張君超,謝遠(yuǎn)紅,金君華,段慧霞,劉　慧,張紅星

(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

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產(chǎn)乳酸菌素菌株的篩選鑒定及其特性分析

張君超,謝遠(yuǎn)紅,金君華,段慧霞,劉慧,張紅星*

(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)廣西巴馬村天然發(fā)酵米粉中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定,篩選出一株具有抑菌活性的植物乳桿菌M44,并研究了其所產(chǎn)乳酸菌素的基本性質(zhì)。采用微生物形態(tài)學(xué)和16S rDNA 序列分析法鑒定菌株M44為植物乳桿菌,其發(fā)酵上清液具有抑菌活性,抑菌物質(zhì)確定為蛋白類。采用鹽析法粗提所產(chǎn)乳酸菌素,確定最佳硫酸銨沉淀濃度為60%。由乳酸菌素產(chǎn)量與菌株生長的關(guān)系實(shí)驗(yàn)得出乳酸菌素的最佳收獲時(shí)間為發(fā)酵培養(yǎng)12 h。管碟法抑菌實(shí)驗(yàn)表明,該乳酸菌素在pH范圍 2～8時(shí)有良好的抑菌活性;121 ℃處理 15 min 后仍具有抑菌活性;胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后抑菌性消失;對(duì)單核增生李斯特細(xì)菌、大腸桿菌、沙門氏菌,金黃色葡萄球菌均有抑制作用。該乳酸菌素為天然生物防腐劑的開發(fā)與應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

植物乳桿菌,細(xì)菌素,分離純化,抑菌特性

食品中含有豐富的營養(yǎng)成分,在加工、貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中很容易被微生物侵染,從而發(fā)生腐敗變質(zhì)甚至引起食物中毒,危害消費(fèi)者健康。目前食品防腐的方式有添加化學(xué)防腐劑和物理殺菌,但化學(xué)防腐劑對(duì)人體健康的影響以及物理殺菌成本高,影響食品品質(zhì)的特點(diǎn)都使其應(yīng)用受到限制[1]。這導(dǎo)致既能確保食品的微生物安全性也能賦予食品更高的營養(yǎng)價(jià)值的天然防腐劑逐漸成為食品防腐保鮮的研究熱點(diǎn)[2]。

乳酸菌是廣泛應(yīng)用在肉制品、乳制品、蔬菜和葡萄酒發(fā)酵中的發(fā)酵劑[3]。這些菌株可以延長發(fā)酵食品保質(zhì)期,也可以改善發(fā)酵食品的質(zhì)地,風(fēng)味和口感[4]。同時(shí)它對(duì)人是無毒副作用,可以改善人體腸道菌群,這在人體生理機(jī)能中起著重要作用。乳酸菌素是乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的具有抑制其他微生物生長的一類細(xì)胞外蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)[5]。從乳酸菌中分離純化的乳酸菌素Nisin是一種天然生物防腐劑,作為在全球已批準(zhǔn)應(yīng)用的食品添加劑,它可以有效抑制食品中致病菌和腐敗菌的生長[6]。除Nisin外,還有許多其他細(xì)菌素如片球菌素,鏈球菌素和植物乳桿菌素等被認(rèn)為具有作為食品防腐劑的潛力,但由于某種乳酸菌素?zé)岱€(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性的局限性和抑菌譜窄的特點(diǎn)限制了其單獨(dú)在食品工業(yè)中的應(yīng)用[7]。因此開發(fā)抑菌譜廣、適應(yīng)食品工業(yè)生產(chǎn)的新型乳酸菌素具有良好的前景。

本文從具有長壽村之稱的廣西巴馬村的天然發(fā)酵食品中分離純化有抑菌活性的乳酸菌,并對(duì)所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的特性進(jìn)行初步研究,旨在為開發(fā)天然的適應(yīng)食品工業(yè)生產(chǎn)的生物防腐劑提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

米粉廣西巴馬村天然發(fā)酵。

乳酸菌M44為分離純化菌株;單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)CMCC54003和CMCC54002、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)ATCC 14028、傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphosa)CMCC50071、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC29213和CMCC26001、大腸桿菌(Escherichiacoli)CMCC44110、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)CMCC51572、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

