張赫宇,楊　波,羅瑞明,吳亮亮，蘇春霞

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

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高通量測(cè)序分析冷鮮灘羊肉儲(chǔ)藏過(guò)程中的細(xì)菌群落多樣性

張赫宇,楊波,羅瑞明*,吳亮亮，蘇春霞

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏銀川 750021)

通過(guò)Illuminu測(cè)序技術(shù)對(duì)灘羊肉貯藏過(guò)程中菌群的16S rRNA基因V3區(qū)進(jìn)行測(cè)序,探討冷鮮灘羊肉在貯藏過(guò)程中細(xì)菌的菌群組成,以及隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)其優(yōu)勢(shì)菌群的變化。結(jié)果表明:灘羊肉在貯藏過(guò)程中其微生物菌群變化具有多樣性;三個(gè)不同貯藏時(shí)期灘羊肉的微生物都是由11個(gè)細(xì)菌門、23個(gè)綱、35個(gè)屬組成,但是不同時(shí)期的細(xì)菌的豐富度不同,隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng),到第8 d時(shí),冷鮮灘羊肉表面的主要類群為變形菌門(Proteobacteria)占71.59%,厚壁菌門(Firmicutes)占23.15%。其中Proteobacteria類群隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)減少的趨勢(shì),而Firmicutes菌群變化趨勢(shì)與之相反。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間變化,灘羊肉貯藏中主要腐敗菌為假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacterspp.)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacterspp.)、腸桿菌屬(Enterobacteriaceaespp.)、熱死環(huán)絲菌(Brochothrixspp.)、乳酸菌屬(Lactobacillusspp.)。其中假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)是造成冷鮮灘羊肉腐敗變質(zhì)的主要優(yōu)勢(shì)菌。

冷鮮羊肉,高通量測(cè)序,貯藏過(guò)程,群落多樣性

灘羊?yàn)閷幭膬?yōu)勢(shì)特色畜種,肉質(zhì)細(xì)嫩,脂肪分布均勻,膻味很淡,加工后風(fēng)味獨(dú)特[1]。清真冷鮮灘羊肉是出口中東地區(qū)的首選產(chǎn)品。然而,灘羊冷鮮肉加工理論滯后,制約了加工技術(shù)發(fā)展。所以研究?jī)?yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)變化和深入了解肉品表面微生物群落特征對(duì)于控制冷鮮灘羊肉的品質(zhì)具有十分重要的意義。目前,國(guó)內(nèi)外冷鮮肉微生物研究著眼于生物多樣性分析,確定優(yōu)勢(shì)微生物,通過(guò)選擇性培養(yǎng)法研究?jī)?yōu)勢(shì)微生物生長(zhǎng)規(guī)律,結(jié)合肉品質(zhì)感官與理化指標(biāo),建立貨架期預(yù)測(cè)一級(jí)、二級(jí)模型,在冷鮮肉微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域卻未做深入研究,模型以具體實(shí)驗(yàn)值擬合,局限性強(qiáng)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)方法的興起,通過(guò)高通量測(cè)序法[2-3]研究微生物多樣性已受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。高通量測(cè)序技術(shù)在分析微生物的群落結(jié)構(gòu)時(shí),有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),能夠產(chǎn)生測(cè)序覆蓋深度非常高的16S rRNA的測(cè)序數(shù)據(jù),通過(guò)BLAST比對(duì)或者是將16S rRNA序列聚類成分類操作邏輯單元(OTU),根據(jù)OTU的數(shù)目和序列分析得出微生物多樣性和物種的豐度[4]?；?6S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)因消除了克隆問(wèn)題,并且可以綜合研究各個(gè)可變區(qū),同時(shí)分析方法也相對(duì)成熟,已成為微生物群落研究中非常重要的工具[5],并已廣泛用于豬屠宰及豬肉貯藏過(guò)程中微生物多樣性的研究[6]、分析冷藏過(guò)程中真空包裝豬肉的細(xì)菌群落變化[7]、運(yùn)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)建立分子預(yù)測(cè)模型,預(yù)測(cè)真空包裝冷鮮豬肉中單增李斯特菌的生長(zhǎng)情況[8]等,但目前利用16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)研究冷鮮灘羊肉貯藏過(guò)程中細(xì)菌群落演替規(guī)律鮮有報(bào)道。

