項(xiàng)昭保,劉星宇

(重慶郵電大學(xué) 生物信息學(xué)院,重慶 400065)

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響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同輔助提取橄欖多酚工藝研究

項(xiàng)昭保,劉星宇

(重慶郵電大學(xué) 生物信息學(xué)院,重慶 400065)

目的:優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取橄欖多酚的工藝條件,為工業(yè)化生產(chǎn)中提取橄欖多酚提供參考。方法:在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取橄欖多酚的提取工藝。結(jié)果:橄欖多酚最佳提取工藝為:微波功率為550 W,微波提取時(shí)間為4.4 min,超聲功率為 330 W,乙醇濃度為62%,此條件下的橄欖多酚實(shí)際得率為6.33%,接近于模型預(yù)測(cè)值6.35%。結(jié)論:該工藝簡(jiǎn)便、快速、得率高,為工業(yè)化應(yīng)用提供了精確有效的參考標(biāo)準(zhǔn),為廣泛開(kāi)發(fā)利用橄欖資源提供了良好的參考價(jià)值。

橄欖,多酚,超聲,微波,提取,響應(yīng)面法

橄欖(Canariumalbum(Lour.)Raeusch.)是橄欖科橄欖屬植物,為衛(wèi)生部首批公布的藥食兩用物種,有較高的藥用價(jià)值,《農(nóng)書》、《增補(bǔ)本草備要》、《本草綱目》、《日華子本草》等闡明了橄欖具有消酒解毒、清咽生津作用,能治咽喉痛,有開(kāi)胃、下氣、止瀉等功效。隨著橄欖的廣泛應(yīng)用,國(guó)內(nèi)外學(xué)者從橄欖中分離出了多種酚類物質(zhì),并證明了其具有較強(qiáng)的抗氧化[1],抗菌[2],抗炎[3],抗腫瘤[4]和抗乙肝病毒[5]等藥理作用,橄欖多酚成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

超聲波和微波作為現(xiàn)代化提取技術(shù),與傳統(tǒng)溶劑提取法相比,具有提取間短,提取效率高,能耗低等優(yōu)點(diǎn),在天然產(chǎn)物有效部位提取中廣泛應(yīng)用[6-8],但是超聲-微波協(xié)同提取的報(bào)道較少,但效果更好。如閆海清[9]等運(yùn)用超聲微波聯(lián)用技術(shù)提取藍(lán)莓總多酚,優(yōu)化結(jié)果表明超聲微波聯(lián)用技術(shù)較單一超聲提取或微波提取能大大提高多酚得率。對(duì)于橄欖多酚的提取研究,羅永會(huì)等[10]采用傳統(tǒng)乙醇浸提,最佳工藝需4 h,得率5.75%;曾培源等[11]采用超聲輔助提取橄欖多酚,最佳工藝需提取3次,每次40 min,共2 h,得率2.32%;何志勇等[12]采用微波輔助提取橄欖多酚,最佳工藝僅需15 s,得率1.2%,傳統(tǒng)提取法耗時(shí)但得率較高,現(xiàn)代提取法省時(shí)但得率較低,為提高現(xiàn)代提取技術(shù)橄欖多酚的得率,本文采用橄欖多酚的提取研究中未見(jiàn)報(bào)道超聲微波協(xié)同提取技術(shù),利用響應(yīng)面法對(duì)橄欖多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,為進(jìn)一步推動(dòng)橄欖多酚的工業(yè)生產(chǎn)和深加工,加大開(kāi)發(fā)利用橄欖資源提供重要基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

橄欖采自重慶市江津區(qū)石蟆鎮(zhèn)橄欖種植基地,曬干、打粉、過(guò)篩、備用;沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醇重慶川東化工有限公司;碳酸鈉上海虹光化工廠;均為分析純。

T6新悅型可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;20B型萬(wàn)能粉碎機(jī)江陰市祝塘永昌藥化機(jī)械廠;Sartorius LE225D型電子分析天平蘇州賽恩斯儀器有限公司;超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)南京先歐儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取沒(méi)食子酸50 mg,用蒸餾水溶解,定容至100 mL,制備得0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。再精密吸取1.25、2.50、3.75、5.00、6.25、7.50 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液分別定容于25 mL容量瓶?jī)?nèi),配成梯度質(zhì)量濃度分別為 0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mg/mL 的沒(méi)食子酸溶液。然后從各稀釋溶液中吸取1.00 mL加入25 mL容量瓶中,先加10 mL蒸餾水,搖勻,再加1.50 mL福林酚試劑,充分搖勻,5 min 后加入6 mL 10% Na2CO3溶液,定容,搖勻,然后在30 ℃避光放置反應(yīng)60 min,以蒸餾水作參比,在765 nm處測(cè)定其吸光值[13]。以吸光值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2橄欖多酚得率的計(jì)算精密吸取1 mL多酚提取液,蒸餾水定容至25 mL容量瓶。再采用1.2.1的方法測(cè)定其吸光值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次,橄欖樣品中的總多酚含量以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)。