碳酸鈣-MRS固體培養(yǎng)基(3%碳酸鈣),MRS液體、固體培養(yǎng)基,TSBYE液體、固體培養(yǎng)基,LB液體、固體培養(yǎng)基,BPY液體、固體培養(yǎng)基,GN液體、固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基所需試劑均為國產(chǎn)分析純[8]。

革蘭氏染色試劑盒北京陸橋技術(shù)股份有限公司;溶菌酶、過氧化氫酶生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶Sigma-Aldrich公司;DL5000 DNA Marker、Ex Taq寶生物工程(大連)有限公司;細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖Biowest公司;其他試劑均為分析純北京暢華志誠科技有限公司。

牛津杯(內(nèi)徑6 mm)北京暢華志誠科技有限公司;DL-CJ-1N 超凈工作臺(tái)北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;PHS-3B 便攜式酸度計(jì)上海雷磁儀器廠;UV-1800 微量紫外分光光度計(jì)日本島津公司;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋Sanyo Electric公司;LHS-100CH 恒溫恒濕箱上海一恒科技有限公司;C1000 PCR儀美國Bio-Rad公司;JY 600C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;DYY-8C型電泳儀北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司;BIOFUGE STRATOS臺(tái)式冷凍離心機(jī)美國Thermo Scientific公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌初篩稱取發(fā)酵米粉25 g,用225 mL無菌水均質(zhì)混勻,使用傾注法接種在碳酸鈣-MRS瓊脂平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,選取有溶鈣圈的菌落,然后在MRS瓊脂平板上多次劃線純化,直至整個(gè)平板上的菌落形態(tài)一致,挑取單菌落到MRS液體培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)24 h,使用凍存管將菌液和50%甘油1∶1混合,-80 ℃冰箱保藏[8]。

1.2.2菌株的培養(yǎng)將-80 ℃冷凍保藏的乳酸菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(簡稱單增李斯特)CMCC54002恢復(fù)到室溫,分別接種到MRS和TSBYE液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h和12 h,4 ℃保藏備用。

1.2.3乳酸菌發(fā)酵上清液的制備按2%的接種量將活化的乳酸菌轉(zhuǎn)接到MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液12000 r/min,4 ℃離心10 min,收集發(fā)酵上清液,4 ℃保藏備用。

1.2.4管碟法抑菌實(shí)驗(yàn)將活化好的指示菌,與加熱融化的固體培養(yǎng)基混勻,使菌落終濃度至107cfu/mL,傾注約15 mL于無菌平皿中,待培養(yǎng)基凝固后,輕輕放上牛津杯,取100 μL實(shí)驗(yàn)樣品加入牛津杯。4 ℃冰箱擴(kuò)散4 h后,在相應(yīng)指示菌的生長溫度下培養(yǎng)相應(yīng)的生長時(shí)間,觀察抑菌圈的出現(xiàn)[9-10]。

1.2.5有抑菌活性乳酸菌的復(fù)篩將保藏的乳酸菌發(fā)酵上清液,用1 mol/L NaOH調(diào)pH至6.0,排除有機(jī)酸干擾,以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CMCC54002為指示菌,管碟法做抑菌實(shí)驗(yàn)[11]。

1.2.6抑菌物質(zhì)的確定將pH6.0乳酸菌M44發(fā)酵上清液分為4份,分別用無菌水,過氧化氫酶(pH7.0、37 ℃)、胃蛋白酶(pH2.0、37 ℃)、胰蛋白酶(pH8.0、37 ℃)處理2 h,再調(diào)pH為6.0,用無菌水調(diào)至相同體積,以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CMCC54002為指示菌,管碟法做抑菌實(shí)驗(yàn),未處理的發(fā)酵上清液為對(duì)照,各平行三次[12]。

1.2.716S rDNA序列鑒定乳酸菌M44發(fā)酵培養(yǎng)液12000 r/min,4 ℃離心10 min后取菌體沉淀,溶菌酶(30 mg/mL)37 ℃溫浴1～2 h后用基因組DNA提取使用試劑盒提取。以提取的基因組DNA為模板,進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增引物使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)/1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)(Weisburg,et al.1991)。PCR反應(yīng)體系(25 μL):Pre-mix Ex Taq 12.5 μL,上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,基因組DNA模板1 μL,超純水9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性 3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,進(jìn)行34個(gè)循環(huán)管,最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序。PCR產(chǎn)物序列結(jié)果通過BLAST軟件在NCBI網(wǎng)站基因庫中進(jìn)行同源性比對(duì)鑒定。

