崔媛媛，張禎，李熠，李霽昕，陳永浩，張煜，把靈珍，蔣玉梅*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)中心，甘肅 蘭州，730070)2(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京，100093)

蜂蜜酒是由蜂蜜加水稀釋、調(diào)整成分后經(jīng)酵母發(fā)酵而成的一種酒精飲料[1]。由于蜂蜜香氣半衰期短，陳釀后蜂蜜酒香氣不足，感官品質(zhì)不能滿足消費者需求，一般通過添加香料或果、蔬汁改善蜂蜜酒的色澤、香氣和口感[2]。沙棘果實含有豐富的維生素、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)、黃酮等營養(yǎng)活性物質(zhì)，是一種藥食同源的食品加工原料[3]。沙棘原漿與油菜蜜按一定比例復(fù)配后進(jìn)行發(fā)酵，既可改善蜂蜜酒香氣寡淡、酸度低、酒體弱的缺陷，又可解決沙棘原漿直接發(fā)酵時糖分不足、酸度高、口感酸澀的問題。

隨著消費者對飲料健康性關(guān)注度的增加，低醇發(fā)酵飲料的市場需求不斷擴(kuò)大。低醇發(fā)酵飲料酒精含量低，陳釀和貯存過程容易滋長微生物，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降或酸敗。二氧化硫是果酒生產(chǎn)常用的抑菌、抗氧化劑，但易引發(fā)過敏，影響人體健康。超高壓(high hydrostatic pressure，HHP)作為一種食品非熱加工新技術(shù)，在常溫或低溫下利用100 MPa以上的壓力，通過水或其他介質(zhì)傳遞高壓給樣品，改變微生物的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞壁的生物聚合物和非共價鍵，抑制酶活性并殺滅細(xì)菌和其他微生物[4]，在食品抑菌、酒類催陳、活性物質(zhì)提取等領(lǐng)域有較多的研究和應(yīng)用。

研究以沙棘原漿和油菜蜜為原料，通過發(fā)酵、加硫或HHP處理制備低醇沙棘蜂蜜酒，以完成發(fā)酵樣品為對照，分析加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒理化、色澤和香氣品質(zhì)的影響，探討HHP技術(shù)在低醇沙棘蜂蜜酒制備中的應(yīng)用優(yōu)勢，以期為蜂蜜酒新產(chǎn)品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供科學(xué)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 釀酒原料

沙棘原漿[還原糖含量(68.5±0.41) g/L，pH (2.84±0.01)]，甘肅隴源紅生物科技有限公司；油菜蜜[還原糖含量(751.00±41) g/L]，采自四川成都平原；酵母[商業(yè)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Aroma White]，意大利Enartis公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Scientific 265079 GC-MS，DB-WAX色譜柱(60 m×2.5 mm，0.25 μm)，美國Thermo Scientific公司；固相微萃取頭，DVB/CAR/PDMS(50/30 μm)，美國Surpelco公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 低醇沙棘蜂蜜酒釀造工藝流程

低醇沙棘蜂蜜酒釀造工藝如下：

油菜蜜→加水稀釋→滅菌→復(fù)配沙棘原漿→添加酵母→發(fā)酵→澄清處理→加硫或HHP處理→裝瓶→低醇沙棘蜂蜜酒

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 發(fā)酵醪制備

油菜蜜加水稀釋，攪拌均勻，80 ℃水浴20 min滅菌，降至室溫，添加沙棘原漿[V(沙棘原漿)∶V(蜂蜜)∶V(水)=1∶2.8∶15.2]?？扇芄绦挝锖?18.4±0.0)°Brix，pH值3.52±0.01，總酸含量(4.59±0.05)g/L(以酒石酸含量計)。

1.2.2.2 酵母的添加

釀酒酵母于(38±0.1)℃活化30 min，加入發(fā)酵醪，添加量為300 mg/L。

1.2.2.3 酒精發(fā)酵

(25±2)℃發(fā)酵，每24 h測定酒精度，酒精度達(dá)到6 %vol，終止發(fā)酵。

1.2.2.4 澄清處理

添加復(fù)合澄清劑1.2 g/L[V(2%殼聚糖溶液)∶V(2%明膠溶液)=2∶1]，40 ℃處理50 min，室溫靜置12 h，在4 000 r/min離心、過濾。制得對照樣和試驗酒樣。

