茹　琴　熊　琪　田　香　陳　琳　徐叢玥　李超英，2▲.湖北省江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北武漢　430056；2.湖北省漢濟(jì)生物科技（武漢）有限公司，湖北武漢　430075

灰樹花多糖D組分對細(xì)顆粒物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

茹琴1熊琪1田香1陳琳1徐叢玥1李超英1，2▲
1.湖北省江漢大學(xué)武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北武漢430056；2.湖北省漢濟(jì)生物科技（武漢）有限公司，湖北武漢430075

目的 研究灰樹花多糖D組分（D-fraction）對細(xì)顆粒物（SRM 2786）誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）損傷的保護(hù)作用。方法 利用細(xì)胞增殖實驗檢測SRM 2786或D-fraction對16HBE細(xì)胞增殖的影響，確定給藥濃度；將16HBE細(xì)胞分7組，分別為對照組、模型組（125 μg/mL SRM 2786）和不同濃度D-fraction給藥組（分別給予12.5、25、50、100、200 μg/mL D-fraction，同時給予125 μg/mL SRM 2786），細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞存活率，酶聯(lián)免疫法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）的含量。結(jié)果31.25～500 μg/mL SRM 2786處理使細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。125 μg/mL的SRM 2786刺激使16HBE細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF釋放顯著升高（P＜0.05），D-fraction（≥100 μg/mL）顯著抑制SRM 2786誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子釋放（P＜0.01），且能顯著提高損傷細(xì)胞存活率。結(jié)論 細(xì)顆粒物能抑制16HBE細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)炎癥因子釋放，D-fraction對細(xì)顆粒物造成的細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用，其作用機制可能與抑制炎癥因子釋放有關(guān)。

細(xì)顆粒物；炎性損傷；灰樹花多糖D組分；人肺支氣管上皮細(xì)胞

［Abstract］Objective To investigate the protective effect of Grifola frondosa D fraction（D-fraction）on human bronchial epithelial（16HBE）cell damage that induced by fine particulate matter（SRM2786）.Methods MTT assay was used to detect the survival rate of 16HBE cells treated with SRM2786 or D-fraction，and the concentration of SRM2786 or D-fraction used for further experiments was selected.16HBE cells were divided into seven groups，including control group，model group（125 μg/mL SRM 2786），D-fraction group（125 μg/mL SRM 2786+12.5 or 25 or 50 or 100 or 200 μg/mL D-fraction）.MTT assay was used to detect the survival rate，and enzyme-linked immune kits were used to detect the release of interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）.Results Compared with the control group，the cell survival rates of 16HBE cells treated with SRM 2786（31.25-500 μg/mL）were decreased remarkably（P＜0.05）.Treatment with 125 μg/mL SRM 2786 could significantly increase the release of IL-1β，IL-6，TNF-α and GM-CSF（P＜0.05）.D-fraction（≥100 μg/mL）could not only significantly improve the survival rate，but also significantly inhibit the release of inflammatory cytokines（P＜0.01）.Conclusion Fine particulate matter can inhibit cell proliferation and induce the release of inflammatory cytokines.D-fraction has a significant protective effect of cell damage caused by fine particulate matter，and the mechanism may be related to inhibit the release of inflammatory factors.

［Key words］Fine particulate matter；Inflammation damage；Grifola frondosa D-fraction；Human lung bronchial epithelial cells

細(xì)顆粒物（fine particlate matter，空氣動力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒）是霧霾中的首要污染物［1］，不易被鼻腔絨毛阻擋，能抵達(dá)細(xì)支氣管壁，引發(fā)哮喘、支氣管炎和心血管病等疾?。?］。細(xì)顆粒物濃度每增加10 μg/m3，總死亡風(fēng)險會上升4%，心肺疾病死亡風(fēng)險上升6%，肺癌死亡風(fēng)險上升8%［3］。