多酚得率:Y(%)=ρ×A×V/(1000M)×100

式中,Y為橄欖多酚得率,%;ρ為待測(cè)液中多酚濃度,mg/mL;A為稀釋倍數(shù);V提取液總體積,mL;M為稱取的橄欖粉末質(zhì)量,g。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)橄欖多酚提取條件的優(yōu)化

1.2.3.1超聲波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,分別在150 W超聲波功率下各提取10、20、30、40、50、60 min。提取液按1.2.2法進(jìn)行多酚得率的計(jì)算,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.2超聲波功率對(duì)多酚得率的影響 稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,分別在超聲波功率為75、150、225、300、375、450 W條件下提取40 min。提取液按1.2.2法進(jìn)行多酚得率的計(jì)算,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.3微波功率對(duì)多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,超聲波功率300 W提取40 min,分別在微波功率為350、400、450、500、550、600 W條件下協(xié)同提取1 min,提取液按1.2.2法進(jìn)行多酚得率的計(jì)算,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.4微波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,各加入65%乙醇溶液30 mL,超聲波功率300 W提取40 min,分別在微波功率為500 W條件下協(xié)同提取1、2、3、4、5、6 min,提取液按1.2.2法進(jìn)行多酚得率的計(jì)算,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.5乙醇濃度對(duì)多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,分別加入45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液30 mL,超聲波功率300 W提取40 min,微波功率500 W條件下協(xié)同提取4 min,提取液按1.2.2法進(jìn)行多酚得率的計(jì)算,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.3.6液固比對(duì)多酚得率的影響稱取1 g橄欖樣品6份,分別加入65%乙醇溶液10、15、20、25、30、35 mL,超聲波功率300 W提取40 min,微波功率500 W條件下協(xié)同提取4 min,提取液按1.2.2法進(jìn)行多酚得率的計(jì)算,重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化橄欖多酚的提取工藝在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì),見(jiàn)表1,采用響應(yīng)面法分析所選4個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值(橄欖多酚得率)的影響,同時(shí)優(yōu)化橄欖多酚的提取工藝。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表1　Box-Behnken的中心組合因素水平表

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design expert 8.0.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2　結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

據(jù)步驟1.2.1得回歸方程:A=6.1977C+0.0592,R2=0.9987,表明在 0.025～0.150 mg/mL濃度范圍內(nèi),沒(méi)食子酸濃度C與吸光度A之間有著很好的線性相關(guān)性,如圖1所示。

圖1　沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of gallic acid

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1超聲波提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響由圖2可知,在40 min內(nèi),隨著超聲波提取時(shí)間的增長(zhǎng),多酚得率逐漸增大,當(dāng)提取時(shí)間延長(zhǎng)到40 min后,多酚得率開(kāi)始略有下降,但經(jīng)顯著性分析,無(wú)明顯差異,與曾培源等[11]采用超聲輔助提取橄欖多酚的單次提取時(shí)間40 min相同,因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中選擇的超聲波提取時(shí)間為40 min,且不作為響應(yīng)面考察條件。

圖2　超聲波提取時(shí)間對(duì)橄欖多酚得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic extraction time on the yield of polyphenols注:圖中不同字母表明差異性顯著(p<0.05),相同字母表示無(wú)顯著性差異(p>0.05),下同。

2.2.2超聲波功率對(duì)多酚得率的影響由圖3可知,隨著超聲波功率的增大,多酚得率逐漸增大,但是當(dāng)超聲波功率超過(guò)300 W以后,多酚得率開(kāi)始明顯下降。可能是由于大功率的超聲波導(dǎo)致某些多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,從而得率下降,這與王涓等[14]報(bào)道一致,故根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取超聲波功率225、300、375 W作為響應(yīng)面考察條件。

圖3　超聲波功率對(duì)橄欖多酚得率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.2.3微波功率對(duì)多酚得率的影響由圖4可知,在500 W的微波功率內(nèi),隨著功率的增大多酚得率逐漸增大,當(dāng)微波功率為500 W時(shí),多酚得率達(dá)到最大值。隨后呈逐漸下降的趨勢(shì)。可能是因?yàn)檩^大的微波功率使得多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,從而導(dǎo)致得率下降,這與閆海清等[9]報(bào)道一致。故根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取微波功率450、500、550 W作為響應(yīng)面考察條件。

