吳斌 孫才興 馮方 夏亮★

CELF1蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達及臨床意義

吳斌 孫才興 馮方 夏亮★

目的 探討CELF1在腦膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義。方法 采用免疫組織化學技術(shù)及Western blot檢測62例腦膠質(zhì)瘤患者中CELF1的表達情況，分析CELF1蛋白表達及臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)。采用Kaplan-Meier法進行生存分析。結(jié)果 在腦膠質(zhì)瘤中CELF1的表達上調(diào)，其表達上調(diào)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度及預(yù)后明顯相關(guān)。結(jié)論 CELF1可能成為膠質(zhì)瘤的獨立預(yù)后因素。

膠質(zhì)瘤 CELF1 預(yù)后

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，惡性膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性惡性腦腫瘤的70%［1］，盡管外科手術(shù)水平、放療、化療技術(shù)不斷提高，但并未能顯著改善腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，患者的中位生存期一般為9～12個月［2］。因此，發(fā)現(xiàn)新的分子生物學標記物對確定膠質(zhì)瘤的分子亞型和進行個體化治療及判斷預(yù)后具有重要意義。CELF1是CELF家族的成員之一，是一類發(fā)育調(diào)控的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)家族。然而，CELF1與腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚不清楚。本研究采用免疫組化染色和Western blot檢測62例腦膠質(zhì)瘤標本中CELF1蛋白的表達情況，并對其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系進行統(tǒng)計學分析，探討CELF1在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取本院2005年2月至2013年6月治療并有完整隨訪資料的62例患者標本，所有患者術(shù)前均未接受過放化療，其中男30例，女32例；年齡35～74歲，平均年齡53歲。低級別膠質(zhì)瘤（WHO I～II級）25例，高級別膠質(zhì)瘤（WHO III～IV級）37例。另有8例腦外傷患者行顱內(nèi)減壓手術(shù)切除的正常腦組織（NB）作為對照組。所有患者均行顯微神經(jīng)外科手術(shù)治療，并獲得明確病理診斷。術(shù)后高級別膠質(zhì)瘤患者均行標準同步放化療，放療劑量54～60Gy，并給予STUPP方案替莫唑胺輔助化療6個周期；低級別膠質(zhì)瘤有高危因素的患者行術(shù)后放療，放療劑量45～54Gy。

