范三紅,秦婉寧,李　靜,陳　超,杜靜婷

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030001)

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響應(yīng)面優(yōu)化超聲波提取油松花粉多酚的工藝研究

范三紅,秦婉寧,李靜,陳超,杜靜婷

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030001)

研究了油松花粉多酚的超聲波輔助提取工藝。在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上,通過Plackett-Burman篩選,確定出提取溫度、料液比和提取時間為顯著影響因子,選用3因素3水平的響應(yīng)面分析法來優(yōu)化油松花粉多酚的提取工藝。依據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合和回歸分析,確定影響油松花粉總酚得率的重要因素為提取時間和料液比,得出油松花粉多酚的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶32 g/mL、提取時間為31 min、提取溫度為51℃,在此工藝下總酚含量可達(dá)6.735mg/g。實驗結(jié)果顯示,超聲波輔助提取有效地優(yōu)化了油松花粉多酚的提取條件,為其開發(fā)利用提供了理論支持。

油松花粉,多酚,提取,響應(yīng)面

油松是我國資源豐富的特有樹種,其花粉量大,花粉顏色呈鮮黃色或淡黃色,形狀為粉狀顆粒。油松花粉含有大量的多糖、脂肪酸、黃酮、礦物質(zhì)和氨基酸,被稱作“微型營養(yǎng)庫”[1]。油松花粉的應(yīng)用歷史久遠(yuǎn),《神農(nóng)本草經(jīng)》把它視作上等藥,書中道長期服用可強身延年,它還可延緩衰老、抗疲勞、降血脂、增強人體免疫力,是一種具備藥用價值的天然食品材料。

長期的研究結(jié)果證明,多酚有較強的抗氧化能力,它能夠預(yù)防發(fā)生心血管疾病,還可以抗癌、抑菌消炎、提高人體免疫力[2]。根據(jù)對油松花粉中多酚的最佳提取工藝研究,可以總結(jié)出油松花粉在儲存過程中多酚含量的變化情況,為其儲存提供理論依據(jù)。

超聲波能夠產(chǎn)生機械振動,并具有強烈的空化效應(yīng)和熱效應(yīng),能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),從而加速目標(biāo)成分的溶出,不僅能縮短提取時間還同時避免了高溫對有效成分的破壞[3]。龔明貴等[4]提取油菜蜂花粉多酚利用的是超聲波輔助法,得率達(dá)16.25mg/g。本研究利用超聲波輔助乙醇浸提法提取油松花粉多酚,優(yōu)化了油松花粉多酚的提取條件,可有效提高多酚得率,縮短提取時間,節(jié)約生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)物質(zhì)量,為日后油松花粉的開發(fā)利用及其多酚的大量提取提供了參考依據(jù),并為多酚抗氧化等功能性質(zhì)的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

油松花粉山西省安澤縣惠原科貿(mào)有限責(zé)任公司;Folin-Ciocalteu試劑、沒食子酸、無水碳酸鈉、無水乙醇上述試劑均為分析純。

TG16A-WS型高速離心機武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司;JP-040ST型超聲波清洗機深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;JA1203N型電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司;SP-2000UV型紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1油松花粉預(yù)處理采用溫差-超聲波復(fù)合破壁法[5],將冷凍后的滅菌花粉迅速置于熱水中攪拌,冷卻至室溫后用功率為240 W的超聲波處理10 min,最后在電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥后得破壁花粉。

1.2.2油松花粉多酚提取流程破壁后的油松花粉加入乙醇→超聲波浸提→3000 r/min、5 min離心分離→取上清液→加入Folin-Ciocalteu試劑→搖勻后加入20%Na2CO3溶液→蒸餾水定容至20 mL→避光反應(yīng)1 h[6]。

1.2.3單因素實驗設(shè)計采用控制變量法[7],分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時間這四個因子對油松花粉多酚得率的影響。

1.2.3.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對油松花粉多酚得率的影響將料液比定為1∶20 g/mL,提取溫度40℃,提取時間30 min,分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0%、20%、40%、60%、80%、100%下研究乙醇體積分?jǐn)?shù)對油松花粉多酚得率的影響。

1.2.3.2料液比對油松花粉多酚得率的影響將乙醇體積分?jǐn)?shù)定為60%,提取溫度40℃,提取時間30 min,分別在料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL下探究料液比對油松花粉多酚得率的影響。

1.2.3.3提取時間對油松花粉多酚得率的影響將料液比為1∶20 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,提取溫度40℃,分別在提取時間為10、20、30、40、50、60 min下研究提取時間對油松花粉多酚得率的影響。

1.2.3.4提取溫度對油松花粉多酚得率的影響將料液比定為1∶20 g/mL,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,提取時間30 min,分別在提取溫度為30、40、50、60、70、80℃下研究提取溫度對油松花粉多酚得率的影響。

1.2.4Plackett-Burman篩選實驗設(shè)計在單因素實驗基礎(chǔ)上進(jìn)行PB實驗,應(yīng)用 Minitab15.1對乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比、提取時間這4個單因素進(jìn)行N=12PB設(shè)計及分析,以油松花粉總酚含量為指標(biāo),實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