本研究主要借助于宏基因組測(cè)序技術(shù),分析微生物群體基因組成及功能,以0 d作為對(duì)照,研究了貯藏4、8 d時(shí)的冷鮮灘羊肉微生物群體基因組成及功能,多樣性與豐度,探求微生物與環(huán)境,微生物與宿主之間的關(guān)系。研究冷鮮灘羊肉微生物群落多樣性及演替規(guī)律。宏基因組測(cè)序研究避開了微生物分離培養(yǎng)的過(guò)程,為研究微生物相互作用提供了有效工具。第二代高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)Νh(huán)境微生物進(jìn)行深度測(cè)序,靈敏地探測(cè)出環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)隨外界環(huán)境的改變而發(fā)生的極其微弱的變化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮灘羊后腿肉(當(dāng)天屠宰)取自寧夏鹽池大夏牧場(chǎng),后立刻放入干冰中儲(chǔ)存,返回實(shí)驗(yàn)室后迅速放入-20 ℃冰箱1 h,使其中心溫度降至4 ℃,將其取出置于4 ℃冰箱保藏。

Axygen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒江蘇省康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司;Miseq高通量測(cè)序儀美國(guó)Illumina公司;ScanSpeed MiniVac Alpha冷凍離心機(jī)美國(guó)Scan speed公司;SPECTRAMAX PLUS384MD酶標(biāo)儀美國(guó)MD公司;EPS 300電泳儀中國(guó)天能公司;Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)中國(guó)天能公司;Concentrator plus濃縮儀美國(guó)Thermo公司;Sorvall Legend Micro 17常溫離心機(jī)美國(guó)Thermo公司;G-560E漩渦混合儀vortex-genie2美國(guó)SI公司;GeneAmp PCR system 9700普通PCR儀美國(guó)Life公司;JT-C均質(zhì)器漯河市金田實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所;Scan Drop 200微量紫外光分光光度計(jì)德國(guó)耶拿公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品采集新鮮采購(gòu)的灘羊后腿肉用滅菌刀去除筋膜后分為45 份,每份10 g左右,放入無(wú)菌托盤,用無(wú)菌保鮮膜包好,置于4 ℃冰箱。每15份為一組,分別在0、4和8 d[9]時(shí)提取45個(gè)樣品的DNA。

1.2.2細(xì)菌總DNA的提取采用Axygen細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行,步驟見文獻(xiàn)[10]。

1.2.3細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)高通量測(cè)序?qū)⒃?、4、8 d所提取DNA樣品分別作為PCR反應(yīng)的模板,對(duì)16S rRNA基因的V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,上下游引物分別是27F:aatgatacggcg Accaccgagatctacactcttt ccctacacg acgctcttccgatctNNNNCCTACGGGAGGCAGCAG;1492R:caagcagaagacggcatacgagatCGTGATgtgactggagttcagacgtgtg ctcttccgatctATTACCGGCTGCTGG[11]。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：10 μmol·L-1的上下游引物各1.5 μL,Taq酶(Q5Master Mix)12.5 μL,DNA模板和dd H2O共9. 5 μL,個(gè)樣品的DNA總量約為5 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性30 s,98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s擴(kuò)增25個(gè)循環(huán),72 ℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠檢測(cè),切膠回收。采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。采用Quantity-iT PicoGreen定量試劑盒對(duì)膠回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。將通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的3組樣品(0、4、8 d)的目的DNA采用16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增,采用Illumina的MiSeq測(cè)序平臺(tái)的雙端251bp測(cè)序模式對(duì)3個(gè)環(huán)境樣本進(jìn)行高通量測(cè)序,根據(jù)MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)的低質(zhì)量分?jǐn)?shù)集中于末端的分布特點(diǎn),首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,利用Trimmomatic軟件進(jìn)行去雜,具體標(biāo)準(zhǔn)如下:去除尾部質(zhì)量值低于25的堿基;同時(shí)設(shè)置50 bp滑動(dòng)窗口,1 bp步移,窗口內(nèi)堿基平均質(zhì)量不低于25;最后去除長(zhǎng)度低于50 bp的序列。其次利用flash軟件將高質(zhì)量雙端序列進(jìn)行連接,最小overlap區(qū)10 bp,錯(cuò)配率0.2,去除含模糊堿基的序列。根據(jù)barcode將序列按樣品拆分,并去除barcode,獲得最終用于分析的優(yōu)化序列。將序列上傳至MG-RAST(Metagenomics analysis server http://metagenomics.anl. gov/)服務(wù)器[12]。