2.2.4微波提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響由圖5知,隨著微波提取時(shí)間的增大,多酚的得率也隨之增大,但是當(dāng)提取時(shí)間大于4 min后,其得率開(kāi)始呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的微波輻射,導(dǎo)致提取溫度增大,某些多酚類物質(zhì)被降解,從而導(dǎo)致多酚得率下降,這與閆海清等[9]報(bào)道一致。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取微波提取時(shí)間3、4、5 min作為響應(yīng)面考察條件。

圖5　微波提取時(shí)間對(duì)橄欖多酚得率的影響Fig.5　Effect of microwave extraction time on the yield of polyphenols

2.2.5乙醇濃度對(duì)橄欖多酚得率的影響由圖6知,乙醇濃度在45%～65%的范圍內(nèi),隨著濃度的增加,多酚得率也隨之增大,但是65%的濃度范圍以后,得率開(kāi)始逐漸減少,原因可能是過(guò)高的乙醇濃度不能強(qiáng)有力地破壞橄欖中多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)的連接,使得多酚得率降低;但過(guò)低的乙醇濃度,會(huì)使糖類等水溶性雜質(zhì)的浸出率提高,多酚的得率也會(huì)降低,這與饒瑜等[15]報(bào)道一致。所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇濃度55%、65%、75%三個(gè)水平作為響應(yīng)面考察條件。

圖6　乙醇濃度對(duì)橄欖多酚得率的影響Fig.6　Effect of the concentration of ethanol on the yield of polyphenols

2.2.6液固比對(duì)橄欖多酚得率的影響由圖7知,液固比在10∶1～25∶1(mL/g)范圍內(nèi),橄欖多酚得率隨液固比的增加顯著提高,當(dāng)液固比超過(guò)25∶1(mL/g)時(shí),多酚得率基本沒(méi)有顯著變化,其原因可能是在料液比為25∶1(mL/g)時(shí),溶劑對(duì)多酚類物質(zhì)溶解已達(dá)到平衡,增加溶劑量對(duì)增加多酚的得率幾乎無(wú)影響,這與曾培源等[11]報(bào)道一致。故實(shí)驗(yàn)中選擇的料液比為25∶1(mL/g),并且不作為響應(yīng)面考察條件。

圖7　液固比對(duì)橄欖多酚得率的影響Fig.7　Effect of ratio of liquid to solid on the yield of polyphenols

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化橄欖多酚的提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken中心組合進(jìn)行四因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以微波功率、微波提取時(shí)間、超聲波功率和乙醇濃度為自變量,以橄欖多酚得率Y為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2。

表2　響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2中,1～24為析因?qū)嶒?yàn),25～29為中心實(shí)驗(yàn),29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn),其中析因點(diǎn)為因素A、B、C和D所構(gòu)成的多維空間頂點(diǎn),零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn),中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行5次,用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后,通過(guò)design expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合,獲得橄欖多酚得率對(duì)編碼自變量微波功率、微波時(shí)間、超聲功率和乙醇濃度的二次多項(xiàng)回歸。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立的數(shù)學(xué)模型為:

Y=6.24+0.20A+0.23B+0.093C-0.41D-0.069AB-0.071AC-0.054AD-0.19BC-0.31BD-0.39CD-0.36A2-0.55B2-0.57C2-0.71D2

模型的可靠性可通過(guò)方差分析和相關(guān)系數(shù)來(lái)考察。當(dāng)P(Pr>F)值小于0.01時(shí)影響為高度顯著,P(Pr>F)值小于0.05影響顯著。由表3的回歸分析結(jié)果可知,模型的P(Pr>F)值<0.0001,說(shuō)明回歸方程具有高度的顯著性。此外,R2=92.05%,表明響應(yīng)值橄欖多酚得率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度,該實(shí)驗(yàn)方案是可行的。一次項(xiàng)B和D對(duì)Y值的影響高度顯著(p<0.01),A對(duì)Y值也有顯著影響(p<0.05),交互項(xiàng)CD影響極顯著(p<0.01),BD也有顯著影響(p<0.05),二次項(xiàng)A2,B2,C2,D2對(duì)Y值也有極顯著的影響(p<0.01)。響應(yīng)曲面圖可以形象地描述各因素之間的相互作用,如圖8～圖13所示。

圖8　微波時(shí)間和微波功率對(duì)多酚得率的交互影響Fig.8　Effect of microwave extraction timeand microwave power on the yield of polyphenols

圖9　超聲功率和微波功率對(duì)多酚得率的交互影響Fig.9　Effect of ultrasonic power and microwave power on the yield of polyphenols

表3　回歸分析結(jié)果

圖10　乙醇濃度和微波功率對(duì)多酚得率的交互影響Fig.10　Effect of the concentration of ethanoland microwave power on the yield

