陳　亞,梁　琪,*,楊　敏,2,張衛(wèi)兵,張　炎

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

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響應(yīng)面法優(yōu)化嗜熱鏈球菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件

陳亞1,梁琪1,*,楊敏1,2,張衛(wèi)兵1,張炎1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法(RSM)對(duì)影響嗜熱鏈球菌(Q4)產(chǎn)胞外多糖(EPS)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。以EPS含量為指標(biāo),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)初步得到Q4產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件;采用Placket-Burman(PB)設(shè)計(jì)法從以上單因素中篩選出顯著因素,對(duì)顯著因素進(jìn)行Box-Behnken(BB)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化,建立EPS含量與各影響因素的回歸方程,獲得Q4產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為:初始pH6.8、發(fā)酵時(shí)間33 h、發(fā)酵溫度41 ℃。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在此條件下胞外多糖的產(chǎn)量可達(dá)268.42 mg/L,比優(yōu)化前的EPS含量(89.43 mg/L)提高了3倍。

響應(yīng)面法，嗜熱鏈球菌，胞外多糖，培養(yǎng)條件

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)是乳酸菌的一種,它能利用碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸,常被用來(lái)制作乳酸菌種,也可和保加利亞乳酸桿菌共生于脫脂乳中以生產(chǎn)酸乳及酸乳飲品。其產(chǎn)黏性對(duì)提高酸奶的組織狀態(tài)及研制高效的直投式酸奶發(fā)酵劑具有非常重要的指導(dǎo)意義。因此,它的開(kāi)發(fā)利用一直得到國(guó)內(nèi)外乳品界的高度重視[1]。

近幾十年來(lái),由于微生物胞外多糖在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性能及生產(chǎn)方面所具有的特別優(yōu)勢(shì)而得到大力研究和開(kāi)發(fā),尤其是微生物胞外多糖的開(kāi)發(fā)已成為工業(yè)微生物研究的熱點(diǎn)之一。乳酸菌是公認(rèn)的安全的食品級(jí)微生物,其次級(jí)代謝產(chǎn)物胞外多糖與其他多糖比較,對(duì)人類(lèi)的安全性更為可靠[2-3],其中嗜熱鏈球菌具有很好的產(chǎn)黏特性,是鏈球菌屬中唯一的益生菌,其產(chǎn)生的胞外多糖具有多種生理功能,能夠增強(qiáng)人體免疫,可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域,具有潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值,因而受到人們關(guān)注[4]。大量研究表明[5],乳酸菌胞外多糖不僅可以用做增稠劑、凝膠劑和穩(wěn)定劑,對(duì)人體健康也有促進(jìn)作用,如:能降低膽固醇,抗癌,抗?jié)?改善腸道微生態(tài)環(huán)境,增強(qiáng)人體免疫力或作為益生元等。但是由于乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量低,菌株穩(wěn)定性差,并且培養(yǎng)過(guò)程中降解率高,這是限制其在工業(yè)領(lǐng)域中大規(guī)模生產(chǎn)的主導(dǎo)因素。為了解決這個(gè)問(wèn)題,在發(fā)酵工業(yè)中,提高微生物代謝產(chǎn)量的方法有很多種,乳酸菌EPS生物合成除受遺傳因素即菌株自身因素的影響外,還受培養(yǎng)基的組成、pH、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時(shí)間等培養(yǎng)條件的影響[6-7]。因此,本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)具有生產(chǎn)能力的嗜熱鏈球菌Q4菌株,并對(duì)其產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件進(jìn)行系統(tǒng)地研究具有重要科學(xué)價(jià)值,特別是高產(chǎn)EPS發(fā)酵乳制品的開(kāi)發(fā)以及新型發(fā)酵多糖的功能特性的研究等。本研究在影響Q4高產(chǎn)EPS單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化Q4產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

嗜熱鏈球菌Q4,從甘肅部分藏區(qū)自然發(fā)酵牦牛乳中分離篩選所得(實(shí)驗(yàn)室冰箱-80 ℃保存),三氯乙酸、95%乙醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純;改良M17培養(yǎng)基,按文獻(xiàn)進(jìn)行配制[8]。

