程　妍,劉春瑩,李泰厚,魚(yú)紅閃，*

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.韓國(guó)慶熙大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院漢方藥材料與加工,韓國(guó)京畿道龍仁市 446-701)

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雙亞基丹酚酸酯酶基因的表達(dá)載體構(gòu)建及其生物轉(zhuǎn)化

程妍1,劉春瑩1,李泰厚2,魚(yú)紅閃1，*

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.韓國(guó)慶熙大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院漢方藥材料與加工,韓國(guó)京畿道龍仁市 446-701)

為了實(shí)現(xiàn)丹酚酸酯酶的外源性表達(dá),利用了大腸桿菌和畢赤酵母兩種表達(dá)系統(tǒng),原核大腸桿菌采用pET 28a和pET 32a構(gòu)建表達(dá)載體,并對(duì)重組大腸桿菌進(jìn)行分別誘導(dǎo)表達(dá)和共表達(dá);真核畢赤酵母采用pPIC9K構(gòu)建共表達(dá)載體,對(duì)重組畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。研究結(jié)果表明,兩種體系均能誘導(dǎo)表達(dá)出丹酚酸酯酶,蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中得到了高效表達(dá),但未顯示出該酶活力。畢赤酵母系統(tǒng)可使蛋白分泌性表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物具有一定的丹酚酸酯酶活力,但表達(dá)量不高。說(shuō)明大腸桿菌系統(tǒng)體系更為適合大量表達(dá)丹酚酸酯酶,由此提供了一種該酶的外源表達(dá)方法。

丹酚酸酯酶,大腸桿菌,畢赤酵母,克隆表達(dá)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖,具有祛瘀通絡(luò),清心安神等功效[1]。近年來(lái)對(duì)丹參的藥理活性研究表明,丹參中的丹參素,又名D(+)β-(3,4-二羥基苯基)乳酸,具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基作用,是降低心肌梗死、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制血栓形成的有效成分,在心腦血管系統(tǒng)疾病防治等方面應(yīng)用廣泛[2]。但天然丹參中丹參素的含量比較低(約0.5%),且丹參植物資源有限,這大大限制了丹參素類(lèi)制劑的生產(chǎn)及研發(fā)。

丹酚酸B在丹參中的含量比較高(約2%～8%),而且丹酚酸B是由一分子咖啡酸和三分子丹參素酸縮合而成的化合物,內(nèi)含酯鍵。目前已有采用超高壓提取[3]、微波法[4]、堿法[5]提取丹參中丹參素的文獻(xiàn)報(bào)道,但關(guān)于生物酶法轉(zhuǎn)化丹酚酸B生成丹參素的研究卻寥寥無(wú)幾。本實(shí)驗(yàn)室已篩選到一株Absidiasp. D30s菌,所產(chǎn)酶能定向水解丹酚酸B上的酯鍵生成丹參素,暫命名為丹酚酸酯酶[6-7],分離純化后發(fā)現(xiàn)該酶由分子質(zhì)量分別為38 ku(亞基Ⅰ)和18 ku(亞基Ⅱ)的兩個(gè)亞基組成,并調(diào)取了丹酚酸酯酶2個(gè)亞基的基因全序列。Blast分析顯示,亞基Ⅰ序列與堿性蛋白酶基因序列、亞基Ⅱ序列與Cu,Zn超氧化物歧化酶基因序列,相似性很高,但這些酶都與水解丹酚酸B上的酯鍵毫無(wú)關(guān)系,表明新篩選到的丹酚酸酯酶是一種特異性的酶蛋白。

表1　克隆引物

本研究克隆并構(gòu)建了兩種應(yīng)用于丹酚酸酯酶的表達(dá)載體,對(duì)該酶基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達(dá)進(jìn)行了初步研究,以期尋求較為適合大量表達(dá)該酶的表達(dá)系統(tǒng)。一方面進(jìn)一步驗(yàn)證調(diào)取基因的正確性,另一方面,為構(gòu)建生物合成丹酚酸酯酶的工程菌及其規(guī)?；苽涮峁﹨⒖?。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