圖11　超聲功率和微波時(shí)間對(duì)多酚得率的交互影響Fig.11　Effect of ultrasonic power and microwave extraction time on the yield of polyphenols

圖12　乙醇濃度和微波時(shí)間對(duì)多酚得率的交互影響Fig.12　Effect of the concentration of ethanoland microwave extraction time on the yield

圖13　乙醇濃度和超聲功率對(duì)多酚得率的交互影響Fig.13　Effect of the concentration of ethanoland ultrasonic power on the yield

注:**:差異高度顯著(p<0.01);*:差異顯著(p<0.05)。

當(dāng)響應(yīng)曲面坡度比較平滑,說(shuō)明響應(yīng)值受各個(gè)變量變化的影響較小,相反,當(dāng)響應(yīng)曲面坡度較陡峭,則說(shuō)明響應(yīng)值受變量交互作用較為明顯。通過(guò)比較圖8～圖13,考察微波功率、微波時(shí)間、超聲波功率和乙醇濃度四個(gè)因素兩兩之間交互作用對(duì)橄欖多酚提取的影響,可知乙醇濃度和微波時(shí)間以及乙醇濃度和超聲功率之間存在明顯的交互作用,這與響應(yīng)面曲線的分析結(jié)果相一致。

2.4橄欖多酚最佳提取條件的確定及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

通過(guò)design expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化工藝結(jié)果分析得到最佳提取工藝為:微波功率為550 W,微波時(shí)間為4.4 min,超聲功率為329.98 W,乙醇濃度為61.85%,此條件下模型給出的橄欖多酚得率預(yù)測(cè)值為6.35%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得預(yù)測(cè)值的可靠性,采用上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行橄欖多酚提取的工藝驗(yàn)證,考慮到實(shí)驗(yàn)中實(shí)際操作的方便,將上訴工藝條件修正為超聲波時(shí)間40 min、液料比25∶1(mL/g)、微波功率550 W、微波時(shí)間4.4 min、超聲功率330 W、乙醇濃度62%。在上述條件下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)三次,得到橄欖多酚得率的平均值為6.33%。此工藝參數(shù)下的結(jié)果與預(yù)測(cè)值非常接近,證明了響應(yīng)面法優(yōu)化橄欖多酚提取工藝參數(shù)的準(zhǔn)確性和有效性,說(shuō)明所建模型擬合良好且可靠。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)是在六個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取四個(gè)對(duì)橄欖多酚得率影響較大的四個(gè)因素(微波功率、微波時(shí)間、超聲功率和乙醇濃度)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化。從而得到了橄欖多酚的最佳提取工藝參數(shù):超聲波時(shí)間40 min、液料比25∶1(mL/g)、微波功率550 W、微波時(shí)間4.4 min、超聲功率330 W、乙醇濃度62%,在此條件下,橄欖多酚的得率可達(dá)6.33%,與預(yù)測(cè)值6.35%基本一致,說(shuō)明響應(yīng)面法得到橄欖多酚超聲微波提取工藝的條件真實(shí)可靠。充分利用超聲微波協(xié)同提取技術(shù)和響應(yīng)面分析,得到的工藝簡(jiǎn)單、快速、得率高,很好地兼顧了橄欖多酚提取的省時(shí)和高得率。

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Optimization of ultrasonic-microwave synergistic extraction of polyphenol fromCanariumalbumby response surface methodology

XIANG Zhao-bao,LIU Xing-yu

(College of Bio-Information,Chongqing University of Posts and Telecommunications,Chongqing 400065,China)

Objective:The technology for ultrasonic-microwave synergistic extracting polyphenols fromCanariumalbumwas optimized,which can provide certain references for actual production. Methods:On the basis of single factor experiments,the optimum conditions for the extraction of polyphenol was obtained by response surface methodology. Results:The optimum conditions of extracting polyphenol fromCanariumalbumwere as follows:microwave power 550 W,microwave extraction time 4.4 min,ultrasonic power 330 W,ethanol concentration 62%. Under these conditions,the polyphenol yield was 6.33%,which was close to the model predictive value of 6.35%. Conclusion:the optimum process was simple and rapid,which had good yield. Furthermore,this study offered not only an accurate and effective reference standard for industrial applications,but also a good reference value for widely exploitation and utilization ofCanariumalbumresource.

Canariumalbum;polyphenols;ultrasonic;microwave;extraction;response surface methodology

2015-01-23

項(xiàng)昭保(1977-)，男，教授，主要從事天然產(chǎn)物成分研究工作,E-mail:xiangzb@126.com。

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃一般項(xiàng)目(CSTC2014jcyjA10099);重慶郵電大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目(A2014-49)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000