TGL-20高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱上海-恒科儀器有限公司;PHS-3CpH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;54PG型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)上海儀譜儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的活化與傳代用10%(w/v)脫脂乳作為培養(yǎng)基在115 ℃條件下滅菌15 min。在滅菌完的超凈工作臺(tái)中,按接種量5%吸取菌液,接種到脫脂乳中,震蕩均勻后放于37 ℃生化培養(yǎng)箱,培養(yǎng)12 h。然后將發(fā)酵脫脂乳傳代培養(yǎng)于新的脫脂乳中,培養(yǎng)12 h。如此傳代培養(yǎng)2～3代,使菌株活力恢復(fù)。獲得足夠量的脫脂乳培養(yǎng)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2母發(fā)酵液的制備按4%(V/V)的接種量,將活化后的脫脂乳接于30 mL的M17液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,得發(fā)酵母液。

1.2.3發(fā)酵液的制備將母發(fā)酵液按4%(V/V)的量,接入裝有100 mL M17液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,轉(zhuǎn)速為180 r/min,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,得發(fā)酵液。

1.2.4EPS的提取參照李全陽(yáng)[9]的方法將發(fā)酵液在沸水浴中加熱10 min,冷卻后離心(4 ℃,10000 r/min)15 min,收集上清液,菌體沉淀用PBS洗滌三次,合并上清液;將上清液濃縮至原來(lái)體積的1/5,并加入15%的TCA溶液,室溫下攪拌2 h后,離心(4 ℃,10000 r/min)30 min以除去蛋白沉淀;取上清液加入3倍體積的95%乙醇,4 ℃冷藏過(guò)夜,多糖呈絮狀沉淀析出,離心(4 ℃,10000 r/min)10 min后,收集沉淀,用蒸餾水溶解(重復(fù)以上操作3～4次),并移入透析袋中用蒸餾水透析2 d,每8 h換一次水,將透析液稱(chēng)量、稀釋、定容。

1.2.5ESP的測(cè)定采用苯酚硫酸法測(cè)定透析后的EPS含量,參照薩如拉[10]的方法。

1.2.5.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖25 mg,用蒸餾水溶解并定容于250 mL容量瓶中,制成濃度為0.1 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL置于9支干燥具塞的試管中,并加蒸餾水至2 mL,然后向各試管分別加6%苯酚溶液(新制)1 mL,搖勻,然后迅速加入濃硫酸5.0 mL,立即搖勻,室溫下靜置30 min,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度,蒸餾水為空白對(duì)照組,以葡萄糖稀釋液的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1　Standard curve of glucose cocentration

1.2.5.2EPS的含量測(cè)定準(zhǔn)確吸取1 mL上述EPS溶液,加入6%苯酚溶液(新制)1 mL和5 mL濃硫酸,靜置10 min并搖勻,室溫放置30 min后,于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度,蒸餾水為空白對(duì)照組,在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查找對(duì)應(yīng)的EPS含量,即得嗜熱鏈球菌Q4的胞外多糖產(chǎn)量。

1.2.6單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1初始pH對(duì)EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%的接種量接種至起始pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的M17液體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測(cè)定其EPS含量,設(shè)3次重復(fù)。

1.2.6.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%的接種量接種至起始pH7.0液體培養(yǎng)基中,于37 ℃下分別培養(yǎng)8、16、24、32、40 h后,測(cè)定其EPS含量,設(shè)3次重復(fù)。

1.2.6.3發(fā)酵溫度對(duì)EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%的接種量接種至起始pH7.0的M17液體培養(yǎng)基中,分別在37、39、41、43、45 ℃下培養(yǎng)24 h后,測(cè)定其EPS含量,設(shè)3次重復(fù)。

1.2.6.4接種量對(duì)EPS含量的影響取接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%的含Q4的M17一次發(fā)酵液接種至起始pH7.0的M17液體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測(cè)定其胞外多糖含量,設(shè)3次重復(fù)。

1.2.6.5搖床轉(zhuǎn)速對(duì)EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%種量接種起始pH7.0的M17液體培養(yǎng)基中,選擇轉(zhuǎn)速分別為0、80、160、240、320 r/min,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測(cè)定其胞外多糖含量,設(shè)3次重復(fù)。

1.2.7響應(yīng)面法優(yōu)化Q4發(fā)酵產(chǎn)EPS的培養(yǎng)條件

1.2.7.1Placket-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,對(duì)初始pH(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、發(fā)酵溫度(C)、接種量(D)、旋轉(zhuǎn)速度(E)5個(gè)因素,以EPS含量為響應(yīng)值進(jìn)行二級(jí)水平實(shí)驗(yàn),篩選出對(duì)EPS含量有顯著性影響的因素,其水平編碼表見(jiàn)表1。

表1　Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1　Factors and levels of Plackett-Burman(PB)design