E.cloiBL21(DE3)、pET 28a(卡那霉素抗性)和pET 32a(氨芐青霉素抗性)寶生物工程(大連)有限公司;畢赤酵母和pPIC9K載體由韓國(guó)慶熙大學(xué)李泰厚教授實(shí)驗(yàn)室提供,共轉(zhuǎn)化雙亞基基因的畢赤酵母是在韓國(guó)慶熙大學(xué)李泰厚教授實(shí)驗(yàn)室完成;限制性核酸內(nèi)切酶、低分子質(zhì)量蛋白Marker、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0、In-Fusion?HD Cloning Kit寶生物工程(大連)有限公司;實(shí)驗(yàn)所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BioSafer9700 PCR熱循環(huán)儀賽飛生物科技有限公司;UV-120-02型分光光度計(jì)日本京都Shimadzu公司;HimacCF15R型高速冷凍離心機(jī)賽默飛世爾科技公司;JM-250型電泳儀大連競(jìng)邁生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1目的基因擴(kuò)增以實(shí)驗(yàn)室前期反轉(zhuǎn)錄得到的雙亞基丹酚酸酯酶cDNA序列為模板,設(shè)計(jì)克隆引物(表1)。使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase PCR擴(kuò)增亞基Ⅰ基因CDS區(qū)1212 bp,片段兩側(cè)添加NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn),擴(kuò)增亞基Ⅱ基因CDS區(qū)465 bp,片段兩側(cè)添加BalⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。PCR條件:98 ℃變性2 min,98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸60 s,完成30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物加A連接至pGM-T載體后委托寶生物(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2重組質(zhì)粒(pET 28a和pET 32a)構(gòu)建與大腸桿菌轉(zhuǎn)化將載體pGMT-Ⅰ(亞基Ⅰ)和表達(dá)載體pET 28a分別使用NcoⅠ/XhoⅠ進(jìn)行酶切,載體pGMT-Ⅱ(亞基Ⅱ)和表達(dá)載體pET 32a分別使用BalⅠ/XhoⅠ進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物連接,熱轉(zhuǎn)化至E.coliCompetent Cell JM109中,涂布平板,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性菌落植菌,提取質(zhì)粒,委托寶生物(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。提取重組質(zhì)粒pET 28a-Ⅰ(亞基Ⅰ)和pET 32a-Ⅱ(亞基Ⅱ)分別熱轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中。將等量pET 28a-Ⅰ和pET 32a-Ⅱ質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中,涂布抗性平板篩選單菌落。

1.2.3重組質(zhì)粒在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)含pET 28a-Ⅰ重組菌接入含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,含pET 32a-Ⅱ重組菌接入含氨芐抗生素LB培養(yǎng)中,共含pET 28a-Ⅰ和pET 32a-Ⅱ重組菌接入含卡那霉素和氨芐抗生素雙抗性的LB培養(yǎng)中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,2%接種量接種至新的含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8,加入IPTG(終濃度0.5 mmol/L),37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h后離心收集菌體,用PBS(pH7.4)緩沖液重懸洗滌兩次,加入PBS重懸,超聲破碎離心收集上清液和沉淀,采用硫銨沉淀及透析技術(shù)[8]對(duì)上清液進(jìn)行濃縮(可用于酶活性檢測(cè))并進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠,12%分離膠)檢測(cè)[9]。

1.2.4重組質(zhì)粒在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)將整合入丹酚酸酯酶雙亞基基因的畢赤酵母接種到25 mL BMGY培養(yǎng)基中,28 ℃下振蕩培養(yǎng)18 h,至OD600達(dá)到2.0～6.0。離心收集菌體重懸于25 mL BMMY培養(yǎng)基中,28 ℃振蕩培養(yǎng)144 h,每隔24 h補(bǔ)加100%甲醇(終濃度0.5%)。將培養(yǎng)液離心,收集發(fā)酵液上清,采用硫銨沉淀及透析技術(shù)對(duì)上清液進(jìn)行濃縮(可用于酶活性檢測(cè))并進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠,12%分離膠)檢測(cè)前可再經(jīng)TCA濃縮。

1.2.5表達(dá)產(chǎn)物酶活性的TLC檢測(cè)上述大腸桿菌和畢赤酵母的重組菌經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng),發(fā)酵液濃縮與0.1%的丹酚酸B溶液按體積比1∶1混勻,于40 ℃反應(yīng)16 h,加入飽和正丁醇終止反應(yīng),展開(kāi)劑為乙酸乙酯∶甲酸=10∶1,均勻噴灑顯色劑(5% FeCl3),利用TLC法[10]檢測(cè)酶活性。