細(xì)顆粒物通過刺激肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞，誘發(fā)炎癥導(dǎo)致呼吸道局部免疫力下降和肺上皮細(xì)胞纖維化［4］。Veronesi等［5］發(fā)現(xiàn)細(xì)顆粒物使人支氣管上皮細(xì)胞中Ca2+升高，白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-8（IL-8）等釋放增多，推測細(xì)顆粒物中的酸性可溶成分通過辣椒素和pH敏感受體途徑刺激細(xì)胞因子釋放。此外，細(xì)顆粒物通過刺激血小板生長因子與轉(zhuǎn)化生長因子的產(chǎn)生，引起氣道壁纖維組織增厚，導(dǎo)致增生性炎癥發(fā)生［6］。

灰樹花（grifola frondosa）是一種藥食兼用珍稀真菌。自20世紀(jì)80年代始，國內(nèi)外學(xué)者從灰樹花子實體和菌絲體中提取了幾十種活性多糖，包括D-組分、MD-組分、X-組分等［7］。其中D-組分（D-fraction）是1984年日本學(xué)者Nanba提取的酸不溶性組分，含有以β-（1-6）結(jié)合為主鏈、β-（1-3）結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖和以β-（1-3）結(jié)合為主鏈、β-（1-6）結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖。D-fraction不僅能增強正常小鼠免疫功能［8］，還能通過提高免疫功能抑制腫瘤生長［9］。然而，D-fraction是否對細(xì)顆粒物引起的支氣管上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，目前尚無文獻(xiàn)報道。本實驗研究D-fraction對細(xì)顆粒物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE）損傷的保護(hù)作用，為細(xì)顆粒物的毒性機制研究以及新功能食品的開發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶和青鏈霉素購自Gibco公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自Sigma公司；IL-1β、IL-6、TNF-α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子（GM-CSF）酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒購自美國Biosource公司；D-fraction購自美國MushRoom Wisdom公司；其余試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞系

16HBE細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫，用完全培養(yǎng)基（含10%FBS和100 U青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基）于37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.3細(xì)顆粒物懸液制備

細(xì)顆粒物成分復(fù)雜，且隨著季節(jié)不斷變化，對肺細(xì)胞損傷的程度和機制也不同［10］，本實驗選用的細(xì)顆粒物為美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所提供的標(biāo)準(zhǔn)品SRM 2786，其成分分析報告可在官網(wǎng)查詢［11］。實驗所用細(xì)顆粒物懸液均為現(xiàn)用現(xiàn)配，將SRM 2786用完全培養(yǎng)基配成2000 μg/mL的儲存液，超聲振蕩混勻后用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.4細(xì)胞分組

實驗一中16HBE細(xì)胞分6組，分別加入不同濃度的SRM 2786（0、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL），細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞存活率，確定后續(xù)實驗中SRM 2786濃度。實驗二中16HBE細(xì)胞分10組，分別加入不同濃度的D-fraction（0、1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL），確定后續(xù)實驗中D-fraction濃度。實驗三中16HBE細(xì)胞分7組，分別為對照組、模型組（125 μg/mL SRM 2786）和不同濃度D-fraction給藥組（分別給予12.5、25、50、100、200 μg/mL D-fraction，同時給予125 μg/mL SRM 2786），細(xì)胞增殖實驗測定細(xì)胞存活率，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF的含量。

1.5細(xì)胞增殖實驗

16HBE細(xì)胞消化后接種于96孔板中，細(xì)胞密度為1×104個/孔，37℃培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度處理物質(zhì)，每個濃度設(shè)6個平行孔，同時設(shè)立無藥對照孔和無細(xì)胞空白孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液 （5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜，酶標(biāo)儀570 nm波長檢測吸光度值（A），按下面公式計算細(xì)胞存活率T/C（%）：T/C（%）=（A樣品組－A空白組）/ （A對照組－A空白組）×100%

1.6細(xì)胞因子含量測定

ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-1β、TNF-α和GM-CSF含量。16HBE細(xì)胞消化后接種于24孔板中，細(xì)胞密度為1×105個/孔，37℃培養(yǎng)24 h。分別加入不同濃度處理物質(zhì)，每個濃度設(shè)3個平行孔，同時設(shè)立無藥對照孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上清，按照試劑盒說明書操作步驟檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子含量。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組之間進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SRM 2786對16HBE細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，31.25 μg/mL SRM 2786處理組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），62.5～500 μg/mL SRM 2786處理組細(xì)胞存活率極顯著降低（P＜0.01），表明細(xì)顆粒物能顯著抑制16HBE細(xì)胞增殖。見表1。

