李　梅，葉　燕，胡志剛，張　健，俞　蕾，陳國千

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇 無錫214023)

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BAS-TRFIA法檢測抗環(huán)瓜氨酸肽抗體方法學(xué)的建立

李梅*，葉燕*，胡志剛，張健，俞蕾，陳國千

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科，江蘇 無錫214023)

目的利用生物素-鏈霉親和素放大系統(tǒng)建立一種可快速、靈敏地定量檢測患者血清中抗環(huán)瓜氨酸肽(anticycliccitrullinatedpeptide,CCP)抗體的時間分辨熒光免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)。方法將鏈霉親和素同銪標記二乙烯三胺五乙酸酐結(jié)合制備銪標記鏈霉親和素衍生物；生物素同兔抗人IgG抗體結(jié)合制備生物素化IgG抗體，后者在免疫檢測系統(tǒng)中可聯(lián)結(jié)銪標記親和素和抗CCP抗體從而形成復(fù)合物。最后通過測量Eu3+-鏈霉親和素在615nm的熒光值計算血清抗CCP抗體水平。結(jié)果該方法具有更寬的線性范圍，其線性范圍為0.58-9463U/ml，而應(yīng)用ELISA試劑盒檢測線性范圍只有18.48-591.4U/ml。此外，該方法的抗CCP抗體檢測限可達0.5U/mL?；厥章蕿?6.45-104.63%。用BAS-TRFIA和ELISA法測得的值具有很好的相關(guān)性(R2=0.892 7)。結(jié)論本研究數(shù)據(jù)表明我們的建立的BAS-TRFIA法在測定抗CCP抗體上較傳統(tǒng)ELISA試劑盒有很大改進，為RA的診斷和治療提供了一個更為理想的免疫方法學(xué)選擇。

環(huán)瓜氨酸肽；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；時間分辨熒光免疫分析

(Chin J Lab Diagn,2016,20:1250)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一種炎癥性自身免疫性疾病，全球患病率為0.3-1%。RA可導(dǎo)致進行性關(guān)節(jié)侵蝕，治療不及時情況下可致殘并導(dǎo)致患者生活質(zhì)量嚴重下降。因此，早期診斷對RA患者的預(yù)后十分關(guān)鍵。早期，一系列瓜氨酸相關(guān)自身抗體包括抗核周因子、抗角蛋白抗體等不斷被發(fā)現(xiàn)，這些抗體被認為對早期的RA診斷具有較好的特異性[2]。1998年Schellekens等首次突破性證實含瓜氨酸的肽序列是RA特異的抗中間絲蛋白(filaggrin)相關(guān)蛋白抗體識別表位的必需組成。2000年Schellekens等報道將一條由19個氨基酸殘基組成的瓜氨酸肽鏈中的兩個絲氨酸替換為半胱氨酸，形成與β-轉(zhuǎn)角具有相似結(jié)構(gòu)的二硫鍵，合成CCP作為抗原用于ELISA法檢測抗CCP抗體[3]?？笴CP抗體可以檢測出高達80%的RA患者，特異性相當(dāng)高，尤其對鑒別侵蝕性RA十分有用[4]。

TRFIA是一種非放射性免疫分析方法，由于該方法所采用的鑭系元素具獨特的熒光性質(zhì)以及時間分辨測量模式，它比其他傳統(tǒng)熒光免疫法具更高的靈敏度[5]?；赥RFIA技術(shù)的生物分析方法已對臨床常規(guī)和研究領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響[6]。

目前，Eu3+標記的鏈霉親和素可作為一個很好的通用的間接標記物和時間分辨熒光系統(tǒng)相結(jié)合從而進一步放大信號且具有非特異性較低的特點。四聚體結(jié)構(gòu)的鏈霉親和素有4個生物素結(jié)合位點，從而可用于放大信號[7]。此外，銪元素作為通用熒光標記可用于大量生物活性物質(zhì)的高通量篩查[8，9]。

