劉　源,李蕾蕾,張　濤,婁　菲,?！∶?金青哲,王興國

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心 江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

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碳源對(duì)裂殖壺菌類胡蘿卜素積累的影響

劉源,李蕾蕾,張濤,婁菲,常明,金青哲*,王興國

(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心 江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

本文研究了葡萄糖和甘油分別作為單一碳源對(duì)裂殖壺菌ATCC20888發(fā)酵過程中脂質(zhì)和類胡蘿卜素變化特性的影響,初步討論了在裂壺藻中類胡蘿卜素與脂質(zhì)代謝之間的關(guān)系。結(jié)果表明,作為碳源,葡萄糖相比甘油更有利于菌體生長,而甘油更有利于脂質(zhì),尤其是DHA的積累。此外,碳源不同,總類胡蘿卜素的含量及組成也會(huì)因此而不同。當(dāng)發(fā)酵7 d時(shí),以甘油作碳源發(fā)酵得到的β-胡蘿卜素含量是以葡萄糖作碳源時(shí)的3.25倍。而以葡萄糖為碳源發(fā)酵得到的番茄紅素和蝦青素含量分別是甘油發(fā)酵1.60倍和2.81倍。并且,在不同碳源發(fā)酵條件下,進(jìn)入脂質(zhì)反耗階段后,菌體內(nèi)PKS途徑的脂肪酸比例均與總類胡蘿卜素含量呈正相關(guān),因此表明類胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性發(fā)揮著積極作用。

裂殖壺菌,碳源,類胡蘿卜素,脂代謝

裂殖壺菌(Schizochytrium)屬于真菌門(Eumycota)、卵菌綱(Oomycetes)水霉目(Saprolegniales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的一類類藻的海洋真菌[1]。其在一定培養(yǎng)條件下胞內(nèi)可以積累大量的脂肪酸,同時(shí)會(huì)合成一定量的脂質(zhì)伴隨物,如類胡蘿卜素、角鯊烯、甾醇等[2]。其中90%以上的脂質(zhì)以中性脂質(zhì)—甘油三酯(TG)的形式存在,易被人體吸收[3],因此是一種理想的適宜工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)油微生物。裂殖壺菌的脂肪酸組成簡單,主要有DHA(22∶6 n-3)、DPA(22-5 n-6)、豆蔻酸(C14∶0)和棕櫚酸(C16∶0)等,其中DHA含量很高,相比于傳統(tǒng)DHA來源的魚油,具有品質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)量高和安全性可靠等優(yōu)勢(shì)[4],受到人們的青睞。

類胡蘿卜素作為裂殖壺菌重要的脂質(zhì)伴隨物,在胞內(nèi)抗氧化方面發(fā)揮著重要作用。目前,類胡蘿卜素在微生物中被廣泛發(fā)現(xiàn),如三孢布拉氏霉、黏紅酵母以及杜氏鹽藻等[5-7]。研究表明碳源種類、金屬離子、C/N比以及溶氧等發(fā)酵條件都可能是影響微生物胞內(nèi)類胡蘿卜素含量和組成的重要因素[8-10]。目前,對(duì)于裂殖壺菌的研究主要集中在產(chǎn)脂方面,而對(duì)發(fā)酵過程中類胡蘿卜素的變化以及其與脂質(zhì)合成之間的關(guān)系研究較少。

本文將探究裂殖壺菌利用葡萄糖和甘油發(fā)酵過程中脂質(zhì)和類胡蘿卜素的組成及變化,結(jié)合胞內(nèi)脂肪酸和類胡蘿卜素的代謝通路,探討二者間的內(nèi)在聯(lián)系,為利用類胡蘿卜素來提高脂質(zhì)品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

裂殖壺菌ATCC20888美國菌種收藏中心;β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品、番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品和蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司;