2　結(jié)果與分析

2.1亞基Ⅰ和亞基Ⅱ基因的克隆

以雙亞基丹酚酸酯酶cDNA序列為模板,PCR擴(kuò)增,得到了大小約為1200 bp和500 bp的DNA片段(圖1),與理論值(亞基Ⅰ 1212 bp,亞基Ⅱ 465 bp)相符。將PCR產(chǎn)物加A連接至pGM-T載體后送至寶生物(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序顯示,亞基Ⅰ基因CDS區(qū)長(zhǎng)1212 bp;亞基Ⅱ基因CDS區(qū)長(zhǎng)465 bp,與參考序列一致。

圖1　PCR擴(kuò)增目的基因Fig.1　Amplification of insert DNA by PCRM:DL 2000 DNA Marker;注：1:亞基Ⅱ PCR擴(kuò)增;2:亞基Ⅰ PCR擴(kuò)增。

2.2重組質(zhì)粒pET28a和pET32a的構(gòu)建

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn),pGMT-Ⅰ經(jīng)NcoⅠ/XhoⅠ酶切后得到亞基Ⅰ產(chǎn)物大小約為1212 bp,由于上樣濃度高,而出現(xiàn)了pGMT-Ⅰ酶切不完全現(xiàn)象(圖2a泳道1);載體pGMT-Ⅱ經(jīng)BalⅠ/XhoⅠ酶切后得到亞基Ⅱ大小約為465 pb(圖2a泳道2);空載體pET 28a經(jīng)NcoⅠ/XhoⅠ酶切后得到產(chǎn)物大小約為5400 bp(圖2b泳道3);空載體pET 32a經(jīng)BalⅠ/XhoⅠ酶切后得到產(chǎn)物大小約為5900 bp(圖2b泳道4),均與理論值相符,回收酶切產(chǎn)物。按1.2.2方法得到重組質(zhì)粒pET 28a-Ⅰ和pET 32a-Ⅱ,送至寶生物(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與參考序列一致,表明表達(dá)質(zhì)粒pET 28a-Ⅰ和pET 32a-Ⅱ構(gòu)建成功。

圖2　pGMT-Ⅰ、pGMT-Ⅱ、pET 28a、pET 32a酶切產(chǎn)物回收Fig.2　Enzyme digestion of pGMT-Ⅰ、pGMT-Ⅱ、pET 28a、pET 32a注：a:pGMT-Ⅰ、pGMT-Ⅱ酶切產(chǎn)物;b:空載體pET 28a、空載體pET 32a酶切產(chǎn)物；M:Marker;a1:pGMT-Ⅱ經(jīng)BalⅠ/XhoⅠ酶切;a2:pGMT-Ⅰ經(jīng)NcoⅠ/XhoⅠ酶切;b3:pET 28a經(jīng)NcoⅠ/XhoⅠ酶切;b4:pET 32a經(jīng)BalⅠ/XhoⅠ酶切。

2.3重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

按1.2.3方法得到外源目的基因單獨(dú)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)(圖3、圖4),分別與空質(zhì)粒pET 28a和空質(zhì)粒pET 32a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)作對(duì)照,結(jié)果顯示均有一條明顯的蛋白表達(dá)差異條帶,并且表達(dá)量占菌體總蛋白量較高,表明外源目的基因均能高效表達(dá)。但蛋白質(zhì)表觀分子質(zhì)量都較核酸序列推測(cè)所得的理論分子質(zhì)量(38 ku和18 ku)偏大。

圖3　SDS-PAGE電泳分析(亞基Ⅰ)Fig.3　SDS-PAGE analysis(subunit Ⅰ)注：M,Protein MW marker;1,pET 28a全細(xì)胞;2,pET 28a上清;3,pET 28a沉淀;4,破碎全細(xì)胞;5,破碎上清;6,破碎沉淀。