1.2.8乳酸菌素抑菌活力的測定乳酸菌素抑菌活力的測定采用二倍連續(xù)梯度稀釋法[13]與管碟法,將待測樣品用無菌水進(jìn)行二倍梯度稀釋,取100 μL樣品進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),以觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為一個(gè)活力單位(AU,arbitrary units),其倒數(shù)即為樣品的效價(jià)值(AU/mL)[14]。

1.2.9鹽析法分離乳酸菌素將乳酸菌發(fā)酵上清液pH調(diào)至6.0,分成八份,每份100 mL,邊緩慢攪拌邊分別緩慢添加經(jīng)過研磨的硫酸銨粉末,直至八份樣品的濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。4 ℃磁力攪拌器攪拌沉淀過夜,10000 r/min離心10 min。每份樣品得到的沉淀分別重懸于0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)中,做抑菌實(shí)驗(yàn),比較抑菌圈有無及直徑大小,以此確定硫酸銨最佳沉淀濃度;各硫酸銨濃度沉淀得到的上清液做抑菌實(shí)驗(yàn),平行測三次[15]。

1.2.10乳酸菌素產(chǎn)量與菌株生長的關(guān)系乳酸菌M44按2%接種量接種,37 ℃連續(xù)培養(yǎng)24 h,每隔2 h測定發(fā)酵菌液OD600 nm值和乳酸菌素硫酸銨沉淀粗提物的效價(jià)。每組數(shù)據(jù)平行測3次[16]。

1.2.11乳酸菌素的特性實(shí)驗(yàn)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):將乳酸菌素粗提液pH調(diào)至6.0,分別做如下處理:60 ℃ 10 min,60 ℃ 30 min,60 ℃ 90 min,100 ℃ 10 min,100 ℃ 30 min,100 ℃ 90 min,121 ℃ 15 min,靜置冷卻后以單增李斯特為指示菌做抑菌實(shí)驗(yàn),未經(jīng)熱處理的乳酸菌素粗提液為對(duì)照。各平行三次。酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):將乳酸菌素粗提液的pH分別調(diào)至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0,37 ℃溫箱處理2 h,再調(diào)回pH6.0,用無菌水調(diào)節(jié)液面至同一體積,以單增李斯特為指示菌做抑菌實(shí)驗(yàn)。各平行三次。抑菌譜的測定:將乳酸菌素粗提液pH調(diào)至6.0在不同指示菌的指示平板上采用管碟法做抑菌實(shí)驗(yàn),繪制抑菌譜[9]。

2　結(jié)果與分析

2.1乳酸菌菌株的篩選

在碳酸鈣-MRS培養(yǎng)基上選取有溶鈣圈、乳白色、革蘭氏染色陽性的單菌落50株劃平板純化,純化后的菌株經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基37 ℃增培24 h,25%甘油-80 ℃保藏。

將上述分離純化的菌株,用MRS液體培養(yǎng)基37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)至穩(wěn)定期,取發(fā)酵上清液調(diào)節(jié)pH為6.0后,以單增李斯特菌CMCC54002為指示菌,使用管碟法篩選出有抑菌效果的菌株M44。

2.2乳酸菌M44的鑒定

乳酸菌M44的菌落為乳白色圓形,表面光滑,中間凸起,不透明,邊緣整齊,直徑約2 mm;革蘭氏染色顯示個(gè)體形態(tài)呈短桿狀,大小0.5×(1.33～2.0)μm,通常單生,成對(duì)或呈短鏈狀排列,不生芽孢(圖1),為革蘭氏陽性菌。

圖1　乳酸菌M44的菌體形態(tài)(×1000)Fig.1　Mycelial morphology of lactic acid bacteria M44(×1000)

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取乳酸菌M44基因組,然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提取質(zhì)量(圖2)。以M44基因組DNA為模板,16S rDNA 通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到約1500 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站用BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)分析,并與其它乳酸菌同源性比對(duì)做系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。乳酸菌M44的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核心序列與植物乳桿菌Zhang-LL(GenBank:KF926687.1)的基因序列同源性達(dá)到 99%,同時(shí)系統(tǒng)發(fā)育樹分析與乳酸桿菌中的植物乳桿菌相似性最高,故確定乳酸菌M44為植物乳桿菌。

