去除了基礎(chǔ)酒,這樣可以更突出真假白酒之間的物質(zhì)區(qū)別。刪除基酒后,真酒被分在了很集中的一個區(qū)域,更能凸顯真酒的物質(zhì)特征。同時在再一次驗(yàn)證了基礎(chǔ)酒是較為獨(dú)立和特殊的。該方法的運(yùn)用不僅可以迅速建立真假鑒別模型,還可以給不同檔次類型的酒樣建立對應(yīng)數(shù)據(jù)模型,更加豐富了白酒研究內(nèi)容。

VIP(變量重要性得分值)越高的片段,越能表現(xiàn)真假白酒之間的區(qū)別[15],選取了前25個特征片段。黑色方塊代表該碎片含量高,對應(yīng)的灰色方塊代表含量低。從圖7中可得,344.3/1013片段,其VIP得分值在1.895,在假酒中含量很高,在真酒中含量較低。而另一個141.1/215片段該碎片在真酒中含量很高,在假酒中含量較低。對應(yīng)的特征片段或特征化合物可作為識別真假白酒的特征物質(zhì)。這類化合物的具體鑒定,需要在LC-MS實(shí)驗(yàn)過程中加入標(biāo)準(zhǔn)品確定。變量重要性(VIP)圖,可以將真假白酒的特征化合物分析由圖譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相關(guān)的特征片段,這些特征片段不但能區(qū)分真假白酒也對白酒口感和風(fēng)味研究具有重要意義。

圖7　白酒樣品化合物(片段)重要性(VIP)示意圖Fig.7　Vriable importance(VIP)figure of liquor samples注：黑色代表含量高,灰色代表含量低。

3　結(jié)論

本文創(chuàng)新性的將LC-MS分析技術(shù)和代謝組學(xué)

技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于白酒真假鑒定中,樣品無需冷凍干燥處理,LC-MS檢測分析過程高效快捷。所得數(shù)據(jù)集經(jīng)代謝組學(xué)技術(shù)降維處理,在聚類分析和主成分分析中,真酒和假酒清晰地分為兩類,實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全符合實(shí)際酒樣信息。利用偏最小二乘判別分析迅速建立酒類相關(guān)模型,極大豐富該品牌白酒研究體系。得出變量重要性(VIP)圖,將真假白酒的特征化合物分析由圖譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為相關(guān)的特征片段,這些特征片段不但能區(qū)分真假白酒也對白酒口感和風(fēng)味研究具有重要意義。

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Identification of true and fake Chinese liquors by LC-MS with metabolomics technology

XIONG Yue-feng1,CHEN Shan-qiao1,TAO Jia-jia1,XIAO Xin-feng1,NI Ling1,BAO Bin1,2,WU Wen-hui2,3,*

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Institute of Marine Science,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Shanghai Aquatic Products Processing and Storage Engineering Technology Research Center,Shanghai 201306,China)

To design a new analysis method to identify true and fake Chinese liquors.Centrifugal filtering method was used to deal with some well-known Chinese different series of liquor and their corresponding wine liquor samples,by analyzing liquor compound information using a LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)and the true and fake Chinese liquors data dimension was a reduction processing through statistical analysis using metabolomics data analysis based on pattern recognition method.The impact of this new method was investigated in order to distinguish true and fake liquor samples group.In order to distinguish true and fake liquor samples,LC-MS experimental data by the level of clustering analysis(Cluster Analysis)were formed between the three kinds of different varieties of Chinese liquors by way of a real wine clustering information of sample information.PCA(Principle Component Analysis)method was also used to distinguish the true and fake of liquor samples from the same product of different by the 95% confident region revealed by Hoteling T2test.PLS-DA Analysis(Partial Least Squares-Discriminate Analysis)method from the characteristic of compound MS information display showed a narrow area for true wine liquor than fake liquor samples.In conclusion,LC-MS with metabolomics technology was an effective method for identification of true and fake Chinese liquors.This method not only can distinguish true and fake liquors,also can reflect the different series in the degree of similar compounds and its characteristic information of wine.

true and fake Chinese liquors;LC-MS;PCA;cluster analysis;PLS-DA

2015-10-14

熊月豐(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：食品分析檢測，E-mail:yuefengeric@163.com。

吳文惠(1965-)，男，博士，教授，研究方向：海洋藥物化學(xué)，E-mail:whwu@shou.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81341082)；上海市科委工程中心建設(shè)(11DZ2280300)。

TS262.3

A

1002-0306(2016)09-0331-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.056