圖4　SDS-PAGE電泳分析(亞基Ⅱ)Fig.4　SDS-PAGE analysis(subunit Ⅱ)注：M,Protein MW marker;1,pET 32a全細(xì)胞;2,pET 32a上清;3,pET 32a沉淀;4,破碎全細(xì)胞;5,破碎上清;6,破碎沉淀。

pET 28a-Ⅰ、pET 32a-Ⅱ分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后,經(jīng)誘導(dǎo)都可高效表達(dá)目的蛋白,且目的蛋白占菌體總蛋白量較高,但存在表觀分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量不一致的現(xiàn)象。Simone[11]等人和Richards[12]等人的研究中都已報(bào)道過(guò)表觀分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)不一致的現(xiàn)象,但產(chǎn)生偏差的原因還尚未完全闡明,推測(cè)可能與不合適的電泳條件[13]、結(jié)構(gòu)的變化或電荷分布不均[14]等有關(guān),侯穎[15]等利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)得到過(guò)表觀分子質(zhì)量偏高于理論值的重組蛋白,分析后確定為短肽間單獨(dú)的巰基與谷胱甘肽發(fā)生了縮合反應(yīng)所引起的。由于導(dǎo)致分子質(zhì)量偏差的因素較多,更具體的原因還有待于今后進(jìn)一步的研究。

按1.2.3方法得到外源目的基因共表達(dá)產(chǎn)物,與共轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pET 28a和空質(zhì)粒pET 32a的大腸桿菌BL21(DE3)對(duì)照,在位置分別與pET 28a-Ⅰ和pET 32a-Ⅱ單獨(dú)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)相同處,有兩條新增蛋白質(zhì)帶,結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中的目的基因在陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)系統(tǒng)中有表達(dá),但重組質(zhì)粒pET 32a表達(dá)不明顯(圖5)。

圖5　SDS-PAGE電泳分析(亞基Ⅰ+亞基Ⅱ)Fig.5　SDS-PAGE analysis(subunit Ⅰ+subunit Ⅱ)注：M,Protein MW marker;1,pET 28a+pET 32a全細(xì)胞;2,pET 28a+pET 32a上清;3,pET 28a+pET 32a沉淀;4,破碎全細(xì)胞;5,破碎上清;6,破碎沉淀。

一般認(rèn)為,復(fù)制子相同的兩種質(zhì)粒不能同時(shí)穩(wěn)定地保持在一個(gè)細(xì)胞內(nèi),兩種質(zhì)粒在復(fù)制及分配到子代細(xì)胞過(guò)程中彼此競(jìng)爭(zhēng),容易導(dǎo)致子代細(xì)胞中兩種質(zhì)粒復(fù)制的失衡,而易丟失一種質(zhì)粒[16],質(zhì)粒pET 28a和質(zhì)粒pET 32a具有相同復(fù)制子,外源基因單獨(dú)表達(dá)時(shí)表達(dá)量較高,在被共同轉(zhuǎn)入一個(gè)細(xì)胞時(shí),推測(cè)可能因?yàn)橘|(zhì)粒的不相容性而發(fā)生了質(zhì)粒復(fù)制的不均等現(xiàn)象,從而形成了蛋白質(zhì)表達(dá)量的不一致,但仍實(shí)現(xiàn)了丹酚酸酯酶亞基Ⅰ和亞基Ⅱ在大腸桿菌中的共表達(dá)。

2.4重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)

丹酚酸酯酶基因在畢赤酵母中共表達(dá)方面的研究,與韓國(guó)慶熙大學(xué)李泰厚教授團(tuán)隊(duì)共同合作完成,本實(shí)驗(yàn)室前期調(diào)取的亞基Ⅰ及亞基Ⅱ基因在慶熙大學(xué)進(jìn)行了pPIC9K共表達(dá)載體的構(gòu)建。以pGMT-Ⅰ為模板,PCR擴(kuò)增亞基Ⅰ基因CDS區(qū)1212 bp,片段兩側(cè)添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn),克隆至pPIC9K表達(dá)載體中,PmeI線性化后電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中。以pGMT-Ⅱ?yàn)槟０?PCR擴(kuò)增亞基Ⅱ基因CDS區(qū)465 bp,片段兩側(cè)添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn),克隆至pPIC9K表達(dá)載體中,SacI線性化后電轉(zhuǎn)化至上述已整合上亞基Ⅰ基因的畢赤酵母中,測(cè)序檢測(cè)亞基Ⅰ基因和亞基Ⅱ基因,實(shí)現(xiàn)共轉(zhuǎn)化。