1.2.2.5 抑菌處理

加硫處理：添加60 mg/L的SO2抑菌(以亞硫酸計)；4 ℃貯存1周后，分析檢測；

HHP處理：參照課題組前期試驗確定的最優(yōu)超高壓條件，于25 ℃，200～400 MPa變壓處理18 min(高壓時間∶低壓時間=2∶1)；4 ℃貯存1周后，分析檢測。

參照GB 4789.2—2016測定酒樣菌落總數(shù)<50 CFU/mL，符合QB/T 5476—2020對果酒的品質(zhì)和衛(wèi)生要求，進(jìn)而對酒樣進(jìn)行品質(zhì)分析。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 理化指標(biāo)測定

可溶性固形物、總酸、pH、酒精度參照GB/T 15038—2006測定。

1.2.3.2 CIELAB顏色參數(shù)測定

參照李寧寧等[5]的方法，紫外-可見分光光度計，以蒸餾水為參比，使用2 mm光程比色皿測定，掃描范圍為400～700 nm，掃描間隔為1 nm。計算CIELAB顏色參數(shù)L*(亮度)、a*(紅/綠色度)、b*(黃/藍(lán)色度)、色度、色調(diào)。

1.2.3.3 香氣成分分析

參照魯榕榕等[6]的方法并略有改動。

富集萃取：準(zhǔn)確吸取6 mL樣品于20 mL頂空瓶中，分別加入10 μL的(2-辛醇82.92 μg/L)、1-辛烯-3-酮(82.92 μg/L)、3-羥基己酸乙酯(248.76 μg/L)為內(nèi)標(biāo)，1 g NaCl，密封，40 ℃恒溫30 min，插入固相微萃取頭，磁力攪拌下萃取30 min，于GC進(jìn)樣口230 ℃下解析10 min，GC-MS分析。

GC條件：進(jìn)樣口溫度230 ℃；不分流進(jìn)樣，50 ℃保持10 min，以3.0 ℃/min升至180 ℃，保持 6 min；載氣(He)；流速1 mL/min。

MS條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；連接桿溫度180 ℃；離子源溫度250 ℃；質(zhì)譜掃描范圍m/z50～350。

定性：NIST譜庫檢索，結(jié)合相對保留指數(shù)(retention index，RI)定性。RI根據(jù)組分保留時間以及正構(gòu)烷烴(C6～C21)在相同色譜條件下的保留時間計算，同時與NIST、Wiley質(zhì)譜庫的相對保留指數(shù)對比，差值絕對值小于100的組分可定性為該化合物。

定量：混合內(nèi)標(biāo)半定量，香氣成分含量、香氣成活性值(odor activity value,OAV)計算如公式(1)、公式(2)所示：

香氣成分含量/(μg·L-1)

(1)

(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

Microsoft Excel 2019統(tǒng)計，SPSS Statistics 25.0顯著性分析(Duncan法，P<0.05)，Origin 2018繪圖，Metabo Analyst 5.0主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘法(partial least squares-discriiminate analysis,PLS-DA)進(jìn)行判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒可溶性固形物、pH、總酸的影響

酒樣pH值、總酸含量和可溶性固形物含量比較可知(表1)，可溶性固形物含量沒有顯著性變化(P>0.05)；HHP處理酒樣pH值、總酸含量與對照酒樣差異不顯著(P>0.05)，加硫處理酒樣pH值顯著降低、總酸含量顯著增大(P<0.05)，可能是由于加硫處理添加的偏重亞硫酸鈉，水溶液呈酸性，酒樣總酸含量增加，pH值降低[7]。HHP處理對樣品的糖酸含量影響較小，這與于佳琦等[8]的研究一致，優(yōu)于加硫處理酒樣。