表1　SRM 2786對16HBE細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1　SRM 2786對16HBE細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；SRM2786：細(xì)顆粒物；16HBE：人支氣管上皮細(xì)胞

細(xì)胞存活率（%）對照組SRM2786處理組組別　SRM 2786濃度（μg/mL）吸光度值（A）0 31.25 62.5 125 250 500 0.38±0.01 0.29±0.01 0.24±0.01 0.24±0.01 0.22±0.02 0.20±0.01 100±1.28 76.30±1.57*62.02±1.68**61.41±0.79**57.06±2.06**52.70±1.66**

2.2D-fraction對16HBE細(xì)胞增殖的影響

D-fraction濃度在1.56～50 μg/mL范圍內(nèi)，對16HBE細(xì)胞增殖無明顯影響（P＞0.05），在100～400 μg/mL范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率與對照組比較顯著增加 （P＜0.01），表明高濃度D-fraction（≥100 μg/mL）能顯著促進(jìn)16HBE細(xì)胞增殖。見表2。

表2　D-fraction對16HBE細(xì)胞增殖的影響（±s）

表2　D-fraction對16HBE細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；D-fraction：D組分；16HBE：人支氣管上皮細(xì)胞

組別　D-fraction濃度（μg/mL）　吸光度值（A）　細(xì)胞存活率（%）對照組給藥組0 1.56 3.125 6.25 12.5 50 100 200 400 1.67±0.15 1.55±0.16 1.59±0.35 1.71±0.35 1.85±0.34 1.81±0.12 1.88±0.23 2.32±0.29 2.50±0.27 100±4.76 95.71±10.78 102.62±10.47 110.98±10.33 108.65±3.70 112.89±6.89 139.58±8.85*150.13±8.05*184.26±12.40*

2.3D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細(xì)胞增殖的影響

D-fraction對SRM2786造成的細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用，D-fraction濃度在25～200 μg/mL范圍內(nèi)，隨著D-fraction濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸升高。見表3。

表3　D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細(xì)胞增殖的影響（±s）

表3　D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.01；D-fraction：D組分；SRM2786：細(xì)顆粒物；16HBE：人支氣管上皮細(xì)胞

組別　SRM2786濃度（μg/mL）D-fraction濃度（μg/mL）吸光度值（A）細(xì)胞存活率（%）對照組模型組給藥組0 125 125 125 125 125 125 00 12.5 25 50 100 200 1.77±0.02 0.93±0.02 0.97±0.01 1.33±0.07 1.50±0.04 1.59±0.05 1.60±0.12 100.00±1.15 53.10±1.06 54.67±0.29 75.09±3.92*84.60±2.04*90.05±2.61*90.22±7.05*

2.4D-fraction對SRM2786損傷的16HBE細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響

與對照組比較，125 μg/mL的SRM2786作用24 h后，16HBE細(xì)胞培養(yǎng)液中4種炎癥因子含量均顯著升高（P＜0.01）。D-fraction對SRM2786造成的炎癥細(xì)胞釋放有明顯抑制作用，高濃度（100、200 μg/mL）D-fraction共處理組4種炎癥因子均顯著降低 （P＜0.01）。見表4。

表4　D-fraction對SRM2786損傷16HBE細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響（±s）

表4　D-fraction對SRM2786損傷16HBE細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的影響（±s）

注：與對照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；D-fraction：D組分；SRM2786：細(xì)顆粒物；16HBE：人支氣管上皮細(xì)胞；IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子