圖2　乳酸菌M44基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Agarose Gel Electrophoresis of Genomic DNA of strain M44注:M.DNA maker DL5000;1.乳酸菌M44基因組DNA

圖3　乳酸菌M44 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3　The 16S rDNA PCR products of strain M44注:M.DNA maker DL5000;1.陰性對(duì)照; 2.16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物; 3.16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物平行樣本。

圖4　乳酸菌M44的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　The phylogenetic tree of strain M44

2.3抑菌物質(zhì)的確定

抑菌實(shí)驗(yàn)顯示將植物乳桿菌M44的發(fā)酵上清液pH調(diào)至中性后,抑菌效果仍然很明顯,過氧化氫酶處理后抑菌圈幾乎沒有變化,胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后抑菌性消失(圖5)。說明發(fā)酵上清液中有機(jī)酸對(duì)單增李斯特菌沒有明顯的抑菌作用,過氧化氫也不是抑菌物質(zhì),發(fā)揮抑菌作用的主要為蛋白類物質(zhì),定義為乳酸菌素。

圖5　抑菌物質(zhì)的確定Fig.5　Determination of the antimicrobial substance注:牛津杯內(nèi)直徑6.0 mm。1.pH4.0;2.pH6.0; 3.pH6.0,過氧化氫酶處理;4.pH6.0,胃蛋白酶處理; 5.pH6.0,胰蛋白酶處理。實(shí)驗(yàn) 1、2是有機(jī)酸排除實(shí)驗(yàn); 實(shí)驗(yàn)2、3是過氧化氫排除實(shí)驗(yàn); 實(shí)驗(yàn) 2、3、4、5是證明蛋白質(zhì)屬性實(shí)驗(yàn)。

2.4乳酸菌素的初步純化

乳酸菌素使用鹽析的方法來提取,實(shí)驗(yàn)中采取硫酸銨分級(jí)沉淀的蛋白質(zhì)的分離方法,分別得到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%硫酸銨飽和度的沉淀和上清,抑菌結(jié)果如表1所示。

表1　硫酸銨分級(jí)沉淀效果Table 1　Grade precipitation with different concentration of ammonium sulfate

由表1可知,在硫酸銨濃度在40%以下,硫酸銨沉淀沒有顯著的抑菌效果,硫酸銨沉淀上清抑菌效果沒有明顯下降,硫酸銨濃度達(dá)到40%以后硫酸銨沉淀抑菌效果逐漸增強(qiáng),硫酸銨沉淀上清抑菌效果逐漸減弱,在60%達(dá)到硫酸銨沉淀抑菌效果達(dá)到最大值,硫酸銨沉淀上清達(dá)到最小值并在60%以后達(dá)到穩(wěn)定。因此,硫酸銨沉淀法粗提細(xì)菌素時(shí),先用40%的硫酸銨去除雜蛋白,然后繼續(xù)添加硫酸銨至終濃度達(dá)到60%。將粗提的60%硫酸銨沉淀經(jīng)過透析處理除鹽,放置4 ℃冷藏備用。

2.5乳酸菌素M44產(chǎn)量與菌株生長的關(guān)系

在乳酸菌M44連續(xù)發(fā)酵24 h內(nèi),間隔2 h測定菌落總數(shù),發(fā)酵液的OD600 nm值、pH及乳酸菌素粗提物的抑菌效價(jià),結(jié)果見圖6。隨著乳酸菌M44菌數(shù)的增長,乳酸菌M44培養(yǎng)液的OD600 nm值和乳酸菌素的效價(jià)不斷上升,同時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)液的pH不斷下降,在發(fā)酵培養(yǎng)12 h之后培養(yǎng)體系各項(xiàng)指標(biāo)處于穩(wěn)定狀態(tài),乳酸菌素的效價(jià)值也達(dá)到最大AU值160 AU/mL,因此,確定乳酸菌素的最佳收獲期為發(fā)酵培養(yǎng)12 h。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明乳酸菌素M44的產(chǎn)生與菌株生長具有正相關(guān)依懶關(guān)系。

圖6　乳酸菌素M44產(chǎn)量與菌株生長的關(guān)系Fig.6　Production of the plantaricin during the growth of strain M44