1.2.4軟件數(shù)據(jù)分析為了更好的驗(yàn)證測(cè)序量是否能夠真實(shí)的反映原始樣品的微生物群落多樣性,對(duì)不同儲(chǔ)藏時(shí)期冷鮮灘羊肉菌群變化通過(guò)繪制稀釋性曲線(rarefaction curve)評(píng)價(jià)所測(cè)序量是否覆蓋全部類群。使用QIIME(Version1.50)軟件[13]對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行總體分析,然后利用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行16S rRNA基因序列比對(duì),確定序列對(duì)應(yīng)微生物的分類學(xué)地位。通過(guò)軟件將相似性大于97%的序列定位為一個(gè)OTU(operational taxonomic units),通過(guò)Alpha多樣性指數(shù)分析比較三組樣品的微生物多樣性;最后通過(guò) Mothur(http://www.mothur.org)中的sum-mary. single命令,計(jì)算常用的α生物多樣性指數(shù)[14](beta diversity):Chao、ACE、Simpson、Shannon.、和coverage指數(shù),分析樣品之間群落組成的相異性。細(xì)菌群落豐富度用Chao指數(shù)表示,其值越高表明群落物種的豐富度越高,其計(jì)算方法見文獻(xiàn)[15];Shannon指數(shù)反映樣品的多樣性程度,其值越高表明群落物種的多樣性越高;Simpson指數(shù)反映了物種的優(yōu)勢(shì)度,計(jì)算方法見文獻(xiàn)[16];Shannon指數(shù)越大,而Simpson指數(shù)越小,說(shuō)明群落多樣性越高,均衡化程度越高。Coverage是指各樣品文庫(kù)的覆蓋率,其數(shù)值越高,則樣本中序列沒有被測(cè)出的概率越低。該指數(shù)實(shí)際反映了本次測(cè)序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況[17]。選取分析數(shù)據(jù)中每個(gè)OTU中一個(gè)有代表性的序列,通過(guò)進(jìn)行16S r RNA基因序列的比對(duì),然后利用Mega 4.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1灘羊肉宏基因組DNA提取

分別提取貯藏0、4、8 d灘羊肉的宏基因組DNA,用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)電泳檢測(cè),如圖1所示,3個(gè)樣本基因組條帶清洗,無(wú)降解,進(jìn)一步利用Scan Drop 200微量紫外光分光光度計(jì)測(cè)得三個(gè)樣本的DNA濃度都≥200 ng/μL,OD260/280值為1.8～2.0。沒有蛋白及試劑污染,滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

表3　OTU與樣本的豐度矩陣

圖1　灘羊肉宏基因組DNA提取Fig.1　Macro genomic DNA extraction detection of Tan-sheep

2.216S rDNA V3區(qū)測(cè)序分析

處理獲得的序列信息,去除低質(zhì)量片段、檢測(cè)錯(cuò)誤序列、連接后引物序列以及無(wú)法與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列信息比對(duì)一致的序列,獲得的序列為有效信息見表1,結(jié)果顯示有效長(zhǎng)度在 453.87 bp左右,符合預(yù)期的片段大小[20]。