表1 沙棘蜂蜜酒的可溶性固形物、pH和總酸Table 1 Soluble solids, pH and total acid of sea-buckthorn mead

2.2 加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒色澤品質(zhì)影響

類胡蘿卜素是沙棘漿果呈現(xiàn)亮麗橙色的主要色素，其含量和構(gòu)成影響沙棘蜂蜜酒的色澤品質(zhì)。由酒樣色澤品質(zhì)分析可知(表2)，與對照酒樣相比，加硫處理酒樣L*值、a*值、b*值和色調(diào)值沒有顯著變化，色度值顯著增加了2.48%(P<0.05)；HHP處理酒樣L*值(亮度)、a*值(紅綠度)和色調(diào)值沒有顯著變化(P>0.05)，但色度值顯著增加了4.0%，b*值(黃藍(lán)度)顯著增加1.84%(P<0.05)，說明HHP處理后酒樣顏色更加鮮艷飽滿，優(yōu)于加硫處理和對照酒樣。HHP處理會引起β-胡蘿卜素晶體分子間范德華力碰撞，π軌道電子斷裂并導(dǎo)致類胡蘿卜素的異構(gòu)化[9]，使類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)改變，同時HHP處理會促使附著在細(xì)胞壁聚合結(jié)構(gòu)上或嵌在胞間細(xì)胞器中的類胡蘿卜素釋放到基質(zhì)中[10]，這可能是導(dǎo)致HHP處理酒樣b*值和色度值增加的原因。

表2 沙棘蜂蜜酒的色澤指標(biāo)Table 2 Color indicators of sea-buckthorn mead

2.3 加硫和HHP處理對沙棘蜂蜜酒香氣構(gòu)成的影響

2.3.1 沙棘蜂蜜酒香氣組分定性、定量分析

香氣是影響沙棘蜂蜜酒風(fēng)味和品質(zhì)的重要因素。頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析檢測試驗酒樣香氣化合物組成(圖1，附表1，表中香氣類型參考馬騰瑧等[11]、孫寶國[12]進(jìn)行描述)，試驗酒樣共定性、定量88種香氣化合物，主要包括36種酯類、15種醇類、9種脂肪酸類、9種萜烯類、7種醛酮類。HHP處理酒樣定性76種香氣化合物，與對照酒樣共有組分64種。加硫處理酒樣共定性73種香氣化合物，與對照酒樣共有組分60種。3種酒樣的香氣物質(zhì)種類、含量均存在較大差異。HHP處理酒樣香氣總含量13 505.38 μg/L，加硫處理酒樣香氣總含量7 878.6 μg/L，分別較對照酒樣(10 512.2 μg/L)增加了28.47%和減少了25.05%。

附表1 沙棘蜂蜜酒香氣化合物Enclose Table 1 Aroma components in sea-buckthorn mead

續(xù)附表1

圖1 沙棘蜂蜜酒中香氣物質(zhì)含量的變化Fig.1 Changes in contents of aroma compounds in sea-buckthorn mead注：圖中標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)

2.3.2 酒樣香氣構(gòu)成比較分析

酯類物質(zhì)是沙棘蜂蜜酒香氣的主要貢獻(xiàn)者，酒樣共檢測到36種，HHP處理酒樣32種、加硫酒樣34種、對照酒樣30種。種類沒有明顯差異，但含量差異顯著，與對照酒樣(9 265.38 μg/L)相比，加硫處理酒樣含量(6 127.5 μg/L)減少了33.87%，其中乙酸酯減少19.32%、乙酯減少35.79%、其他酯減少42.39%；HHP處理酒樣含量(11 549.43 μg/L)較對照增加了24.65%，其中乙酸酯減少21.40%、乙酯增加16.8%、其他酯增加88.24%，DAZ-MAROTO等[13]提出，在葡萄酒陳釀過程中，乙酯類香氣物質(zhì)含量增加，高壓處理后乙酯類物質(zhì)含量增加，說明HHP處理對酒樣具有一定的催陳作用。HHP處理酒樣酯類物質(zhì)含量顯著高于加硫處理和對照酒樣，一方面可能是因為高壓促進(jìn)了酯合成酶的催化作用[14]，另一方面可能來自HHP處理對反應(yīng)物的壓縮效應(yīng)及高壓物理能對化學(xué)鍵有影響[15]，進(jìn)而促進(jìn)了酯類物質(zhì)的合成。