1.2 主要材料與試劑 CELF1多克隆抗體（Abcom公司，美國），辣根過氧化物酶（HRP） 標記的驢抗山羊IgG（H+L）（南通碧云天生物技術(shù)研究所），生物素化鼠抗山羊IgG免疫組化試劑盒 （德國漢堡Dako公司生產(chǎn)），抗β- actin單克隆抗體（南通碧云天生物技術(shù)研究所），Trizol 購自 Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄及半定量PCR 試劑盒購自Ferments公司；聚合過氧化物酶標記鼠抗山羊 IgG Western Blot 試劑盒 （南通碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 方法 （1）免疫組織化學法：選取材料（5μm）制備載玻片，并用10%聚賴氨酸覆蓋。用梯度乙醇溶液進行脫蠟，并且將切片浸泡在0.3%過氧化氫溶液中30min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。為了重新得到抗原，將切片置于10 mmol/L pH 6.0 的檸檬酸緩沖液中，并加熱至121℃保持20min。PBS（pH7.2）沖洗以阻止任何非特異性反應(yīng)，然后在室溫下加入驢血清（10%）反應(yīng)1h，再與山羊抗人CELF1多克隆抗體（1：100稀釋；Abcam公司，美國）在4℃下一起溫育過夜。根據(jù)過氧化物酶-抗過氧化物酶方法（Dako公司，德國）處理每個載玻片。PBS溶液沖洗后，將玻片與二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽一起置于0.05mol/L pH7.6的Tris緩沖液進行孵育，該緩沖液中含有0.03%的過氧化氫，然后發(fā)生過氧化物酶反應(yīng)。每個玻片都進行蘇木染色，隨后脫水并蓋片。為了評估CELF1在不同分級腫瘤中的表達，每個玻片選取10個隨機視野放大400倍進行檢查，并用萊卡光學顯微鏡（ Wetzlar，德國）進行檢測。每個標本隨機選取5個高倍視野，并檢測核染色。選擇＞500個細胞 進行計數(shù)計算平均百分比，即染色細胞的百分比。如果核染色＞5%定義CELF1蛋白表達為陽性（胞漿染色不算）。如果核染色分別＜5%、5%～30%、30%～70% 或＞70%，蛋白表達分別定義為（-）、（+）、（++）或 （+++）。（2）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）：提取總蛋白，并用牛血清白蛋白的方法檢測蛋白濃度（碧云天生物技術(shù)研究所，南通）。每一個樣品提取40μg蛋白質(zhì)裂解物，以10%丙烯酰胺凝膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后在350 mA下將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore公司，美國）反應(yīng)2.5h。采用脫脂牛奶（5%）阻斷反應(yīng)膜，利用針對CELF1（1：500，Abcam公司，美國），CDKN1B （1：1000，Sigma，美國），caspase-3 （1：1000，Abcam公司，美國），裂解的 caspase-3 （1：1000，Abcam公司，美國） 或 β-肌動蛋白 （1：2000，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）的第一抗體在4℃下一起孵育過夜。接著，加入HRP綴合的第二抗體（1：500，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）進行溫育。去除封閉液和抗體后，采用超增強化學發(fā)光（ECL，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）的Western印跡檢測試劑重新標記含有β-肌動蛋白的膜（1：2000，碧云天生物技術(shù)研究所，南通）。在ECL系統(tǒng)（碧云天生物技術(shù)研究所，南通）下觀察蛋白質(zhì)。每個蛋白條帶都可由光密度進行量化，以柱狀圖表示。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法和log-rank檢驗評估CELF1表達和患者生存的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 免疫組化結(jié)果表明CELF1蛋白定位于細胞核中，具有較高的表達（圖1）。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的總陽性率可達87.10%。在不同分級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均可觀察到由低至高的CELF1表達，而在正常腦組織中僅檢測到3例CELF1弱陽性（+）表達。54例腦膠質(zhì)瘤組織中檢測到不同水平的CELF1陽性表達（+，++，+++）； 其中31例高級別腦膠質(zhì)瘤中可檢測到CELF1的陽性（++）或強陽性（+++）表達；低級別腦膠質(zhì)瘤中有4例檢測到CELF1的陽性（++）或強陽性（+++）表達。表明CELF1表達隨著腫瘤等級的上升而增加。

2.2 Western blot 在不同分級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中均檢測出CELF1蛋白的表達。CELF在不同分級（I～IV）的膠質(zhì)瘤組織中的表達（1.06±0.15）顯著高于正常腦組織（0.36±0.08）（P＜0.01）。同時其表達在低等級膠質(zhì)瘤組織（I～II）（0.83±0.11）和高等級（III～IV）膠質(zhì)瘤組織（1.26±0.14）中差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 CELF1表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床病理特征之間的相關(guān)性 根據(jù)CELF1的表達譜，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的表達水平可分為高表達（+++++）或低表達（+，-）。實驗表明，CELF1表達水平與患者性別、年齡、腫瘤體積或起源部位之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。然而，CELF1的表達水平與腫瘤的病理分級具有顯著相關(guān)性（P=0.002）。在患者的總生存方面，高表達組和低表達組之間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。比較于CELF1表達較低的患者，CELF1表達上調(diào)患者的總生存時間更短。因此，CELF1表達可能成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的獨立預(yù)后因素。

圖1 正常腦組織和不同分級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中CELF1免疫組化的代表性切片（×400）