表1　預(yù)處理過(guò)程統(tǒng)計(jì)

2.3測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性分析

為了驗(yàn)證測(cè)序量是否能夠真實(shí)的反映原始樣品的微生物群落的多樣性,對(duì)0、4、8 d的多樣性利用rarefaction curve進(jìn)行評(píng)估。樣品的稀釋性曲線相對(duì)趨于平穩(wěn)(圖2),說(shuō)明取樣合理,測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有微生物,同時(shí)也表明了2個(gè)樣本豐富的多樣性。

表2　連接后的序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)

圖2　序列相似度97%的豐富度稀疏分析圖Fig.2　Sparse abundance analysischart of 97% sequence similarity

2.4群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1基于OTU對(duì)樣品進(jìn)行初步分析3個(gè)樣品共獲得了1168個(gè)OUT,其中ZHY0 d樣品225個(gè)OUT,ZHY4 d樣品661個(gè)OUT,ZHY8 d樣品328個(gè)OUT這些樣品全部屬于細(xì)菌界,部分屬于變形菌、厚壁菌門,還有部分屬于變形菌綱。進(jìn)一步對(duì)各樣品之間共享OTU進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì),分類統(tǒng)計(jì)顯示ZHY0 d占樣品OUT的19.26%,ZHY4 d占樣品OUT的56.59%,ZHY8 d占樣品OUT的28.08%?？梢钥闯?ZHY4 d樣品的群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。

2.4.2細(xì)菌群落多樣性(ALPHA)和豐富度分析冷鮮灘羊肉在儲(chǔ)藏過(guò)程中的Alpha多樣性指數(shù)變化如表4所示,儲(chǔ)存4 d的冷鮮灘羊肉Chao指數(shù)高于0 d和8 d,其Shannon指數(shù)顯著高于0 d和8 d,其Simpson指數(shù)低于其他兩組,說(shuō)明儲(chǔ)存4 d的冷鮮灘羊肉細(xì)菌群落豐富度和均衡化程度高于儲(chǔ)存0 d和8 d的冷鮮灘羊肉。這兩種指數(shù)能夠?qū)θ郝湮锓N組成的豐富度及均勻度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。同時(shí)三組樣品的Coverage指數(shù)均在0.99以上,說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)的測(cè)序量已經(jīng)達(dá)到飽和,測(cè)序結(jié)果基本能夠反映灘羊肉微生物菌群多樣性組成。

表4　序列相似度97%的Alpha多樣性指數(shù)

2.4.3基于Weighted UniFrac PCoA的群落結(jié)構(gòu)分析如圖3所示,利用各樣品序列間的進(jìn)化信息計(jì)算樣品距離,觀察3種不同灘羊肉樣品多樣性差異。其第一主成分和第二主成分的貢獻(xiàn)率分別是80.94%和9.98%,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng),0 d和4 d兩組樣品呈現(xiàn)出一定的交疊現(xiàn)象,這說(shuō)明0 d和4 d兩組樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一定的相似性,而8 d的樣品呈現(xiàn)一定的聚類趨勢(shì),說(shuō)明8 d樣品相對(duì)于0 d和4 d兩組樣品來(lái)講具有自己特殊的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖3　種灘羊肉樣品細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)Unifrac加權(quán)PCoA分析分布圖Fig.3　Unweighted phylogenetic distanceanalysis of three differents

2.5不同儲(chǔ)藏時(shí)間冷鮮灘羊肉細(xì)菌的組成

對(duì)每個(gè)樣本和每個(gè)物種單元分類進(jìn)行序列豐度計(jì)算,構(gòu)建物種分類單元和樣本豐度矩陣文件。計(jì)算三種儲(chǔ)藏時(shí)間下冷鮮灘羊肉在同一門分類下OUT分布及相對(duì)豐度,物種分類單元豐度比例圖是分別根據(jù)物種分類單元的界、門、綱、目、科、屬、種層對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行計(jì)數(shù),從而計(jì)算相對(duì)比例。以門和綱的分類單元比例豐度圖見圖4。