本文中我們制備了Eu3+-鏈霉親和素的銪螯合物，并將其作為結(jié)合生物素表面免疫基序的一個信號生成器。這是一種新的、快速的基于鏈霉親和素-生物素放大技術(shù)的抗CCP抗體的BAS-TRFIA測定法。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑芬蘭AutoDELFIA1235全自動TRFIA檢測儀、Eu3+標記的試劑盒以及Eu3+標記的增強液，芬蘭Wallac公司產(chǎn)品；96孔聚苯乙烯板和重組CCP抗原，德國AESKU產(chǎn)品；單克隆兔抗人IgM抗體、二乙二胺四乙酸(DTTA)，Sigma產(chǎn)品；牛血清白蛋白，衛(wèi)生部上海生物制品研究所產(chǎn)品；SephadexG25，Pharmacia產(chǎn)品；濃縮洗滌液和增強液由江蘇核醫(yī)學(xué)研究所提供；其他試劑均為分析純級試劑。

1.2ELISA試劑盒和抗CCP抗體標準品制備抗CCP抗體IgGELISA商品試劑盒分別為AESKU，Dr.Fenning和ORGENTEC產(chǎn)品，抗CCP抗體參考品來自AESKU。

1.3固相抗原制備

將重組CCP抗原用50mmoL/LNa2CO3-NaHCO3pH9.6緩沖稀釋制備成包被液，加至聚苯乙烯微孔板上100μl/孔，然后4℃孵育過夜。棄去包被液，沖洗3次后加入250μl含3g/LBSA的磷酸鹽緩沖液封閉未結(jié)合位點，4℃孵育過夜。棄去封閉液，將板條真空干燥，密封后置-20℃冷凍保存。

1.4生物素化抗人IgG抗體的制備

取1mgN-羥基琥珀酰亞胺生物素(BNHS)加至0.5mg的兔抗人IgG的pH7.2 0.05mol/LPBS緩沖液中，37℃反應(yīng) 1h，然后用PBS透析24h，分裝，使用前-20℃冷凍保存。

1.5Eu3+標記鏈霉親和素的制備

銪標記鏈霉親和素參照Eu3+標記盒說明書操作。將1mg克鏈霉親和素加載在PD10柱上，洗脫液為pH8.5 50mmoL/LNa2CO3-NaHCO3緩沖液(含0.155moL/LNaCl)。然后將鏈霉親和素混至0.2mgEu3+-二乙烯三胺五乙酸酐(DTPAA)，30℃條件下劇烈攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)液經(jīng)用pH7.8 80mmoL/LTris-HCl緩沖液平衡的SepharoseCL-6B柱(1×40cm)層析，分光光度儀280nm吸收波長檢測下收集蛋白峰。純化后，加等量AR甘油，分裝，-20℃保存。

1.6抗CCP抗體檢測

檢測采用間接ELISA法。在包被了CCP抗原的微孔板內(nèi)加100μl/孔經(jīng)反應(yīng)緩沖液稀釋的血清或參考標準品，25℃反應(yīng)震蕩孵育30min。用洗滌液沖洗板條4次，然后加生物素化兔抗人IgG抗體100μl/孔，25℃震蕩孵育30min。沖洗板條4次，然后加100μl/孔經(jīng)緩沖液稀釋的Eu3+標記的鏈霉親和素，震蕩孵育15min。洗滌6次后，加增強溶液100μl/孔，震蕩5min。用AutoDELFIA1235測量Eu3+熒光強度(CPS)。最后根據(jù)標準曲線計算樣品中抗CCP抗體的含量。

