李翔宇,柴莎莎,向　麗,舒　敏,肖　敏,董長春,杜明立,汪志明

(嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司 湖北省營養(yǎng)化學品生物合成工程技術研究中心,湖北武漢 430223)

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HPLC-MS測定多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中的壬基酚

李翔宇,柴莎莎,向麗,舒敏,肖敏,董長春,杜明立,汪志明*

(嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司 湖北省營養(yǎng)化學品生物合成工程技術研究中心,湖北武漢 430223)

建立了多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中壬基酚的液相色譜-電噴霧質譜(LC-ESI-MS/MS)檢測方法。樣品經環(huán)己烷∶乙酸乙酯(1∶1,v/v)提取,低溫冷凍離心凈化,液相色譜-電噴霧質譜測定,內標法定量。通過正交實驗優(yōu)化了樣品提取條件,最佳提取條件為提取次數(shù)為1次、超聲15 min、稱樣質量為1.5 g,渦旋時間20 s。檢出限為0.3 μg/kg,線性范圍1～150 ng/mL(r=0.9998),樣品測定結果為36.21～123.98 μg/kg,樣品回收率為94.6%～108.1%,RSD=3.9%～14.3%(n=6)。該法簡便快捷、結果準確,可用于多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中壬基酚的分析測定。

壬基酚,液相色譜-電噴霧質譜,多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑

壬基酚(Nonylphenol,NP)是一種內分泌干擾物,其對人體癌細胞增長及生殖能力均會產生嚴重的影響,壬基酚一旦進入生物體內之后,就會影響生物體正常的生殖和發(fā)育[1-2]。

壬基酚是重要的化工原料,作為增塑劑和表面活性劑原料等被廣泛用于各種產品[3-4],可通過多種途徑污染食品,其親脂性較強,易在高脂肪、高蛋白的動物性食品中富集[5-6]。

多不飽和脂肪酸主要包含二十二碳六烯酸(DHA,Docosahexaenoic Acid)及二十碳四烯酸(ARA,Arachidonic Acid)兩種,是嬰幼兒奶粉中不可或缺的營養(yǎng)物質。DHA、ARA在視網膜和大腦皮質中含量豐富,對視網膜和大腦功能具有重要的作用[7],特別是對嬰兒的視力和大腦發(fā)育非常重要[8-9]。NP廣泛存在于肉、蛋和奶等基質中,其中奶粉和液奶的污染較為嚴重,作為奶粉的重要配料,多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑的質量控制備受奶粉制造企業(yè)的關注[10]。本文通過一系列實驗對樣品前處理進行了優(yōu)化研究,采用液相色譜-串聯(lián)質譜法,能快速準確的測定多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中的壬基酚,為壬基酚污染監(jiān)控打下重要基礎。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

甲醇、乙酸乙酯、環(huán)己烷,為LC-MS級美國Fisher公司;4-NP標準品(純度100%),同位素內標4-n-NP-d4(純度98.9%)加拿大CDN isotopes公司;色譜柱安捷倫poroshell 120 EC-C18柱(50 mm×4.6 mm,2.7 μm);不同批次的多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑(DHA含量在39%～40%左右)嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司提供。實驗用水Milli-Q 超純水.

Agilent1260高效液相色譜儀美國Agilent公司,QTRAP4500質譜儀美國Sciex公司,冷凍離心機美國sigma公司,氮吹儀上海安譜科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制準確稱取20 mg標準品,用甲醇定容至100 mL,配成標準儲備溶液,置于-20 ℃下保存。吸取1 mL壬基酚標準儲備液,用甲醇定容至100 mL,作為標準中間液。使用時將標準中間溶液稀釋為合適濃度。

1.2.2樣品提取稱取微膠囊粉劑產品1.0 g(精確到0.0001 g)于15 mL玻璃離心管中,加入10 mL乙酸乙酯∶環(huán)己烷混合溶液(1∶1,v/v)[11],加入4-n-NP-d4內標100 μL,渦旋20 s,超聲提取15 min,6000 r/min離心15 min,取上清液5 mL于氮吹管中,60 ℃水浴氮吹干,定容至2 mL,-10 ℃冷凍離心12000 r/min離心15 min后取上清于進樣瓶中供液質分析。根據之前預實驗的單因素結果發(fā)現(xiàn)稱取樣品的質量、提取次數(shù)、渦旋時間和超聲時間對提取結果的影響最大,并由此確定了因素水平。正交實驗因素及水平表見表1。選取超聲時間、提取次數(shù)、渦旋時間和稱取質量,以回收率為目標值,進行正交實驗,確定樣品提取的最佳條件。