1.2.5響應(yīng)曲面實驗設(shè)計通過單因素實驗的結(jié)果,選擇提取溫度、料液比和提取時間為3個考察因素,采用Box-Behnken進(jìn)行實驗,對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析后建立二次響應(yīng)回歸模型,擬合得到二次回歸方程。

表1　Plackett-Burman實驗設(shè)計因素水平表

表2　Box-Behnken實驗設(shè)計因素水平表

1.3油松花粉總酚含量的測定

選Folin-Ciocalteu法測定總酚的含量[8],用沒食子酸作為標(biāo)品來制作標(biāo)曲,得到吸光度與總酚質(zhì)量濃度的方程為:y=0.0563x+0.0659(R2=0.9996)

取1 mL油松花粉提取液加入20 mL試管中,依次加入Folin-Ciocalteu試劑0.2 mL,20%Na2CO3溶液2 mL,用蒸餾水來定容,室溫避光反應(yīng)1 h,于765 nm下測定吸光度,將其代入標(biāo)曲中,計算得式樣中總酚濃度,并計算油松花粉中總酚的含量。

式中:c為試管中油松花粉總酚濃度(μg/mL);v1為試管量程(20 mL);v2為反應(yīng)體系中油松花粉提取液體積(1 mL);v為總酚提取液總體積(mL);m為油松花粉質(zhì)量(g)。

1.4統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)測定3次,各項指標(biāo)的數(shù)據(jù)均用Origin 8.5軟件處理作圖,利用Minitab15.1進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對油松花粉多酚得率的影響通過圖1可知,油松花粉多酚得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增大后急劇減小。這大概是由于當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時,多酚和蛋白質(zhì)、多糖等之間的疏水作用力及氫鍵會隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而更易斷裂,使得多酚得率變大[9]。但乙醇體積分?jǐn)?shù)大于80%后,可能是由于油松花粉多酚水溶性較弱,醇溶性較強,由相似相溶原理可知,多酚得率開始下降[10]。綜合考慮,確定最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)對油松花粉多酚得率的影響Fig.1　Effect of ethanol volume fraction on the yield of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.1.2料液比對油松花粉多酚得率的影響通過圖2可知,油松花粉多酚得率隨料液比的減小先增大后減小。這可能是由于溶劑和樣品比例越大,濃度差則越大,進(jìn)而加快了傳質(zhì)的過程,但當(dāng)料液比小于1∶30 g/mL時,超聲波的效應(yīng)不再顯著,使得多酚得率不增加甚至降低[11],因此確定料液比1∶30 g/mL為宜。

圖2　料液比對油松花粉多酚得率的影響Fig.2　Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.1.3提取時間對油松花粉多酚得率的影響通過圖3可知,油松花粉多酚得率隨提取時間增加先增大后減小,且當(dāng)提取時間是30 min時達(dá)到最大值。這可能是因為提取時間較短時,超聲波的作用強度不夠,而油松花粉細(xì)胞破裂、多酚物質(zhì)的溶出需要一定的時間,多酚隨時間的增加能被充分提取,但當(dāng)時間過長,多酚物質(zhì)可能會被超聲波產(chǎn)生的巨大機械能所破壞[12],從而使得得率降低,因此確定最適提取時間是30 min。

圖3　提取時間對油松花粉多酚得率的影響Fig.3　Effect of extraction time on the yield of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.1.4提取溫度對油松花粉多酚得率的影響通過圖4可知,油松花粉多酚得率隨提取溫度的升高先增大后減小。當(dāng)溫度較小時,多酚溶解不充分,而隨著溫度升高,油松花粉多酚的溶出率也逐漸增大,當(dāng)溫度達(dá)到一定程度后,溶劑揮發(fā)過多及溫度過高導(dǎo)致油松花粉多酚的增加率與其損失率基本接近時[13],油松花粉多酚的得率將開始下降,故而確定最適溫度為60℃。

圖4　提取溫度對油松花粉多酚得率的影響Fig.4　Effect of extraction temperature on the yiled of polyphenols in Pinus tabulaeformis pollen

2.2Plackett-Burman篩選實驗結(jié)果分析

2.2.1PB實驗設(shè)計及結(jié)果

表3　PB實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2方差分析及顯著因子的確定應(yīng)用Minitab15.1進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表4。

表4　方差分析表

表5　回歸系數(shù)及顯著性檢驗

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。

由表5可得知,影響因子顯著性依次為C>A>D>B,其中A、C、D三個因子p<0.05,說明具有顯著性。因此,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%的條件下,選取提取溫度、料液比、提取時間為顯著因子來做響應(yīng)面分析,從而確定最優(yōu)組合。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化油松花粉多酚提取工藝結(jié)果分析

2.3.1響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果分析

表6　響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

運用Minitab15.0對表中的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合,獲得編碼空間的三元二次方程如下表示:

Y=6.745+0.106375A+0.586B+0.164125C-0.937375A2-0.827625B2-0.372375C2-0.115AB+0.07025AC-0.2575BC

對上述模型采取回歸分析,分析結(jié)果見表7。

表7　回歸方程方差分析

表8　回歸系數(shù)顯著性分析

從回歸系數(shù)顯著性分析表可見,實驗中常量、B、A2、B2、C2這五個因素對油松花粉多酚提取的影響是極顯著的,而A、C、BC這三個因素對油松花粉多酚提取有顯著性影響,說明料液比對多酚提取有極顯著影響,而提取溫度和提取時間對其有顯著影響,也說明提取溫度、料液比和提取時間對其的影響是非線性的。

2.3.2響應(yīng)面分析與優(yōu)化曲面圖能夠反映出多酚含量的大小,通過圖5可知當(dāng)提取溫度在44～56℃,料液比在1∶29～1∶35 g/mL時,多酚含量存在最大值。通過圖6可知當(dāng)提取溫度在43～54℃,提取時間在27～38 min時,多酚含量存在最大值。通過圖7可知料液比在1∶28.5～1∶35 g/mL,提取時間在22～40 min時,多酚含量存在最大值。

圖5　提取溫度和料液比交互影響多酚含量的響應(yīng)面圖Fig.5　Extraction temperature and liquid ratio interaction response surface figure of the polyphenol content

圖6　提取溫度和提取時間交互影響多酚含量的響應(yīng)面圖Fig.6　Extraction temperature and extraction time interaction response surface figure of the polyphenol content

圖7　料液比和提取時間交互影響多酚含量的響應(yīng)面圖Fig.7　Liquid ratio and extraction time interaction response surface figure of the polyphenol content

采用Minitab15.1的響應(yīng)優(yōu)化器來優(yōu)化預(yù)測油松花粉多酚的提取工藝條件,得出最佳的工藝條件是:提取溫度為50.5℃,料液比為1∶31.5 g/mL,提取時間為31 min,此時多酚含量最大為6.854mg/g。

2.4油松花粉多酚提取工藝條件驗證實驗

為了進(jìn)一步驗證響應(yīng)面實驗結(jié)論的準(zhǔn)確性,兼顧到實驗操作的可行性,對預(yù)測的最佳實驗條件進(jìn)行修正:提取溫度為51℃,料液比為1∶32 g/mL,提取時間為31 min,按照此優(yōu)化條件對油松花粉多酚進(jìn)行提取,實驗重復(fù)三次并取平均值為6.735mg/g,與理論值相比誤差為1.74%,說明所得參數(shù)可靠,能較好的預(yù)測油松花粉多酚的實際含量,具有很好的應(yīng)用價值。

3　結(jié)論

以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ),使用Minitab15.1軟件優(yōu)化超聲波輔助提取油松花粉多酚的工藝,結(jié)合實驗操作的可行性確定最佳實驗條件為提取溫度51℃,料液比1∶32 g/mL,提取時間31 min,在此條件下油松花粉多酚含量達(dá)6.735mg/g。

目前國內(nèi)外對油松花粉的研究利用較少,優(yōu)化油松花粉多酚提取工藝對多酚提取的關(guān)鍵共性技術(shù)有理論與實際應(yīng)用的指導(dǎo)意義,對開發(fā)花粉類、多酚類保健食品和藥品,提高花粉資源利用率和精加工提供一定的技術(shù)指導(dǎo),也為日后油松花粉多酚的進(jìn)一步分離鑒定及功能性研究奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of ultrasonic extraction of polyphenlos from the pollen of Pinus tabulaeformis by response surface

FAN San-hong,QIN Wan-ning,LI Jing,CHEN Chao,DU Jing-ting

(College of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030001,China)

The ultrasonic extraction process of Pinus tabulaeformis pollen polyphenols were studied.Based on the results of single factor experiment,through the Plackett-Burman selection,extraction temperature,liquid ratio and extraction time were determined the significant impact factors,three factors three levels of response surface analysis was chosen to optimize the extraction process of Pinus tabulaeformis pollen polyphenols.According to the model fitting and regression analysis of experiment data,liquid ratio and extraction time were determined the two significant factors which influence the total phenol yield of the Pinus tabulaeformis pollen,it was concluded that the optimal extraction conditions were ethanol volume fraction 80%,liquid ratio 1∶32 g/mL,extraction time 31 minutes and extraction temperature 51℃.Under the conditions,the yield of total phenols from Pinus tabulaeformis pollen can be up to 6.735mg/g.The results showed that the extraction process conditions were optimized effectively by the ultrasonic,providing theoretical support for the development and utilization of Pinus tabulaeformis pollen.

Pine pollen;polyphenols;extraction;response surface

2015-09-24

范三紅(1963-)，男，碩士，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:fsh729@sxu.edu.cn。

山西省自然科學(xué)基金項目(2012011031-4)；山西省高等學(xué)校高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化項目(20111003)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)07-0215-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.033