圖4　三種樣本中細(xì)菌在不同分類水平上的分布Fig.4　Relative abundance statistical figure of phylum and class classificatio

通過(guò)序列比對(duì)和注釋,根據(jù)各樣品在門水平分布的分析可以看出,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),灘羊肉樣品中細(xì)菌在門水平上的分類是相同的,灘羊肉樣品的序列共分屬于11個(gè)門,而且類群的豐度很相似,但豐度比例不同。其中11個(gè)門都屬于細(xì)菌門。分別是:變形菌門Proteobacteria,厚壁菌門Firmicutes、非典型細(xì)菌門unclassified_Bacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、放線菌門Actinobacteria、綠彎菌門Armatimonadetes、酸桿菌門Acidobacteria、糖化細(xì)菌門Candidatus_Saccharibacteria、藍(lán)藻菌門Cyanobacteria/Chloroplast、浮霉菌門Planctomycetes、互養(yǎng)菌門Synergistetes。變形菌門、厚壁桿菌門、擬桿菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、酸桿菌門、互養(yǎng)菌門,共同構(gòu)成了灘羊肉菌群的主要結(jié)構(gòu)。除了主要菌群外,其它門分類的菌群豐度都較低,甚至有的門水平出現(xiàn)了僅有為數(shù)不多的幾條序列,占有百分比不足 0.01%。這些結(jié)果表明菌群具有多樣性豐富,豐度集中的特點(diǎn)。

表5　儲(chǔ)藏期間冷鮮灘羊肉表面優(yōu)勢(shì)菌門組成比例

注:-未檢出。

分析冷鮮灘羊肉在儲(chǔ)存期間各種細(xì)菌占總菌數(shù)的百分比,通過(guò)表3分析測(cè)序結(jié)果可以看出,冷鮮灘羊肉在儲(chǔ)藏期間,變形菌門(Proteobacteria)廣泛存在于3個(gè)單樣品中,并且占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì),其含量都是最多,達(dá)到70%以上,且ZHY0 d樣品中的變形菌門(Proteobacteria)的含量達(dá)到89.63%以上。變形菌門中的γ-變形菌是主要優(yōu)勢(shì)菌,在儲(chǔ)藏到第8 d時(shí),占比雖有所下降,但仍是優(yōu)勢(shì)菌。很多重要的病原菌都屬于這個(gè)綱,如假單胞菌和腸桿菌。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),厚壁桿菌門的含量逐漸增多,逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌。貯藏到第8 d,變形菌門依然是優(yōu)勢(shì)菌,占送檢結(jié)果70%以上,是造成真空包裝冷鮮灘羊肉腐敗的主要微生物。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng),芽孢桿菌所占比例成倍增加,這種趨勢(shì)與芽孢桿菌的特性有關(guān),芽孢桿菌能夠產(chǎn)生內(nèi)生孢子,對(duì)外部環(huán)境因素抵抗力強(qiáng),生命力強(qiáng),代謝快,繁殖快,它的占比比一般病原菌分子大四倍,占據(jù)空間優(yōu)勢(shì),可以抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖。

表6　儲(chǔ)藏期間冷鮮灘羊肉表面優(yōu)勢(shì)菌綱組成比例

由此可以看出在儲(chǔ)藏至第8 d時(shí),冷鮮灘灘羊肉的主要優(yōu)勢(shì)菌為變形菌、芽孢桿菌、非典型細(xì)菌、梭狀芽孢桿菌和鞘脂桿菌等。變形菌中的假單胞菌和腸桿菌是造成冷鮮肉腐敗變質(zhì)的主要微生物,這與已有研究指出冷鮮羊肉表面的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為假單胞菌的結(jié)論一致[14]。