菌種活化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 5;蛋白胨 1;酵母粉 1;瓊脂粉 18;海鹽 30。pH用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至7.0,隨后115 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30;酵母膏 5;氯化鈉 0.3;硫酸鈉 15;谷氨酸鈉 5;硫酸鉀 1;七水硫酸鎂 3;磷酸氫二鉀 2;磷酸二氫鉀 3;氯化鈣 0.02;維生素B10.005;維生素B60.002;維生素B120.005。pH用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至6.5,隨后115 ℃滅菌20 min,其中葡萄糖單獨(dú)滅菌。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖/甘油75;酵母膏 10;氯化鈉 0.3;硫酸鈉 15;谷氨酸鈉 15;硫酸鉀 1;七水硫酸鎂 4;磷酸二氫鉀 0.1;氯化鈣 0.05;維生素B10.008;維生素B60.002;維生素B120.008。pH用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至6.5,隨后115 ℃滅菌20 min,其中葡萄糖和甘油單獨(dú)滅菌。

超凈工作臺(tái)上海智城分析儀器制造有限公司ZHJH-C1112B;高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠LDZX-50KB;恒溫振蕩培養(yǎng)器上海智城分析儀器制造有限公司ZWY-211B;恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;烘箱Binder;超低溫冰箱Thermo Scientific Herafreeze Basic;氣相色譜儀Agilent Technologies 7820A;液相色譜儀Agilent Technologies 1100。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)條件將保藏于-80 ℃超低溫冰箱中的甘油管菌株劃線接種到菌種活化斜面上,于25 ℃下培養(yǎng)48 h。挑取活化后的單菌落,接種到含有種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,裝液量50 mL,于25 ℃和200 r/min條件下培養(yǎng)48 h。經(jīng)過兩級(jí)種子擴(kuò)增后,將5 mL種子液接種于含45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,200 r/min,25 ℃培養(yǎng)7 d。每次三個(gè)平行,取平均值。

1.2.2類胡蘿卜素的提取發(fā)酵結(jié)束后,離心取菌絲體避光冷凍干燥26 h,然后用提取液(二氯甲烷-甲醇=25-75,v/v)反復(fù)振蕩提取,直至菌絲體呈幾乎無色,離心濃縮萃取液,避光保存于-20 ℃。整個(gè)提取過程于暗室里進(jìn)行。

1.2.3類胡蘿卜素的測(cè)定β-胡蘿卜素、蝦青素以及番茄紅素的含量均通過高效液相法測(cè)得[10]。并且以上三種類胡蘿卜素含量之和計(jì)為總類胡蘿卜素含量。

1.2.4總脂肪酸的提取將冷凍干燥后的菌絲體研磨均勻,精確稱取1 g加入7 mL 20% HCl,于75 ℃水浴震蕩40 min。然后用20 mL正己烷分三次抽提脂質(zhì),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫溶后氮?dú)獯党龤埩羧軇?。稱重并計(jì)算脂質(zhì)占干重含量[11]。

1.2.5脂肪酸組成的分析氣相色譜法。毛細(xì)管柱(CP Sil-88:50.0 m×250 μm×0.20 μm),FID檢測(cè)器。進(jìn)樣溫度250 ℃,進(jìn)樣體積1 μL。柱溫條件:80 ℃保持2 min,然后以10 ℃/min速度升溫到120 ℃,接著以5 ℃/min升溫到180 ℃,保持2 min,最后以2 ℃/min升溫到230 ℃,再在230 ℃保持5 min。氮?dú)庾鳛檩d氣。以歸一化方法計(jì)算各脂肪酸的百分含量。檢測(cè)得到的脂肪酸DPA和DHA為PKS產(chǎn)物,而脂肪酸C14∶0,C16∶0和C18∶0作為FAS產(chǎn)物[12]。

1.2.6甘油濃度的測(cè)定高效液相色譜法。離心后的發(fā)酵液經(jīng)煮沸后稀釋,微孔濾膜過濾。色譜柱ZORBAX NH2(5 μm,250 mm×4.6 mm),洗脫條件為以70%乙腈平衡60 min,洗脫時(shí)間20 min,流速為1 mL/min,檢測(cè)器為示差檢測(cè)器。

1.2.7葡萄糖濃度的測(cè)定采用DNS法測(cè)得發(fā)酵液中葡萄糖濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1碳源對(duì)生物量和脂質(zhì)的影響