2.6乳酸菌素M44特性

熱穩(wěn)定性:乳酸菌素M44粗提液經(jīng)過不同熱處理后,對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的抑菌效果如表2所示。乳酸菌素M44經(jīng)121 ℃ 15 min熱處理后仍具有抑菌活性,說明此乳酸菌素具有較好的熱穩(wěn)定性,在一般的食品熱加工處理中,對(duì)其抑菌作用影響不大。

表2　乳酸菌素M44的熱穩(wěn)定性Table 2　The stability of the lactobacillin M44 to temperature

酸堿穩(wěn)定性:調(diào)節(jié)乳酸菌素M44粗提液pH,抑菌結(jié)果(圖7)顯示乳酸菌素M44在pH2～8范圍內(nèi)抑菌性較好,隨著pH的升高抑菌性急劇消失,說明此細(xì)菌素能耐受酸環(huán)境而不耐受堿環(huán)境。

表3　乳酸菌素對(duì)細(xì)菌的抑制作用Table 3　The inhibition of the lactobacillin to bacteria

注:a:ATCC,American Type Culture Collection;CMCC,National Center For Medicial Culture Collection;b:抑菌圈直徑(mm):++,9-14 mm;+,1-8 mm;-,no inhibition。

圖7　乳酸菌素的酸堿穩(wěn)定性Fig.7　The pH stability of the lactobacillin注:牛津杯內(nèi)直徑 6.0 mm。圖中標(biāo)注為相應(yīng)pH。

乳酸菌素M44的抑菌譜:以食品中常見的致病菌和實(shí)驗(yàn)室保藏的產(chǎn)乳酸菌素的近源性乳酸菌為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示,該乳酸菌素對(duì)單增李斯特,沙門氏菌,金黃色葡萄球菌,大腸埃希氏菌均有一定的抑制作用,對(duì)福氏志賀氏菌沒有抑制作用,對(duì)乳酸菌的產(chǎn)乳酸菌素近源菌株干酪乳桿菌,植物乳桿菌,嗜酸乳桿菌,瑞士乳桿菌和戊糖片球菌沒有抑制作用,說明乳酸菌素M44能很好的作為生物防腐劑應(yīng)用于食品中。

3　結(jié)論

從廣西巴馬長壽村的天然發(fā)酵食品米粉樣品中篩選出一株具有抑菌活性的乳酸菌菌株M44,通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析鑒定為植物乳桿菌。乳酸菌M44發(fā)酵上清液排除有機(jī)酸和過氧化氫酶的影響后,仍具有抑菌活性,用胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后,抑菌活性消失,這說明其代謝產(chǎn)物中主要的抑菌活性物質(zhì)屬于蛋白類,且能被胃蛋白酶和胰蛋白酶完全消化,證明其在人體內(nèi)能被消化吸收。初步確定為乳酸菌素。用鹽析法提取發(fā)酵上清液中的乳酸菌素,確定硫酸銨最佳沉淀濃度為60%。通過測定乳酸菌素產(chǎn)量與菌株生長關(guān)系,乳酸菌素M44的最佳收獲期為發(fā)酵培養(yǎng)12 h。乳酸菌素M44有較好的熱穩(wěn)定性,經(jīng)121 ℃處理15 min后仍具有抑菌活性;其在pH2～8范圍內(nèi)具有良好的抑菌效果。該乳酸菌素不僅對(duì)單核增生李斯特細(xì)菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌有抑制作用,而且對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌革蘭氏陰性菌也有抑制作用。此乳酸菌素來源于食品,為天然食品防腐劑和動(dòng)物飼料添加劑提供研究和應(yīng)用基礎(chǔ)。

[1]黃艷娥，劉海波. 食品防腐劑對(duì)人體健康的影響及發(fā)展趨勢 [J]. 化工中間體,2005,07:1-6.

[2]周志江. 生物防腐劑及其在食品防腐中的應(yīng)用 [J]. 保鮮與加工,2015,01:1-8.

[3]Buckenh Skes H J. Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as starter cultures for various food commodities [J]. FEMS Microbiology Reviews,1993,12(1-3):253-271.

[4]El-Ghaish S,Ahmadova A,Hadji-Sfaxi I,et al. Potential use of lactic acid bacteria for reduction of allergenicity and for longer conservation of fermented foods [J]. Trends in Food Science and Technology,2011,22(9):509-516.

[5]Jack R W,Tagg J R. Bacteriocins of gram-positive bacteria [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,1995,59(2):171-200.