1.2.7.2Box-Behnken(BB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)BB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以PB實(shí)驗(yàn)篩選出的三個(gè)顯著因素,即初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素,EPS含量為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),每個(gè)因素選三個(gè)水平,設(shè)計(jì)三因素三水平包括5個(gè)中心點(diǎn)共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析水平表見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面因素水平表Table 2　Actors and levels of Box-Behnken(BB)design

1.2.8數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用三次重復(fù)并取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用Origin8.0軟件作圖,Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1初始pH對(duì)EPS含量的影響在液體發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵液的初始pH與微生物的生命活動(dòng)有著密切聯(lián)系,微生物的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的形成必須通過(guò)各種的酶催化反應(yīng)來(lái)完成,pH的變化會(huì)影響酶的活性,進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成。不同初始pH下Q4產(chǎn)生EPS的情況如圖2所示。

圖2　初始pH對(duì)EPS含量的影響Fig.2　Effects of intial pH on the content of EPS

由圖2可知,EPS含量隨初始pH的增大呈先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)pH為6.5時(shí)EPS的含量達(dá)到最高,為268.41 mg/L,之后隨pH的增大而緩慢下降,因此確定嗜熱鏈球菌Q4產(chǎn)胞外多糖的最適pH為6.5。這和大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)微生物產(chǎn)EPS的最適pH在中性偏酸的結(jié)果相一致[11];而初始pH較小時(shí),EPS含量也較低,其原因可能是由于低pH抑制了菌體的生長(zhǎng)進(jìn)而影響EPS的分泌[12-13]。該結(jié)果說(shuō)明發(fā)酵液的初始pH對(duì)EPS的含量影響較大,故選擇pH6.5。

2.1.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS含量的影響不同種乳酸菌產(chǎn)EPS的時(shí)間差異很大,即使同一種乳酸菌同一品系間產(chǎn)EPS的時(shí)間差異也會(huì)很大。有些菌體在對(duì)數(shù)期產(chǎn)生EPS,而有一些在對(duì)數(shù)期并不產(chǎn)生卻在穩(wěn)定期才產(chǎn)生EPS[14]。因此時(shí)間也是影響EPS產(chǎn)量的重要因素之一。該菌株在不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)Q4產(chǎn)EPS的影響如圖3所示。

圖3　發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS含量的影響Fig.3　Effects of fermentation time on the content of EPS

由圖3可知,EPS含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先逐漸增大后緩慢減小,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)32 h時(shí),EPS含量達(dá)到最大268.04 mg/L,此時(shí)剛好處于菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期的后期,因?yàn)橐话鉋PS在菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期和穩(wěn)定期產(chǎn)生,因此延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間有助于EPS的積累,這與賈建波等人的研究結(jié)果一致[15];進(jìn)一步延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間,EPS含量呈逐漸下降趨勢(shì),可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分減少,無(wú)法繼續(xù)提供菌體細(xì)胞生長(zhǎng)及EPS的分泌,也可能是發(fā)酵后期細(xì)菌產(chǎn)生降解多糖的酶所致[16]。因此選擇發(fā)酵時(shí)間32 h。

2.1.3發(fā)酵溫度對(duì)EPS含量的影響發(fā)酵溫度也是影響細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和EPS合成的重要因素。發(fā)酵溫度不同,菌株的生長(zhǎng)速度及其合成EPS的產(chǎn)量也有明顯的區(qū)別。不同發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響如圖4所示。

圖4　發(fā)酵溫度對(duì)EPS含量的影響Fig.4　Effects of fermentation temperature on the content of EPS

由圖4可知,EPS含量隨著發(fā)酵溫度的升高先增大后減小,當(dāng)發(fā)酵溫度為41 ℃時(shí)EPS含量達(dá)到最高,為267.98 mg/L,這可能是由于嗜熱鏈球菌的最適發(fā)酵溫度在40 ℃左右,其菌體生長(zhǎng)最旺盛;發(fā)酵溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于Q4菌株合成EPS,其原因可能是是發(fā)酵溫度過(guò)低,菌體生長(zhǎng)緩慢,菌體濃度不高,使類(lèi)異戊二烯脂質(zhì)載體發(fā)生鈍化現(xiàn)象,EPS的產(chǎn)量則較低[17];發(fā)酵溫度過(guò)高,會(huì)使穩(wěn)定期提前到來(lái),菌體在發(fā)酵后期容易衰老而自溶,菌體濃度也不高,同時(shí)會(huì)使類(lèi)異戊二烯脂質(zhì)載體失活,多糖的產(chǎn)量也會(huì)明顯的降低[18-19]。因此,選擇41 ℃作為發(fā)酵溫度。