酒樣共檢測出7種醛酮類物質(zhì)。HHP處理酒樣4種、加硫酒樣4種、對照酒樣6種。加硫酒樣(14.64 μg/L)與對照酒樣(15.47 μg/L)的含量沒有顯著性差異，HHP處理酒樣(6.09 μg/L)與對照酒樣相比減少了60.63%，壬醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛在HHP處理酒樣中沒有檢測到，可能是因為高壓可促使醛氧化為酸類物質(zhì)[16]。2-壬酮(2.07 μg/L)是超高壓處理酒樣中獨有的物質(zhì)，賦予酒樣果香和甜香；α-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛經(jīng)HHP處理后較對照酒樣分別增加了30.77%和13.86%，α-紫羅蘭酮是β-胡蘿卜素的降解產(chǎn)物，高壓條件會使類胡蘿卜素中的化學(xué)鍵受到破壞[17]，導(dǎo)致酒樣中類胡蘿卜素含量有所降低。醛酮類物質(zhì)可通過烴類物質(zhì)降解產(chǎn)生[18]，沙棘蜂蜜酒中醛酮類物質(zhì)較少，可能是由于醛酮類物質(zhì)的性狀不穩(wěn)定，發(fā)酵和處理過程中容易被還原成醇或酸等物質(zhì)[19]。

酒樣共檢測出9種脂肪酸類物質(zhì)，其中HHP酒樣6種、加硫酒樣8種、對照酒樣5種。對照酒樣含量127.84 μg/L，HHP處理酒樣(193.4 μg/L)較對照增加了51.28%，加硫處理酒樣(196.74 μg/L)增加了53.90%。3種酒樣中辛酸含量最高，HHP、加硫和對照酒樣含量分別為104.76、126.3、90.73 μg/L，其次是己酸，HHP、加硫和對照酒樣含量分別為30.17、27.95、23.24 μg/L。果酒中的有機(jī)酸主要是發(fā)酵過程中由高級脂肪酸分解或醇、醛氧化的產(chǎn)物[20]，在低濃度時散發(fā)出奶酪和水果的風(fēng)味，高濃度時有脂肪和腐臭味[10]。適當(dāng)濃度的短鏈酸可以帶來良好的風(fēng)味，抑制對應(yīng)芳香酯的水解，對果酒香氣平衡有重要作用[21]。試驗酒樣脂肪酸含量都低于其氣味閾值，對酒樣的香氣影響不大。

酒樣共檢測出9種萜烯類物質(zhì)，HHP處理酒樣8種、加硫處理酒樣5種、對照酒樣6種。HHP處理和對照酒樣中含量分別為27.26、23.63 μg/L，沒有顯著性差異，但加硫處理酒樣(14.88 μg/L)較對照酒樣下降了37.03%。萜烯類化合物主要是通過其非萜苷類化合物在酒精發(fā)酵過程中釋放[22]。HHP處理后芳樟醇、大馬士酮、香茅醇含量較對照酒樣增加顯著，分別增加了20.8%、45.54%、25.95%，尤其反式-橙花叔醇增加了2.56倍。這可能是HHP處理激活了糖苷酶的活性[23]，促進(jìn)芳樟醇、香茅醇糖苷化合物水解的結(jié)果。香茅醇和反式-橙花叔醇在加硫處理酒樣中未檢測出，可能是由于萜烯類物質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易受外界因素影響，發(fā)生氧化、還原等反應(yīng)導(dǎo)致了結(jié)構(gòu)改變[24]。