1.7方法學(xué)考核

①精密度檢測：將分裝儲存在-20℃的低、中、高3份混合血清樣品，混合血樣，隨樣品測定并分別計算混合血清樣品的變異系數(shù)(CV)值。②線性范圍試驗：取抗CCP抗體濃度最高的患者血清進行倍比稀釋后，分別用本文建立的BAS-TRFIA和ELISA兩種方法進行檢測。以稀釋倍數(shù)為橫坐標，熒光計數(shù)為縱坐標，得到線性稀釋濃度曲線圖。③靈敏度測試：測定20孔零點標準品，±2s為其最小測定值，即其靈敏度。④臨床應(yīng)用：收集52例健康獻血者血清標本以及32例系統(tǒng)性紅斑狼瘡、27例干燥綜合征、10例硬皮病、20例混合性結(jié)締組織病、23例多發(fā)性硬化癥患者血清標本，檢測這些血清標本中的抗CCP抗體水平，計算該檢測法的臨床特異性。⑤相關(guān)性實驗：取32例陽性血清樣品，分別用BAS-TRFIA和ELISA兩種方法進行檢測，計算其相關(guān)系數(shù)。⑥穩(wěn)定性試驗：將試劑盒置于37℃水浴箱7天，再與正常保存的試劑盒做對比。⑦回收率：三組含高濃度CCP抗體血清用樣本稀釋液稀釋后然后測定其濃度值。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS13軟件分析。分別用回歸分析和方差分析來計算相關(guān)性和測試的線性。批間和批內(nèi)變異采用CV計算。設(shè)定當(dāng)P<0.05時有認為統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1線性范圍將一CCP強陽性標本從9081稀釋到0.55U/ml并同時采用BAS-TRFIA法和ELISA法檢測。這兩種方法檢測的線性范圍，如圖1所示，我們看到了BAS-TRFIA法在9463-0.58U/ml有一個很好的線性范圍，而使用ELISA法的線性范圍落在591.4-18.48U/ml，表明我們建立的BAS-TRFIA法測定抗CCP抗體具有比ELISA法更寬的檢測范圍。

圖1　用TRFIA和ELISA法分別檢測一個抗CCP抗體陽性樣品稀釋濃度

2.2BAS-TRFIA法測定抗CCPIgG抗體的標準曲線如圖2所示，時間分辨熒光強度與抗CCP抗體濃度成正比?？笴CP抗體IgG濃度是2365.8，591.44，147.86，36.96，9.24，0.58U/mL?？笴CP抗體對標準曲線方程為y=3.79071+0.79505x+0.01094x2，其中X是抗CCP抗體濃度(GPLU/ml)和Y是熒光強度。零點標準品值加2個平均值定義為靈敏度，該方法的靈敏度是0.5U/ml。

圖2　抗CCP抗體TRFIA在不同濃度的標準曲線

2.3精密度試驗檢測高、中、低 3 種濃度混合血清的批內(nèi)(n=20)精密度和批間(n=8)精密度，和通過ELISA法所獲得的數(shù)據(jù)進行比較。如表1所示，采用TRFIA法檢測抗CCP抗體濃度為241.5，72.7，14.15U/ml的批內(nèi)CV值分別為3.16%，3.82%，4.24%，三種濃度的批間CV值分別為4.29%，4.68%，和4.97%。ELISA法檢測242.8，72.6，14.32U/m的這三種濃度的批內(nèi)CV值分別為6.12%，8.18%，和9.61%，批間CV值分別為7.268%，9.93%，和10.74%。顯然，我們建立的抗CCP抗體的BAS-TRFIA分析法的批間和批內(nèi)精密度比ELISA法高。

表1　批內(nèi)和批間精密度分析

2.4臨床應(yīng)用通過檢測52例健康獻血者，32例系統(tǒng)性紅斑狼瘡，27例干燥綜合征，10例硬皮病，20例混合性結(jié)締組織病，23例多發(fā)性硬化癥血清抗CCP抗體濃度來計算BAS-TRFIA法的特異性。交叉反應(yīng)如表2所示。

表2　不同類型患者抗CCP抗體特異性

2.5與ELISA法的相關(guān)性用BAS-TRFIA法與ELISA法同時測定32份血清濃度，并比較結(jié)果。結(jié)果顯示通過兩個試驗得到的散點圖顯示具有良好的相關(guān)性(如圖3)，相關(guān)系數(shù)是0.892 7。

圖3　BAS-TRFIA和ELISA的相關(guān)性

2.6BAS-TRFIA試劑盒的穩(wěn)定性將試劑盒分別在4℃和在37℃水浴存儲7天。然后比較BAS-TRFIA法與ELISA法的試劑盒的結(jié)合率(通過計算熒光計數(shù)值或吸光度的變化測得)。我們觀察到與常規(guī)條件下相比，BAS-TRFIA法的結(jié)合率沒有表現(xiàn)出明顯的變化(僅下降了12.1%)，ELISA試劑盒下降了17.7%，29.3%，36.3%。以上數(shù)據(jù)顯示我們建立的檢測試劑盒具有良好的穩(wěn)定性(表3)。