重組畢赤酵母經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)所得的發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定(圖6),經(jīng)與未添加甲醇誘導(dǎo)的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子做對(duì)照,在約38 ku和約18 ku處各得到一條蛋白表達(dá)差異條帶,與核酸序列推測(cè)所得的理論分子質(zhì)量基本不一致,表明重組質(zhì)粒pPIC9K在畢赤酵母中表達(dá)成功,丹酚酸酯酶實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的表達(dá),但表達(dá)量不高。

圖6　SDS-PAGE電泳分析(亞基Ⅰ+亞基Ⅱ)Fig.6　SDS-PAGE analysis(subunit Ⅰ+subunit Ⅱ)注：M,Protein marker;1,無(wú)甲醇誘導(dǎo)菌株;2,甲醇誘導(dǎo)菌株。

2.5表達(dá)產(chǎn)物TLC活性檢測(cè)

重組質(zhì)粒pET 28a-Ⅰ和pET 32a-Ⅱ的共轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)酶反應(yīng)后進(jìn)行TLC活性檢測(cè)結(jié)果(圖7)顯示,沒(méi)有酶反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生,說(shuō)明其產(chǎn)物未具有丹酚酸酯酶活性。畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)酶反應(yīng)后進(jìn)行TLC活性檢測(cè),得到了酶反應(yīng)產(chǎn)物,說(shuō)明其表達(dá)產(chǎn)物具有一定的丹酚酸酯酶的催化活性。

圖7　大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物及畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物酶反應(yīng)薄層層析圖Fig.7　TLC of E. coli expression products and Pichia pasioris expression products注：底,0.1%丹酚酸B溶液和水反應(yīng);1,共表達(dá)大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物酶反應(yīng)產(chǎn)物;2,畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物酶反應(yīng)產(chǎn)物。

如2.3所述,大腸桿菌中外源基因各自單獨(dú)表達(dá)時(shí),均可高效表達(dá)目的蛋白質(zhì)(圖3、圖4),關(guān)于丹酚酸酯酶在大腸桿菌中能夠高效表達(dá)的原因目前并不十分清楚,推測(cè)這可能與表達(dá)系統(tǒng)特性和外源基因本身特性這兩方面有關(guān)。Grosjean[17]等的研究顯示,在翻譯的過(guò)程中,宿主菌存在著對(duì)密碼子的偏好性,丹酚酸酯酶在大腸桿菌中能夠高效表達(dá),一種可能原因是基因序列中高頻出現(xiàn)的密碼子在大腸桿菌中很多見(jiàn)。

大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白質(zhì)未顯示出丹酚酸酯酶活力,推測(cè)有如下幾種可能原因。重組蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí),可能由于不能正確折疊而形成了無(wú)活性的包涵體,李單單[18]等的文獻(xiàn)報(bào)道,外源基因在表達(dá)時(shí)包涵體的出現(xiàn)可能也會(huì)影響其具有生物活性的四級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。外源基因共表達(dá)時(shí),兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)量存在差異(圖5),這也可能會(huì)影響到雙亞基蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)組裝,進(jìn)而影響其酶活力的發(fā)揮。Large[19]等的文獻(xiàn)報(bào)道,蛋白質(zhì)分子量的偏差變化可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的組裝產(chǎn)生影響,從而影響其生物活性的發(fā)揮。大腸桿菌為原核表達(dá)系統(tǒng),其也可能因缺少真核生物的翻譯后修飾系統(tǒng)而使蛋白表達(dá)不出活性[20]。丹酚酸酯酶在大腸桿菌中高效表達(dá)的外源蛋白包涵體富含重組蛋白,進(jìn)行有效的變復(fù)性處理后,獲得大量得丹酚酸酯酶將成為可能。目前,應(yīng)用最普遍的復(fù)性方法有稀釋、透析、超濾等,其中稀釋法因其簡(jiǎn)單、有效而成為許多重組蛋白包涵體復(fù)性的首選方法[21],近年來(lái),色譜技術(shù)也廣泛的應(yīng)用到了蛋白質(zhì)復(fù)性中[22],但由于丹酚酸酯酶相對(duì)分子質(zhì)量偏差等因素的影響,該酶的變復(fù)性條件仍需要進(jìn)行進(jìn)一步探討。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)由于具備對(duì)翻譯后蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾和加工的生物環(huán)境,使得分泌表達(dá)出的丹酚酸酯酶具有一定的生物學(xué)活性(圖7),但表達(dá)量并不高(圖6)。雖然許多蛋白質(zhì)在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量很高,但也有些蛋白質(zhì)的表達(dá)量很低,Fidler[23]等利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)綿羊卵泡促激素發(fā)現(xiàn),因糖基化影響其表達(dá)量?jī)H為0.1 μg/L。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的丹酚酸酯酶量不高,推測(cè)這可能與外源基因整合到畢赤酵母上的拷貝數(shù)過(guò)低有關(guān)。Sreekrishna[24]等的研究顯示,整合了20個(gè)腫瘤壞死因子基因在染色體上的畢赤酵母,其重組子表達(dá)水平是單拷貝重組子的200倍。具體影響畢赤酵母中丹酚酸酯酶表達(dá)水平的因素還需今后進(jìn)一步研究。