組別　SRM2786濃度（μg/mL）D-fraction濃度（μg/mL）IL-1β濃度（ng/mL）IL-6濃度（ng/mL）TNF-α濃度（ng/mL）GM-CSF濃度（ng/mL）對照組模型組給藥組0 125 125 125 125 125 125 00 12.5 25 50 100 200 43.92±2.94 58.33±0.89#57.15±1.51 55.98±0.33*54.01±0.16**55.29±0.58**54.80±0.94**15.21±0.36 21.91±0.31#21.87±0.50 20.95±0.14 21.16±0.16 17.95±0.14**17.12±0.21**43.61±0.83 66.48±0.64#55.64±1.39**48.51±0.16**45.18±0.69**43.14±0.16**41.38±0.48**458.33±16.07 657.5±11.45#536.67±11.27**495.83±2.89**462.50±2.50**464.17±11.27**467.16±10.10**

3　討論

流行病學(xué)調(diào)查顯示細(xì)顆粒物的濃度與心肺系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率存在密切關(guān)聯(lián)［3］。體外實驗顯示細(xì)顆粒物能導(dǎo)致肺巨噬細(xì)胞凋亡［12］，顯著抑制人肺成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷［13］。本實驗結(jié)果顯示細(xì)顆粒物SRM 2786能顯著抑制16HBE細(xì)胞增殖，細(xì)胞存活率隨著細(xì)顆粒物濃度增加而降低，與前期研究結(jié)果一致［12-13］。

近年研究表明，D-fraction具有抗腫瘤及改善免疫功能的作用［15］，本實驗結(jié)果顯示高濃度D-fraction（≥100 μg/mL）對16HBE細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，還能顯著提高細(xì)顆粒物損傷細(xì)胞的存活率，表明D-frac tion對細(xì)顆粒物造成的細(xì)胞損傷有顯著保護(hù)作用。

顆粒物過度沉積對呼吸道產(chǎn)生刺激，使IL-1、IL-6釋放增加，進(jìn)而引起炎性細(xì)胞浸潤，同時，顆粒物可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)黏附分子，促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集，進(jìn)一步加強呼吸系統(tǒng)炎性反應(yīng)［15-16］。邵國軍等［17］研究顯示大鼠長期暴露于顆粒物環(huán)境后呼吸系統(tǒng)粘膜出現(xiàn)水腫、增生并有大量炎癥細(xì)胞滲入，肺巨噬細(xì)胞能會通過分泌IL-6、TNF-α等吸引更多炎癥細(xì)胞向顆粒物引起的炎癥部位聚集。本研究結(jié)果顯示，125 μg/mL細(xì)顆粒物刺激可使16HBE細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和 GM-CSF合成釋放增加，表明細(xì)顆粒物對機體具有潛在炎性損傷毒性。D-fraction與細(xì)顆粒物共處理對細(xì)顆粒物造成的炎癥細(xì)胞因子釋放有明顯抑制作用，其中高濃度（100、200 μg/mL）D-fraction組 4種炎癥細(xì)胞因子均顯著降低（P＜0.01），進(jìn)一步表明 D-fraction是通過降低細(xì)顆粒物對16HBE細(xì)胞造成的炎性損傷而起到保護(hù)作用的。

綜上所述，細(xì)顆粒物刺激可使人支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞存活率降低，IL-1β、IL-6、TNF-α和GM-CSF4種炎癥細(xì)胞因子釋放增加，D-fraction與對細(xì)顆粒物造成的炎癥細(xì)胞因子釋放具有明顯的抑制作用，能顯著提高損傷細(xì)胞的存活率，表明D-fraction對細(xì)顆粒物造成的細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，其作用機制可能與抑制炎癥因子表達(dá)釋放有關(guān)，為灰樹花多糖在細(xì)顆粒物損傷防治研究提供實驗基礎(chǔ)。

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Protective effects of Grifola frondosa D fraction on human bronchial epithelial cells damage induced by fine particulate matter

RU Qin1XIONG Qi1TIAN Xiang1CHEN Lin1XU Congyue1LI Chaoying1，2▲
1.Wuhan Institutes of Biomedical Sciences，Jianghan University，Hubei Province，Wuhan430056，China；2.Hanjea Biological Technology（Wuhan）Co.，Ltd.，Hubei Province，Wuhan430075，China

R962

A

1673-7210（2016）05（b）-0021-04

2016-01-25本文編輯：趙魯楓）