表3　BAS-TRFIA和ELISA的穩(wěn)定性比較

2.7回收率回收率=觀察到的濃度×100 /期望的濃度。第一個樣本的回收率分別為100.98%，102.25%，和 96.45%。第二樣本的回收率分別為100.46%，98.18%，和101.59%。第三個樣本的回收率分別為104.63%，97.18%，和98.17%。平均回收率的計算是九組回收率的平均值，結(jié)果為99.98%(表4)。

表4　BAS-TRFIA試劑盒的回收率

3　討論

為便于早期診斷，一個RA血清學(xué)標志能在疾病最早期就被檢測到是非常必要的。最近的一些研究表明抗CCP抗體可在病程早期即被檢測到，有助于該病的早期診斷。

在此，我們建立了應(yīng)用BAS系統(tǒng)的新型夾心TRFIA法，可快速定量測量臨床患者血清中抗CCP抗體水平，在傳統(tǒng)TRFIA技術(shù)和生物素親和素體高親和力相結(jié)合下具有高靈敏度的優(yōu)勢。實驗結(jié)果表明，新的TRFIA是一種很有前途的具高靈敏度和高特異性法的免疫熒光法，同時為檢測提供了更寬的工作線性范圍和更好的重復(fù)性。在圖1中，BAS-TRFIA在9463-0.58U/ml良好的線性范圍，相比之下，ELISA試劑盒在591.4-18.48U/ml的范圍內(nèi)。而擴大檢測范圍有利于提高RA早期診斷的靈敏度(10，11)。此外，新的方法與ELISA法具有良好的相關(guān)性相比，R2值為0.8927(圖3)。與ELISA相比，我們的建立的BAS-TRFIA其穩(wěn)定性能更好，這將保證更穩(wěn)定的收益(表3)?？偠灾覀冄芯拷⒌臋z測抗CCP抗體的BAS-TRFIA法為RA的診斷和治療提供了一個更為理想的免疫方法學(xué)選擇。

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Determination of Anticyclic Citrullinated Peptide Based on Biotin-Streptavidin-Amplified Time-Resolved Fluoroimmunoassay

LI Mei,YE Yan*,HU Zhi-gang，et al.

(Department of Clinical laboratory,Affiliated Wuxi People’s Hospital to Nanjing Medical University,Wuxi 214023,China)

ObjectiveArapidandsensitivetimeresolvedfluoroimmunoassay(TRFIA)basedonthebiotin-streptavidinamplificationsystemwasdevelopedforthedeterminationofanticycliccitrullinatedpeptide(anti-CCP).MethodsEuropium-labeledstreptavidinderivativescombinedwitheuropiumandanhydrideofdiethylenetriaminepentaaceticacidwereusedtolabelstreptavidin,biotinwascoupledwithrabbitantihumanIgGtoformabiotin-anti-humanIgGbridgebetweenstreptavidin-europiumandtheanti-CCPantibodyintheimmunoassay.Theanti-CCPassaywascarriedoutbymeasuringthefluorescenceofEu3+-streptavidinat615nm.ResultsThepresentedmethodproducedawidelinearrangefrom0.58to9,463U/ml,whileitwasonly591.4-18.48U/mlwhenusinganELISAkit,andfeaturedadetectionlimitupto0.5U/mlforanti-CCP.Thevaluesdeterminedbythebiotin-streptavidin-TRFIAandELISAcorrelatedwell(R2=0.8927).Themethodwasappliedtodetermineanti-CCPinserumsampleswithsatisfiedrecoveriesof96.45-104.63%.ConclusionTheassayresultsobtainedbythepresentmethodshowedthatbiotin-streptavidin-amplifiedTRFIAimprovethetraditionalELISAkitforanti-CCPdetection.Therefore,itoffersabetteralternativeimmunoassayinrheumatoidarthritismanagement.

cycliccitrullinatedpeptide;rheumatoidarthritis;time-resolvedfluoroimmunoassay

本項目受南京醫(yī)科大學(xué)重點項目(JMUZD057)、無錫市醫(yī)管中心面上項目(YGZXM14013)資助

1007-4287(2016)08-1250-05

R446.6

A

2016-02-15)