2.6細(xì)菌菌群系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

細(xì)菌菌群系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖5。

圖5　細(xì)菌菌群系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.5　Phylogenetic tree of bacterial flora

3　結(jié)論

2009年,諸永志等采用選擇性培養(yǎng)基分析了江蘇徐州地區(qū)冷卻羊肉的菌相,其中假單胞菌屬、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌、腸桿菌科、熱死環(huán)絲菌是構(gòu)成該品種冷卻羊肉的主要微生物[18]。2013年,劉瑩瑩等采用選擇性培養(yǎng)基分析了寧夏吳忠地區(qū)冷卻羊肉的初始菌相:主要腐敗菌為假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌、葡萄球菌[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)16S rRNA基因分析灘羊肉貯藏過(guò)程中微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)。

通過(guò)多樣性分析發(fā)現(xiàn),隨著測(cè)序量的增加,各多樣性曲線逐漸趨于平行,體現(xiàn)測(cè)序達(dá)到飽和,測(cè)序結(jié)果基本能夠反映灘羊肉微生物菌群多樣性組成,說(shuō)明灘羊肉貯藏過(guò)程中其微生物組成具有豐富的多樣性。通過(guò)群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),其細(xì)菌主要分布于變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、非典型細(xì)菌門、放線菌門等11個(gè)門,23個(gè)綱,35個(gè)屬,變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,其中γ—變形菌綱中的假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬占一定優(yōu)勢(shì)。厚壁菌門隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)也逐漸增多,其中芽孢桿菌綱中的熱死環(huán)絲菌、乳酸菌、梭菌屬占一定優(yōu)勢(shì)。相比其他研究方法[19-20]對(duì)于灘羊肉細(xì)菌群落分析更加全面,信息量更大。并且利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠快速了解冷鮮灘羊肉在儲(chǔ)存過(guò)程中的重要菌株,并且得到主要腐敗菌為假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜冷菌屬、腸桿菌屬、熱死環(huán)絲菌、乳酸菌。其中假單胞桿菌為優(yōu)勢(shì)菌,很多文獻(xiàn)都有研究。同時(shí)還能發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)藏過(guò)程中的candidate division TM7、bacterium PE03-7A6 等未知微生物,這對(duì)冷鮮灘羊肉的貯藏和保鮮和研究?jī)?yōu)勢(shì)腐敗菌的生長(zhǎng)變化,并且深入了解肉品表面微生物群落特征對(duì)于控制冷鮮灘羊肉的品質(zhì)具有十分重要的意義。

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Analysis of bacterial community diversity in cold fresh Tan lamp during different storage time using pyrosequencing

ZHANG He-yu,YANG Bo,LUO Rui-ming*,WU Liang-liang,SU Chun-xia

(College of Agricultural,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

The Bacteria composition of Tan lamb and predominant flora changes with storage time extension were discussed by sequencing the microbial community of Tan lamb during the storage with Illuminu sequencing technology. The results indicated that the microbial flora showed diversity during the storage of Tan lamb. The microorganisms in the Tan lamb were constituted of 11 phylum of bacteria,23 classes and 35 genuses during its different storage periods,but it has showed different richness of bacteria in the different periods. With the extension of storage time,in the 8th day,the main bacterial populations on the surface of the cold fresh Tan lamb were:71.59% Proteobacteria;23.15% Firmicutes. The proteobacteria showed a decreasing trend with increase of storage time,but the Firmicutes changed in contrary. As the storage time increased,thePseudomonasinProteobacteriaaccounting for the most of the bacteria,which was the Specific Spoilage Organisms that caused clod fresh Tan lamb’s corruption.

cold fresh Tan lamp;barcoded pyrosequencing;storage process;community diversity

2016-01-14

張赫宇(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail:zhangheyu410@163.com。

羅瑞明(1964-)，男，博士，教授，研究方向：畜產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail:ruimingluo.nx@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460431)。

TS251

A

1002-0306(2016)13-0177-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.027