酒樣中共檢測出15種醇類物質(zhì)，HHP處理酒樣14種，加硫處理酒樣15種，對照酒樣13種。物質(zhì)種類沒有明顯差異，但含量差異顯著，對照酒樣含量為959.39 μg/L，HHP處理酒樣(1 528.83 μg/L)較對照增加了59.35%，加硫處理酒樣(1 392.35 μg/L)較對照增加了45.13%。含量最高的是異戊醇，在HHP、加硫和對照酒樣的含量分別為954.11、928.27、867.87 μg/L；苯乙醇經(jīng)HHP和加硫處理后含量分別為465.39、375.98 μg/L，對照酒樣未檢測到。異戊醇和苯乙醇屬于果酒中常見的醇類物質(zhì)，分別賦予酒樣果香和花香。2種處理酒樣醇類含量增加，可能是HHP或加硫處理激活了某些糖苷酶的活性，使酒樣中以糖苷類結(jié)合的醇類香氣成分得以釋放，醇類物質(zhì)通過酵母經(jīng)葡萄糖代謝途徑或氨基酸代謝途徑生成[25]，酒中適量的高級醇使酒體豐滿柔和，圓潤醇厚，增加香氣的復(fù)雜性[26]；但含量過高時，會對酒的香氣產(chǎn)生不良影響[27]以及飲后上頭的現(xiàn)象。

2.3.3 HHP處理對低醇沙棘蜂蜜酒主體香氣物質(zhì)的影響

為了進(jìn)一步探討HHP和加硫處理對低醇沙棘蜂蜜酒香氣特征的影響，對酒樣中OAV>1的香氣物質(zhì)進(jìn)行PCA和PLS-DA(圖2)。

a-沙棘蜂蜜酒香氣物質(zhì)的PCA；b-沙棘蜂蜜酒香氣物質(zhì)的PLS-DA圖2 沙棘蜂蜜酒香氣物質(zhì)的PCA與PLS-DA分析Fig.2 PCA and PLS-DA analysis of aroma substances in sea-buckthorn mead

PCA顯示(圖2-a)，主成分1(PC1)與主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率分別為68%和31.2%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到99.2%，可以反映香氣物質(zhì)的總體變化情況，第一主成分可清楚區(qū)分加硫酒樣與HHP酒樣，第二主成分可有效區(qū)分對照酒樣與加硫、HHP酒樣，說明HHP和加硫處理對沙棘蜂蜜酒香氣風(fēng)格影響較大。PLS-DA分析(圖2-b)可知，乙酸庚酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯是受抑菌處理影響最大的3個組分，它們得分均>1.0，其次是苯甲酸乙酯、大馬士酮、玫瑰醚、辛酸乙酯，除了乙酸異戊酯和己酸乙酯，其他5種物質(zhì)在HHP處理組中含量均高于其他酒樣，說明超高壓處理增強(qiáng)了酒樣果香、玫瑰花香和甜的杏仁味道。加硫處理酒樣含量最高的是正庚醇、反-2-辛烯醛，其余物質(zhì)含量均低于其他2組，說明加硫處理后酒樣香氣物質(zhì)損失較大。反-2-辛烯醛在HHP處理酒樣中沒有檢測到，青香感物質(zhì)的減少也是果酒陳釀的一種表現(xiàn)，再次證明了HHP處理對低醇沙棘蜂蜜酒有催陳和提高香氣品質(zhì)的作用。

3 結(jié)論

試驗比較分析了加硫和HHP兩種處理對低醇沙棘蜂蜜酒品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，加硫處理沙棘蜂蜜酒的pH值降低、總酸含量增大；HHP處理酒樣pH值、可溶性固形物和總酸含量沒有顯著性變化。酒樣色澤，加硫處理酒樣色度值增加；HHP處理酒樣b*值和色度值增加。處理樣品香氣總含量與對照酒樣相比，加硫處理酒樣減少了25.05%，HHP處理酒樣增加了28.47%，其中酯類含量增加了24.65%，酒體的果香和花香更加突出。HHP技術(shù)應(yīng)用于低醇沙棘蜂蜜酒生產(chǎn)，可改善酒樣的香氣和色澤品質(zhì)，是一種優(yōu)勢顯著的蜂蜜酒發(fā)酵后處理技術(shù)。