[6]G Lvez A,Abriouel H,L Pez R L,et al. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation [J]. International Journal of Food Microbiology,2007,120(1-2):51-70.

[7]劉長建，姜波，崔玉波，等. 生物防腐劑乳酸菌素的研究進(jìn)展 [J]. 微生物學(xué)雜志,2010,03:87-90.

[8]劉慧. 現(xiàn)代食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) [M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社,2011:260-284.

[9]O’shea E F,O’connor P M,Raftis E J,et al. Subspecies diversity in bacteriocin production by intestinal Lactobacillus salivarius strains [J]. Gut microbes,2012,3(5):468-473.

[10]De Kwaadsteniet M,Fraser T,Van Reenen C A,et al. Bacteriocin T8,a Novel Class IIa sec-Dependent Bacteriocin Produced by Enterococcus faecium T8,Isolated from Vaginal Secretions of Children Infected with Human Immunodeficiency Virus [J]. Applied and Environmental Microbiology,2006,72(7):4761-4766.

[11]Nieto-Lozanoa J C,Reguera-Userosa J I,Mar,et al. Effect of a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici against Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens on Spanish raw meat [J]. Meat Science,2006,72(1):57-61.

[12]Piddock L J. Techniques used for the determination of antimicrobial resistance and sensitivity in bacteria. Antimicrobial Agents Research Group [J]. Journal of Applied Bacteriology,1990,68(4):307-318.

[13]Tahiri I,Desbiens M,Benech R,et al. Purification,characterization and amino acid sequencing of divergicin M35:a novel class IIa bacteriocin produced by Carnobacterium divergens M35 [J]. International Journal of Food Microbiology,2004,97(2):123-136.

[14]Zhu W M,Liu W,Wu D Q. Isolation and characterization of a new bacteriocin from Lactobacillus gasseri KT7 [J]. Journal of applied microbiology,2000,88(5):877-886.

[15]Cintas L M,Casaus M P,Herranz C,et al. Review:Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria [J]. Food Science and Technology International,2001,7(4):281-305.

[16]張紅星，劉麗，謝英，等. 風(fēng)干腸中戊糖片球菌所產(chǎn)細(xì)菌素L5-6的理化特性研究 [J]. 中國食品學(xué)報(bào),2011,01:75-79.

Identification and antimicrobial characters of a strain producing lactobacillin

ZHANG Jun-chao,XIE Yuan-hong,JIN Jun-hua,DUAN Hui-xia,LIU Hui,ZHANG Hong-xing*

(Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residue,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Faculty of Food Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

The extraction,purification and functional characterization of the bacteriocin produced byLactobacillusplantarumM44 selected from rice noodles products of Guangxi province were studied.It was identified asLactobacillusplantarumvia using microbial morphology identification and 16S rDNA gene sequence homology analysis.The fermentation supernatant of strain M44 have antibacterial activity,and antibacterial substances was identified as protein.The bacteriocin was purified by protein salting-out method and the optimal concentration of 60% ammonium sulfate precipitation was determined.The most appropriate harvest time of the bacteriocin was 12 h by studying production of bacteriocin during the growth of strain M44.The results indicated that the lactobacillin M44 still had antibacterial activity at 121 ℃ for 15 min,and had strong antibacterial activity in the range of pH2.0～8.0,but had no antibacterial activity after pepsin and trypsin treatment,whatever lactobacillin M44 proved its good inhibitory effect on proliferation ofListeriamonocytogenes,Escherichiacoli,Salmonellatyphimurium,andStaphylococcusaureusby the oxford cup method.In this paper a preliminary study on the bacteriocin produced byLactobacillusplantarumM44 had been made to lay the basis for the development of natural biological preservatives.

Lactobacillusplantarum;bacteriocin;extraction and purification;antibacterial characterization

2015-10-14

張君超(1990-),女,碩士研究生,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏專業(yè),食品安全方向,E-mail:18810833052@163.com。

張紅星(1970-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物,食品安全檢測與控制,E-mail:hxzhang511@163.com。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(SS2012AA101606-5,2012BAD28B02-01);北京市長城學(xué)者培養(yǎng)計(jì)劃(CIT&TCD20140315);2015年北京農(nóng)學(xué)院學(xué)位與研究生教育改革與發(fā)展項(xiàng)目(2015YJS059)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0169-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.025