3 討論

目前的研究表明膠質(zhì)瘤是由多個基因之間的相互作用引起的復(fù)雜疾病，涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活［3］。CELF1是CELF家族的成員之一（CUGBP 和ETR樣因子），是一類發(fā)育調(diào)控的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)家族，在人類基因組中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CELF1、CUGBP2、CELF3、CELF4、CELF5及CELF6等6個家族成員［4］。這些蛋白質(zhì)的功能是多方面的，在哺乳動物細胞核中，CELF1至CELF6通過刺激非連續(xù)性外顯子的保留或刪除而調(diào)節(jié)一些mRNA［5］。此外還可通過RNA編輯酶而調(diào)節(jié)一些mRNA的編輯［6］。在細胞質(zhì)中，通過結(jié)合靶向mRNA的特定序列而調(diào)節(jié)一些mRNA的翻譯或降解前體的選擇性剪接［7］。利用這些調(diào)節(jié)途徑又進一步對機體的生物學功能產(chǎn)生廣泛的影響。Timchenko LT等［8］于1996年首先在幾個強直性肌營養(yǎng)不良癥（DM）細胞系、HeLa細胞和正?；颊叱杉〖毎抵蟹蛛x出（CUG）n mRNA前體/mRNA結(jié)合蛋白，并利用其在體外特異性結(jié)合（CUG）8寡核苷酸的特性而從HeLa細胞中純化2個蛋白質(zhì)、CELF1和CUGBP2。CELF1是正常細胞中主要的（CUG）8結(jié)合活性蛋白，而CUG-BP2水平在DM細胞的細胞核內(nèi)是升高的。這兩種蛋白是一種異基因核內(nèi)核糖核酸蛋白（hnRNP），hNab50的不同亞型，主要定位在細胞核，并且可能與體內(nèi)多聚腺苷酸化RNA的降解相關(guān)聯(lián)。myotonin蛋白激酶（Mt-PK）mRNA的（CUG）n重復(fù)區(qū)是CUGBP/hNab50的結(jié)合位點，并且能吸附該hnRNP到突變Mt-PK轉(zhuǎn)錄物上。

已有研究表明，CELF1可能影響胚胎發(fā)育包括心臟發(fā)育，骨骼和脂肪組織分化以及生殖細胞形成［9］。最近研究已經(jīng)表明，CELF1在許多人類惡性腫瘤中均存在過度表達，例如非小細胞肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、口腔癌、急性骨髓性白血病和急性B細胞淋巴瘤［10～15］。但CELF1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。

本研究通過免疫組化染色和Western blot證實了在不同分級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均存在由低至高的CELF1表達，而在正常腦組織中僅檢測到3例CELF1弱陽性（+）表達。表明在腦膠質(zhì)瘤組織中存在CELF1的過表達，且CELF1的表達程度與腦膠質(zhì)瘤患者的病理分級明顯相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、KPS評分無相關(guān)性，表明CELF1在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。在患者的總生存方面，CELF1高表達組和低表達組之間差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。相比較于CELF1表達較低的患者，CELF1表達上調(diào)患者的總生存時間更短。提示CELF1可以作為腦膠質(zhì)瘤患者一種可能的治療靶點和一個有價值的預(yù)后因素。而CELF1在腦膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)的分子機制目前仍有待于進一步的研究。

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Objective To discuss the clinical significance of the expression of CELF1 in glioma. Methods We examined CELF1 expression in 62 glioma patients by immunohistochemistry and Western blot.Analysing the association between the expression of CELF1 protein and clinicopathological characteristics. Survival analyses were performed using the Kaplan-Meier method.Result Our results showed that CELF1 protein was frequently up-regulated in human glioma tissues. The expression level of this protein was positively correlated with glioma World Health Organisation grade and inversely correlated with patient survival （P＜ 0.05）.Conclusion CELF1 may be a novel independent prognostic predictor of survival for glioma patients

Glioma CELF1 Prognosis

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科