由圖1可知,裂殖壺菌對(duì)葡萄糖的同化速率大于對(duì)甘油的同化速率,證明葡萄糖更有利于其生長[13]。發(fā)酵第4 d時(shí),胞內(nèi)脂質(zhì)含量都達(dá)到最高,此時(shí)利用甘油發(fā)酵,胞內(nèi)總脂比例(64.15%)和DHA占總脂肪酸的比例(39.35%)都分別高于利用葡萄糖發(fā)酵(61.05%和32.94%),說明甘油作碳源相比于葡萄糖更有利于裂壺藻的脂質(zhì),尤其是DHA的積累,這與常桂芳和李靖等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[14-15]。從發(fā)酵第4 d起,裂殖壺菌胞內(nèi)總脂比例不斷下降,表明細(xì)胞開始從脂質(zhì)積累階段進(jìn)入脂質(zhì)反耗階段。甘油作碳源條件下細(xì)胞脂質(zhì)反耗的速率高于葡萄糖作碳源,前者反耗48 h后脂質(zhì)反耗導(dǎo)致總脂損失達(dá)47.17%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者的23.11%。

圖1　裂殖壺菌分別以葡萄糖和甘油為碳源的發(fā)酵曲線Fig.1　Fermentation profiles of Schizochytrium ATCC20888 in batch cultures on glycerol and glucose separately

2.2碳源對(duì)類胡蘿卜素含量的影響

在裂壺藻發(fā)酵過程中,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累的同時(shí),色素(尤其是類胡蘿卜素)也在發(fā)生著變化。裂殖壺菌胞內(nèi)的類胡蘿卜素主要有β-胡蘿卜素,蝦青素和番茄紅素[16]。由圖2a可知,無論是以葡萄糖還是以甘油為碳源,β-胡蘿卜素的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的推移而增加。發(fā)酵第4 d以后,細(xì)胞進(jìn)入脂質(zhì)反耗階段,在以甘油為碳源條件下,胞內(nèi)β-胡蘿卜素的增加量和積累速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以葡萄糖為碳源。發(fā)酵第7 d,甘油為碳源條件下胞內(nèi)β-胡蘿卜素產(chǎn)量是葡萄糖為碳源條件下的3.25倍。與β-胡蘿卜素不同,在以葡萄糖為碳源條件下胞內(nèi)番茄紅素和蝦青素含量的積累比以甘油為碳源條件下更迅速,在發(fā)酵7 d番茄紅素和蝦青素含量的積累分別是甘油組的1.60倍和2.81倍,這可能是由于裂壺藻在以葡萄糖為碳源條件下,細(xì)胞進(jìn)入脂質(zhì)反耗時(shí)胞內(nèi)環(huán)境的改變刺激了胞內(nèi)蝦青素和番茄紅素的合成[17]。

圖2　發(fā)酵過程中胞內(nèi)β-胡蘿卜素、蝦青素和番茄紅素的變化Fig.2　Change of β-carotene, astaxanthin and lycopeneconcentration during fermentation by Schizochytrium ATCC20888注：(a)β-胡蘿卜素，(b)番茄紅素，(c)蝦青素。

2.3類胡蘿卜素與脂質(zhì)之間的關(guān)系

如圖4所示,裂殖壺菌脂肪酸的合成主要有FAS途徑和PKS途徑,聚酮合成酶PKS系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)催化合成多不飽和脂肪酸如DPA和DHA等,脂肪酸合成酶FAS負(fù)責(zé)催化合成短鏈飽和脂肪酸如C14∶0,C16∶0和C18∶0[11-12]等。這兩種途徑都需要乙酰輔酶A和NADPH的參與[18]。而類胡蘿卜素合成的也需要以乙酰輔酶A為底物[19],因此,類胡蘿卜素的合成與脂肪酸的合成存在著底物競爭的關(guān)系。當(dāng)?shù)孜锍渥銜r(shí),胞內(nèi)總脂和類胡蘿卜素的含量都會(huì)上升。當(dāng)進(jìn)入到脂質(zhì)反耗后,胞內(nèi)能量主要來自脂質(zhì)氧化,為類胡蘿卜素的合成提供底物[8],因此探究FAS和PKS不同代謝產(chǎn)物與類胡蘿卜素之間的關(guān)系,對(duì)揭示脂質(zhì)代謝和類胡蘿卜素合成有重要作用。

圖3　碳源對(duì)脂質(zhì)和類胡蘿卜素合成的影響Fig.3　Effects of the carbon source on the accumulation of lipids and carotenoids during fermentationby Schizochytrium ATCC20888注:(a)以甘油為碳源,(b)以葡萄糖為碳源。