表1　正交實驗因素及水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal test

實驗中所用的均為玻璃器皿,使用前在馬弗爐中400 ℃烘烤4 h[12],液相色譜串聯(lián)質譜儀的管線均為不銹鋼或聚四氟乙烯材質。標準品和實際樣品測試需要做試劑空白。

1.2.3液相色譜流動相:甲醇-純水梯度洗脫,梯度條件表見表1,流動相A為純水,流動相B為甲醇;進樣量:5 μL;流速:0.6 mL/min,柱溫:(40±1)℃。

表2　色譜分離梯度條件Table 2　The chromatography separation conditions

1.2.4質譜條件采用電噴霧離子源正離子掃描;離子化電壓,3500 V;加熱溫度600 ℃;噴霧氣,55 psi;輔助加熱氣,55 psi。采用多反應監(jiān)測具體的離子采集參數(shù)見表3。

表3　多反應監(jiān)測具體的離子采集參數(shù)Table 3　The parameter of Multiselected reaction monitoring

2　結果與討論

2.1樣品提取條件優(yōu)化

多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑為基質復雜的樣品,其中包括蛋白、油脂、乳糖等。若提取的不徹底,將對檢測結果有較大的影響。乙酸乙酯-環(huán)己烷體系能夠有效的沉淀蛋白,溶解壬基酚。選取影響提取結果的四個主要因素超聲時間、提取次數(shù)、渦旋時間和稱取質量,以回收率為目標值,進行正交實驗,通過正交實驗確定樣品提取的最佳條件。實驗因素水平、正交實驗設計及結果分析見表4。由表4可知:各因素主次順序為:C(稱樣質量/g)>A(提取次數(shù)/次)>B(超聲時間/s)>D(渦旋時間/s),最佳條件為A1B2C3D2即提取次數(shù)為1次、超聲15 min、稱樣質量為1.5 g,渦旋時間20 s。經實驗驗證,此最佳條件下回收率達到98.6%,并且重現(xiàn)性較好,三個平行樣間的RSD為8%。

表4　正交實驗設計及結果分析Table 4　The orthogonal experiment design and result analysis

2.2樣品的凈化條件

由于壬基酚在環(huán)境中普遍存在,塑料器皿或者橡膠制品等都可能遷移出大量的壬基酚,這些對分析結果將會造成較大的干擾[13]。通過實驗用一次性注射器吸取少量的甲醇溶液通過0.22 μm有機系濾膜和不過膜直接進樣對比發(fā)現(xiàn),接觸注射器和濾膜后明顯有壬基酚溶出,因此不能直接過膜。不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中含有部分油脂,經樣品提取后未能完全與壬基酚分開,因此凈化時還需要去除油脂。經實驗發(fā)現(xiàn)固相萃取小柱也會發(fā)生壬基酚溶出現(xiàn)象,因此也不能選擇固相萃取作為凈化方式。

考慮到上述影響因素,參考其他資料發(fā)現(xiàn)[14],低溫冷凍可以很好地去除油脂。因此可以使用低溫冷凍高轉速離心,離心后觀察到有明顯的油脂析出,經實驗確定了最佳離心條件,低溫-10 ℃,12000 r/min離心15 min取上清,這樣不過膜也可以有效地去除油脂及其他雜質。使用純甲醇進樣和經低溫冷凍后的純甲醇進樣,發(fā)現(xiàn)壬基酚并沒有明顯增加,具體結果見圖1。

圖1　樣品MRM色譜圖Fig.1　Chromatograms of samples under MRM mode

圖1中A為純甲醇的色譜圖,B為經低溫冷凍離心后的純甲醇的色譜圖,由圖1可以看出,冷凍離心過程幾乎不會引入壬基酚,不會對樣品結果造成影響。這種方式快捷簡便的實現(xiàn)了對樣品的凈化。

2.3色譜及質譜條件

比較了甲醇-水和乙腈-水兩種流動相體系,發(fā)現(xiàn)甲醇-水為流動相時壬基酚和內標物質的響應值較高,是乙腈-水為流動相的3～6倍,故選用甲醇-水為流動相。選擇ESI負離子模式下進行一級質譜掃描,得到壬基酚的分子離子峰m/z 219.1,以m/z 219.1作二級質譜,并優(yōu)化質譜條件,具體見 1.2.4。以豐度較高133.0的作為定量離子,豐度較低146.9的作為定性離子并采用多反應監(jiān)測(MRM)模式進行定性定量計算。圖1為壬基酚及內標的MRM色譜圖,保留時間為4.22 min的為目標物壬基酚的峰,保留時間為4.40 min為內標的峰。