2.1.4接種量對(duì)EPS含量的影響接種量可以通過(guò)影響發(fā)酵液中的最初活菌數(shù),進(jìn)而影響菌體在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此,本實(shí)驗(yàn)尋找最適的接種量對(duì)于提高Q4菌株在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的EPS含量具有重要意義。接種量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響如圖5所示。

圖5　接種量對(duì)EPS含量的影響Fig.5　Effects of inoculum dosage on the content of EPS

由圖5可知,隨著接種量的增大,起初EPS含量也隨之增大,當(dāng)接種量達(dá)到3%時(shí),EPS含量達(dá)最大262.47 mg/L,進(jìn)一步增大接種量時(shí),EPS產(chǎn)量反而降低,研究表明[20],這可能是由于接種量過(guò)大,發(fā)酵前期會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)快、菌體濃度過(guò)高,中后期會(huì)因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡而導(dǎo)致合成胞外多糖的前體物質(zhì)減少,從而降低EPS的含量;而接種量過(guò)小,菌體生長(zhǎng)緩慢,生長(zhǎng)延滯期則過(guò)長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法得到有效利用,會(huì)向周?chē)h(huán)境發(fā)生過(guò)多的擴(kuò)散而導(dǎo)致嚴(yán)重?fù)p失而降低細(xì)胞活性,不利于EPS的代謝。因此,選擇接種量為3%。

2.1.5搖床轉(zhuǎn)速對(duì)EPS產(chǎn)量和菌體生長(zhǎng)的影響不同菌株、不同氧需求量對(duì)微生物代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)量有較大的影響,嗜熱鏈球菌是一種兼性厭氧型細(xì)菌,因此菌體的生長(zhǎng)發(fā)育需要一定的氧氣供給,而氧的供給又是調(diào)節(jié)搖床轉(zhuǎn)速和通氣量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此本實(shí)驗(yàn)選用5種不同的搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Q4耐氧性能進(jìn)行了考察,其不同攪拌速度下EPS的合成量如圖6所示。

圖6　旋轉(zhuǎn)速度對(duì)EPS含量的影響Fig.6　Effects of rotational speed on the content of EPS

由圖6可知,隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高,發(fā)酵液中EPS含量逐漸增大當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí),EPS含量達(dá)到最大值253.85 mg/L,之后隨之逐漸減小,可見(jiàn)轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí),由于溶氧量不均勻,通氣不好,導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不良,產(chǎn)生EPS含量較低;當(dāng)提高搖床轉(zhuǎn)速,雖然有利于菌體生長(zhǎng),但營(yíng)養(yǎng)成分消耗也較大,造成營(yíng)養(yǎng)成分不足,且轉(zhuǎn)速過(guò)高,對(duì)菌體產(chǎn)生機(jī)械性損傷,引起菌體自溶,從而抑制EPS的合成[21]。因此,選擇旋轉(zhuǎn)速度160 r/min。

2.2PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)乳酸菌生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物EPS含量的一般規(guī)律,選用n=11的PB設(shè)計(jì)表,其中5個(gè)為影響因素(變量),預(yù)留6個(gè)空項(xiàng)作為誤差分析,利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件設(shè)計(jì)出15組實(shí)驗(yàn),響應(yīng)值R1為EPS含量(mg/L),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3　Results of Plackett-Burman(PB)design

表4　PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸方程方差分析Table 4　Analysis results of regression and variance of PB design

注:p<0.05表示顯著,用*表示;p<0.01表示極顯著,用**表示。

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸方程方差分析結(jié)果見(jiàn)表4,擬合出的二項(xiàng)式模型的適合度由回歸系數(shù)R2來(lái)表示,R2=0.9424,結(jié)果顯示該模型與實(shí)際數(shù)據(jù)的擬合程度較高,且與實(shí)際預(yù)測(cè)值(0.9775)間的誤差較小;統(tǒng)計(jì)的顯著性由F檢驗(yàn)來(lái)決定,模型的p值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01,說(shuō)明該模型高度顯著;失擬項(xiàng)(0.2264)>0.05,不顯著,說(shuō)明該模型可用。而且由相關(guān)系數(shù)分析可得:離散系數(shù)C.V.=0.52%,表示數(shù)據(jù)離散度正常,信噪比Adeq Precision等于42.95,遠(yuǎn)大于4,說(shuō)明該模型選擇正確,能夠合適地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)可根據(jù)F值得大小確定影響EPS含量的因素的次序依次是:A>C>B>D>E,即初始pH>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>旋轉(zhuǎn)速度>接種量,其中初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS含量有極顯著的影響,接種量對(duì)EPS含量有顯著的影響。因此確定通過(guò)BB中心組合實(shí)驗(yàn)對(duì)以上三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.3響應(yīng)面分析