圖4　裂殖壺菌胞內(nèi)脂質(zhì)合成途徑Fig.4　Generalized pathway for thesynthesis of lipids in Schizochytrium

從圖3a和圖3 b可以看出,在裂殖壺菌以葡萄糖或甘油為底物發(fā)酵時(shí),胞內(nèi)積累的類胡蘿卜素主要是β-類胡蘿卜素,當(dāng)培養(yǎng)基中氮源不足但有過量的碳源時(shí),就會(huì)刺激胞內(nèi)脂質(zhì)和類胡蘿卜素的積累[20]。

在發(fā)酵第4 d到第7 d的脂質(zhì)反耗階段,以甘油為碳源條件下FAS產(chǎn)物的比例由56.4%降低到48.41%,以葡萄糖為碳源發(fā)酵時(shí)FAS產(chǎn)物比例也降低了12.65%。同時(shí)PKS產(chǎn)物被“相對(duì)濃縮”了,這說明FAS產(chǎn)物相比PKS產(chǎn)物被優(yōu)先降解,經(jīng)β-氧化途徑供能,以維持細(xì)胞正常的生理代謝。與此同時(shí)發(fā)酵第7 d時(shí)的單位干菌體總類胡蘿卜素含量m葡萄糖(μg/g干菌體)比發(fā)酵第4 d增加了162.50%,發(fā)酵第7 d的m甘油(μg/g干菌體)比發(fā)酵第4 d增加了207.16%,這可能是由于進(jìn)入反耗階段后,發(fā)酵液中溶氧上升,引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),這種氧化應(yīng)激會(huì)刺激胞內(nèi)類胡蘿卜素的合成[21],由于類胡蘿卜素通常積累于油體上,類胡蘿卜素的增加提高了細(xì)胞的抗氧化能力[22],從而對(duì)PKS產(chǎn)物,即不飽和脂肪酸DHA和DPA起到了保護(hù)作用。

3　結(jié)論

以甘油為碳源發(fā)酵相比以葡萄糖為碳源更有利于裂殖壺菌胞內(nèi)脂質(zhì)和總類胡蘿卜素的合成。在脂質(zhì)積累階段,β-胡蘿卜素是胞內(nèi)主要的類胡蘿卜素。進(jìn)入脂質(zhì)反耗后,以葡萄糖為碳源發(fā)酵時(shí)蝦青素和番茄紅素的含量和積累速率顯著增加。無論以甘油或葡萄糖為碳源發(fā)酵,進(jìn)入脂質(zhì)反耗后,總類胡蘿卜素含量與PKS產(chǎn)物占總脂肪酸的比例都呈正相關(guān)關(guān)系,因此提高類胡蘿卜素含量,可以提高胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性。

[1]Li Q,Chen GQ,Fan K,et al. Screening and characterization of squalene-producingthraustochytridsfrom Hong Kong mangroves[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(10):4267-4272.

[2]Ren L J,Sun G N,Ji X J,et al. Compositional shift in lipid fractions during lipid accumulation and turnover in Schizochytrium sp[J]. Bioresource Technology,2014(157):107-113.

[3]Yaguchi T,Tanaka S,Yokochi T,et al. Production of high yields of docosahexaenoic acid bySchizochytriumsp. strain SR21[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,1997,74(11):1431-1434.

[4]魏萍,馬小琛,任路靜,等. 裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2010,31(10):398-401.

[5]Hu X,Sun J,Yuan Q. Improvedβ-carotene biosynthesis and gene transcription inBlakesleatrisporawith arachidonic acid[J]. Biotechnology letters,2012,34(11):2107-2111.

[6]孫協(xié)軍,李秀霞,勵(lì)建榮,等. 杜氏鹽藻β-胡蘿卜素提取皂化工藝參數(shù)優(yōu)化[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2014,14(11):90-95.

[7]Yen H W,Chang J T. Growth of oleaginousRhodotorulaglutinisin an internal-loop airlift bioreactor by using lignocellulosic biomass hydrolysate as the carbon source[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2015,119(5):580-584.

[8]Mata-Gómez L C,Montaez J C,Méndez-Zavala A,et al. Biotechnological production of carotenoids by yeasts:an overview[J]. Microbial Cell Factories,2014,13(1):1-12.