3　結(jié)論

本論文成功構(gòu)建了應(yīng)用于丹酚酸酯酶異源表達(dá)的兩種表達(dá)體系:大腸桿菌表達(dá)體系與畢赤酵母表達(dá)體系。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)丹酚酸酯酶高效表達(dá),并且外源基因在單獨(dú)表達(dá)時(shí)的表達(dá)量占菌體總蛋白量較高,部分可能形成包涵體,酶活力喪失;利用畢赤酵母表達(dá)體系可以使蛋白分泌性表達(dá),所共表達(dá)的重組蛋白具有的一定的丹酚酸酯酶的催化活性,但表達(dá)量不理想。

由此可見(jiàn),畢赤酵母雖然是真核表達(dá)系統(tǒng),可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后加工及修飾,可能更利于表達(dá)真核生物的蛋白,但不同的外源蛋白在同一表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量卻存在著千差萬(wàn)別。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠使丹酚酸酯酶高效表達(dá),并且形成的包涵體富含重組蛋白,尋求到適合的體外復(fù)性條件后,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)將會(huì)是大量生產(chǎn)重組蛋白的最有效途徑之一,隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程學(xué)及相關(guān)新技術(shù)及設(shè)備的發(fā)展完善,設(shè)計(jì)最佳的該酶的包涵體變復(fù)性方案將成為可能。大腸桿菌表達(dá)體系還具有培養(yǎng)周期短、成本低、高效表達(dá)和易于純化等優(yōu)點(diǎn),也使其更適合于生產(chǎn)中應(yīng)用[25]。因此,大腸桿菌體系更為適合丹酚酸酯酶的大量表達(dá),對(duì)研究利用工程菌生物合丹酚酸酯酶具有指導(dǎo)意義。

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Vector construction and biotransformation of double subunits salvianolic acid-esterase

CHENG Yan1,LIU Chun-ying1,YL Taehoo2,YU Hong-shan1，*

(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.Department of Oriental Medicinal Material and Processing,College of Life Science,Kyung Hee University,Yongin 446-701,Korea)

In order to achieve the salvianolic acid-esterase expressinvitro,the salvianolic acid-esterase were heterologous expressed byE.coliandPichiapasiorisrespectively. TheE.coilsystem constructed expression vector with pET 28a and pET 32a and carried out induced expression and coexpression of the recombinantE.coil. ThePichiapastorissystem constructed coexpression vector with pPIC9K and carried out induced expression of the recombinantPichiapastoris. The research found that the salvianolic acid-esterase were induced inE.coliandPichiapasioris. The protein was highly expressed inE.colisystem,but it did not exhibit the enzyme activity. The salvianolic acid-esterase were expressed inPichiapasioris,and the expression product had salvianolic acid-esterase activity. But the quantity of expression was not high. It showed that theE.coliexpression system was more suitable for the salvianolic acid-esterase and provided a exogenous expression method of salvianolic acid-esterase.

salvianolic acid-esterase;E.coil;Pichiapastoris;cloning and expression

2016-01-12

程妍(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化，E-mail:13478610863@163.com。

魚(yú)紅閃(1968-)，男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化，E-mail:hongshan@dlpu.edu.cn。

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX09503001-003)；國(guó)家外專(zhuān)局高端外國(guó)專(zhuān)家項(xiàng)目(GDT20152100019)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0143-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.020