2.3.1Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析結(jié)果根據(jù)BB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理,利用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)了3個(gè)因素3水平包括5個(gè)中心點(diǎn)共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)(中心實(shí)驗(yàn)用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差,其余為析因?qū)嶒?yàn)點(diǎn))對(duì)其結(jié)果進(jìn)行回歸分析,計(jì)算EPS含量的回歸方程,并進(jìn)行方差分析,見(jiàn)表5。

通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,得到EPS含量對(duì)初始pH、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度的二次多項(xiàng)式回歸方程為:

Y=267.21+8.21A+1.92B+3.12C+0.64AB+1.18AC-3.72BC-7.86A2-11.96B2-9.23C2

式中,Y為預(yù)測(cè)響應(yīng)值,A、B、C分別為初始pH、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度的編碼值。方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小直接反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度,系數(shù)的正、負(fù)影響其方向。由方程的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值,推斷方程代表的拋物面開(kāi)口向下,具有極大值點(diǎn),可以進(jìn)行優(yōu)化分析。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表6。

表5　響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5　Rresults of Box-Benhnken design

方程一次項(xiàng)中A和C因素均極顯著(p<0.01),B因素顯著(0.010.05)。因此,這三因素之間并不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系,存在交互作用。各因素按影響大小依次排序?yàn)槌跏紁H>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間。

表6　BB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸方程的方差分析Table 6　Analysis results of regression and variance of BB design

2.3.2各因素交互作用對(duì)EPS含量的響應(yīng)面分析三維響應(yīng)面圖是回歸方程的直觀描述,通過(guò)它可以直觀、高效地找到最佳參數(shù)、各參數(shù)之間的相互作用和最大響應(yīng)值。曲面用于反映單因素對(duì)結(jié)果的影響情況。曲面越陡斜表明該因素對(duì)EPS產(chǎn)量的影響越顯著;曲面平緩則相反。等高線(xiàn)表示在同一橢圓型的區(qū)域內(nèi),EPS含量是相同的。在橢圓形區(qū)域中心,EPS含量最高,由中心向邊緣EPS含量逐漸減少。圖中橢圓排列越密集,說(shuō)明因素變化對(duì)EPS含量影響越大。同時(shí)等高線(xiàn)的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱。橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則相反[22],表示兩因素交互作用可忽略。根據(jù)回歸方程繪出初始pH、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)EPS含量影響的響應(yīng)面圖,分別見(jiàn)圖7、圖8、圖9。

圖7　初始pH和發(fā)酵時(shí)間對(duì)EPS含量的交互影響 Fig.7　Correlative effects of intial pH and fermentatime on the content of EPS

圖8　初始pH和發(fā)酵溫度對(duì)EPS含量的交互影響Fig.8　Correlative effects of intial pH and fermentation temperature on the content of EPS

圖9　發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)EPS含量的交互影響Fig.9　Correlative effects of fermentation time and fermentation temperature on the content of EPS