圖2　壬基酚及內標的MRM色譜圖Fig.2　Chromatograms of NP and internal standard under MRM mode

2.4線性范圍和定量限

配制質量濃度為0.5～200 ng/mL的系列標準工作液,內標濃度均為20 ng/mL。以目標組分峰面積與相應內標峰面積的比值X對相應濃度Y(ng/mL)進行線性回歸,線性回歸方程為y=0.5866x-0.0374,線性范圍為1～150 ng/mL,在線性范圍內相關系數(shù)(r)為0.9998。以加標樣品中待測化合物色譜峰的信噪比等于3(S/N=3)對應的濃度為方法的檢出限(LOD),S/N=10對應的濃度為方法的定量限(LOD),最終確定樣品中LOD為0.3 μg/kg,LOQ為1.0 μg/kg。

2.5重復性

取三個不同批次配方不同的微膠囊粉劑樣品,每個樣品設六個平行,分別測定并計算樣品的壬基酚含量和相對標準偏差(RSD),結果見表5,說明方法的重復性良好。

表5　重復性結果Table 5　Results of repeatability

2.6穩(wěn)定性

取微膠囊粉劑樣品,經過提取和凈化后得到待檢測樣品溶液,分別放置0、2、4、8、12 h后,上機進樣,連續(xù)進6次,樣品測試結果的RSD為11.45%,表明樣品在12 h內穩(wěn)定。

2.7回收率和精密度

取三個不同批次的樣品(配方不同),在基質中添加不同量的標準溶液,加標水平分別為5,50,100 μg/kg,每個水平設6個平行,計算三個樣品的回收率和RSD,結果見表6。表6為回收率測定結果,其三個加標水平測定結果在94.6%～108.1%之間。

表6　回收率測定結果Table 6　Determination results of recovery

3　結論

采用HPLC-MS/MS的檢測技術,建立了微膠囊粉劑中的壬基酚檢測方法。該方法簡便、快速,具有較高的靈敏度和準確度。該方法的建立為多不飽和脂肪酸微膠囊粉劑中的壬基酚監(jiān)控打下堅實基礎。

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Determination of Nonylphenol in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder by liquid chromatography tandem mass spectrometry

LI Xiang-yu,CHAI Sha-sha,XIANG Li,SHU Min,XIAO Min,DONG Chang-chun,DU Ming-li,WANG Zhi-ming*

(CABIO Bioengineering(Wuhan)Co.,Ltd Hubei Province Nutrition Chemicals Biosynthetic Engineering Technology Research Center,Wuhan 430223,China)

A sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry method(LC-MS/MS)was developed for the determination of Nonylphenol(NP)in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder.The Nonylphenol in samples was extracted with the mixture of cyclohexane and ethyl acetate(1∶1,v/v).The extractions were purified by centrifuge with low temperature and LC-MS/MS analysis was performed by positive ion electrospray ionization applying multiple reaction monitoring with internal standard method for quantitative analysis.The condition of the sample extraction was optimized by the orthogonal experiment.The optimized fermentation conditions were found to be:extraction 1 time,ultrasonic time 15 min,1.5 g samples and vortex time 20 s.The limits of quantitation(LOQ)was 0.3 μg/kg,and the method showed good linearity between 1～150 ng/mL(r=0.9998).The results of the samples were 36.21～123.98 μg/kg.The recoveries were between 94.6% to 108.1% and RSD were between 3.9% to 14.3%.The method was simple,quick and accurate.The method was proved to be appliable in the determination of NP in polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder.

Nonylphenol;HPLC-ESI-MS;polyunsaturated fatty acids microencapsulated powder

2015-11-05

李翔宇(1979-),男,碩士,高級工程師,研究方向:營養(yǎng)化學品,E-mail:xiangyu_lee@cabio.cn。

汪志明(1969-),男,本科,高級工程師,研究方向:生物化工、脂質研究、營養(yǎng)化工,E-mail:jimmy_wang@cabio.cn。

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)項目資助(2014AA021701)、(2014AA021703)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)09-0323-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.054