[9]Nanou K,Roukas T. Oxidative stress response ofBlakesleatrisporainduced by iron ions during carotene production in shake flask culture[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2013,

169(8):2281-2289.

[10]Nanou K,Roukas T,Papadakis E. Oxidative stress and morphological changes inBlakesleatrisporainduced by enhanced aeration during carotene production in a bubble column reactor[J]. Biochemical Engineering Journal,2011,54(3):172-177.

[11]Chang G F,Luo Z L,Gu S T,et al. Fatty acid shifts and metabolic activity changes ofSchizochytriumsp. S31 cultured on glycerol[J]. Bioresource Technology,2013(142):255-260.

[12]Ratledge C. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production[J]. Biochimie,2004(86):807-815.

[13]Yokochi T,Honda D,Higashihara T,et al. Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1998,49(1):72-76.

[14]Chang G F,Gao N,Tian G,et al. Improvement of docosahexaenoic acid production on glycerol bySchizochytriumsp.S31 with constantly high oxygen transfer coefficient[J]. Bioresource Technology,2013(142):400-406.

[15]Li J,Liu R J,Chang G F,et al. A strategy for the highly efficient production of docosahexaenoic acid by Aurantiochytrium limacinum SR21 using glucose and glycerol as the mixed carbon sources[J]. Bioresource Technology,2015(177):51-57.

[16]張娟梅,江賢章,黃建忠. 裂殖壺菌 Schizochytrium sp. FJU-512細(xì)胞油脂的研究[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,3(2):75-80.

[17]Bhosale P. Environmental and cultural stimulants in the production of carotenoids from microorganisms[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2004,63(4):351-361.

[18]Lippmeier J C,Crawford K S,Owen C B,et al. Characterization of both polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathways inSchizochytriumsp[J]. Lipids,2009,44(7):621-630.

[19]鄭琰晶,李赟. 類胡蘿卜素合成酶基因及海洋微藻合成類胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J]. 海洋湖沼通報(bào),2004(1):88-95

[20]Zhang Z,Zhang X,Tan T. Lipid and carotenoid production byRhodotorulaglutinisunder irradiation/high-temperature and dark/low-temperature cultivation[J]. Bioresource Technology,2014,157(4):149-153.

[21]Nanou K,Roukas T,Papadakis E. Improved production of carotenes from synthetic medium byBlakesleatrisporain a bubble column reactor[J]. Biochemical Engineering Journal,2012,67(2):203-207.

[22]Davoli P,Mierau V,W S R. Carotenoids and fatty acids in red yeastssporobolomycesroseusandrhodotorulaglutinis[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2004(40):392-397.

Influence of carbon source on the accumulation of carotenoid during theSchizochytriumATCC20888 fermentation

LIU Yuan,LI Lei-lei,ZHANG Tao,LOU Fei,CHANG Ming,JIN Qin-zhe*,WANG Xing-guo

(State Key Laboratory of Food Science and Technology & School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China,)

The biosynthesis of lipids and carotenoids during theSchizochytriumATCC20888 fermentation was investigated in this study using glucose and glycerol as single carbon source,separately. The results showed glucose benefited cell growth more than glycerol while glycerol fermentation was better for the accumulation of lipid especially of DHA. Besides,it showed Different content and composition of carotenoids were observed between the different carbon sources. After 7 days fermentation,the content ofβ-carotene when used glycerol as carbon source was 3.25 folds of that used glucose,while the content of lycopene and astaxanthin of the latter were 0.60 and 1.81 times higher than the former. There was a positive correlation between the carotenoids content and PKS products during the turnover stage with both carbon source,which indicated that carotenoids might play an important role in increasing the stability of the PUFAs in cells.

Schizochytrium;carbon source;carotenoids;metabolism of fatty acids

2015-12-16

劉源(1990-),男,碩士研究生,研究方向：微生物油脂,E-mail:liu314yuan@126.com。

金青哲(1962-),男,博士，教授,主要從事油脂化學(xué)方向，E-mail:jqzwuxi@163.com。

國家自然基金青年基金項(xiàng)目(31401619);江蘇省自然基金青年基金項(xiàng)目(BK20140156)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0148-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.021