圖7為因素C取0水平時(shí),A和B的交互作用對(duì)響應(yīng)值EPS含量的影響,從響應(yīng)曲面看,二者曲面均表現(xiàn)較陡斜,A曲面略大于B曲面,表明該二因素對(duì)EPS含量的影響均顯著且A略顯著于B。從等高線(xiàn)看,該形狀明顯趨于圓,表明AB之間的交互作用較弱。圖8為因素B取0水平時(shí),A和C的交互作用對(duì)響應(yīng)值EPS含量的影響。二者曲面均較為陡斜,其中A曲面的陡斜程度大于C曲面,表明初始pH對(duì)EPS含量的影響比發(fā)酵溫度更為顯著。而等高線(xiàn)形狀也趨于圓,但AC的交互作用強(qiáng)AB的交互作用。圖8為因素A取0水平時(shí),B和C的交互作用對(duì)響應(yīng)值EPS含量的影響,對(duì)比二者的響應(yīng)曲面發(fā)現(xiàn):C曲面大于B曲面,表明發(fā)酵溫度對(duì)EPS含量的影響最為顯著。等高線(xiàn)較扁平,明顯趨于橢圓,表明B和C之間的交互作用較強(qiáng),即發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度之間存在明顯的交互作用,說(shuō)明這兩個(gè)因素協(xié)同作用對(duì)EPS含量的影響較大。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí),EPS含量隨著發(fā)酵溫度的升高先增大后減小;當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí),EPS含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,達(dá)到一定時(shí)間時(shí)增加的幅度趨于平緩,并逐漸減小,最后EPS含量達(dá)到最大值268.68 mg/L。綜上所述,3個(gè)因素對(duì)EPS產(chǎn)量的影響顯著性順序?yàn)?初始pH>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間,與方差分析的結(jié)果保持一致。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面軟件分析,優(yōu)化后得到的最佳發(fā)酵條件為:初始pH為6.77、發(fā)酵時(shí)間為32.52 h、發(fā)酵溫度為41.38 ℃,在此條件下,EPS含量可達(dá)269.78 mg/L。但為檢驗(yàn)該法的可靠性,考慮到實(shí)驗(yàn)操作的局限性,將優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件修正為:初始pH為6.8、發(fā)酵時(shí)間為33 h、發(fā)酵溫度為41 ℃,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn),實(shí)際EPS含量的平均值為268.42 mg/L,相對(duì)誤差為1.36%?？梢?jiàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型相符,說(shuō)明該模型能較好地模擬和預(yù)測(cè)嗜熱鏈球菌產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件,且具有一定意義的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)對(duì)M17發(fā)酵液的初始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量及旋轉(zhuǎn)速度的單因素實(shí)驗(yàn)得出最佳發(fā)酵條件:初始pH6.5、發(fā)酵時(shí)間32 h、發(fā)酵溫度41 ℃、接種量3%、旋轉(zhuǎn)速度160 r/min;然后再通過(guò)Placket-Burman(PB)設(shè)計(jì)法從以上單因素中篩選出影響最顯著的3個(gè)因素為:初始pH、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度;最后在此基礎(chǔ)上的通過(guò)響應(yīng)面法建立了顯著影響胞外多糖產(chǎn)量的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型,并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該模型進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn),探討了各因素間的交互作用,最終得出嗜熱鏈球菌Q4產(chǎn)EPS含量的最佳發(fā)酵條件為:初始pH為6.8、發(fā)酵時(shí)間為33 h、發(fā)酵溫度為41 ℃,在此條件下通過(guò)模型預(yù)測(cè)的最大EPS含量為269.78 mg/L,與此條件下的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的EPS含量(268.42 mg/L)間的相對(duì)誤差僅為1.36%,說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際EPS含量。因此,利用響應(yīng)面分析法得到的最優(yōu)嗜熱鏈球菌Q4產(chǎn)EPS含量的發(fā)酵條件真實(shí)可靠,具有實(shí)際意義。

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Optimization of fermentation conditions for extracellular polysaccharide production bystreptococcusthermophiluswith response surface methodology

CHEN Ya1,LIANG Qi1,*,YANG Min1,2,ZHANG Wei-bing1,ZHANG Yan1

(1.Functional Dairy Engineering Laboratory in Gansu Province,College of Food science and engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070 China;2.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070 China)

The quantitative effects of fermentation conditions on the yield ofStreptococcusthermophilus(Q4)extracellular polysaccharide were optimized using response surface methodology(RSM).The EPS content as an index,fermentation conditions of EPS produced by Q4 was preliminary obtained by single factor experiment.Then significant factors were screened from the above the single factors according to the Placket-Burman(PB)design method and were optimized using Box-Behnken design.And the EPS content as the response values,obtaining the response surface figure,the optimal fermentation conditions on the yield of(Q4)extracellular polysaccharide were determined:initial pH6.8,fermentation time 33 h and fermentation temperature 41 ℃.Under the optimal conditions the corresponding response value for extracellular polysaccharide production was 268.42 mg/L,compared with the previous EPS content(89.43 mg/L),which was increased 3 times.

response surface methodology;streptococcusthermophilus;extracellular polysaccharide(EPS);fermentation conditions

2015-10-12

陳亞(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:乳品微生物,E-mail:chenya1224@126.com。

梁琪(1969-)，女，博士，教授，研究方向：食品品質(zhì)、乳品科學(xué)，E-mail:liangqi@gsau.edu.cn。

蘭州市研政產(chǎn)合作項(xiàng)目(2012-2-87);蘭州市科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃項(xiàng)目(2011-1-144)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0195-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.030