曹小舟,劉永祥,俞　凌,蘇安祥,沈新春

(南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

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植物蛋白源抗氧化肽活性的評價方法及作用機制的研究進展

曹小舟,劉永祥,俞凌,蘇安祥,沈新春*

(南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室,江蘇南京 210023)

植物蛋白源天然抗氧化肽由于具有良好的抗氧化性和較高的安全性,因而受到國內外學者的廣泛關注。本文綜述了植物蛋白源抗氧化肽抗氧化活性的評價方法和作用機制,為進一步開發(fā)制備植物蛋白源抗氧化活性肽提供研究借鑒。

植物蛋白源肽,抗氧化活性,評價方法,作用機制

抗氧化肽是指動物或植物蛋白經過酶解和分離提取后得到,能夠抑制生物大分子過氧化或清除體內自由基,具有一定抗氧化活性的肽段。與大分子的肽鏈蛋白質相比,它可以顯示出更高的活性[1]。植物蛋白源抗氧化活性肽由于具有較強的抗氧化活性和較高的安全性,在抗氧化的基礎上可以保持原有的營養(yǎng)和功能特性,而且在不同的條件下可以保持較穩(wěn)定的活性。因此,在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、化妝品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等眾多領域都展現出較高的行業(yè)應用優(yōu)勢和廣泛應用的潛在可能性,擁有非常廣闊的開發(fā)前景[2]。適當的攝入抗氧化肽有助于清除機體過量的自由基,維持體內的自由基平衡,提高機體對于疾病的抵抗能力,幫助機體延緩衰老。人工合成的一些抗氧化劑如BHT、BHA、PG、TBHQ等,它們作為一種添加劑被應用于油脂及含油食品中,可以有效延緩或者阻止食品中蛋白質變性或者油脂酸敗等,提高食品的穩(wěn)定性,但其對人體的脾、肝、肺存在某些安全危害[3];天然抗氧化劑如生育酚由于成本過高而存在應用上的局限性。因此具有良好抗氧化性和較高安全性的植物蛋白源抗氧化肽是一個很好的選擇。目前,國內外很多研究人員已從多種植物來源的蛋白質中提取出了具有清除自由基、亞鐵離子螯合及抑制脂質過氧化等具有抗氧化活性的肽類物質[4-7]。它們能調整和改善人體的生理功能,達到預防和輔助治療糖尿病、肥胖癥和癌癥等慢性疾病的目的[8-9]。本文主要就植物蛋白源抗氧化肽活性的評價方法及其抗氧化機制進行了系統(tǒng)的綜述,以期為更好地評價和開發(fā)植物蛋白源抗氧化活性肽提供研究依據。

1　植物蛋白源肽的抗氧化活性評價方法

抗氧化肽的生產和來源方式主要分為以下三類:生物內源性抗氧化肽、人工合成的抗氧化肽和酶解蛋白質制備的抗氧化肽[10]。目前,制備抗氧化肽的方法主要有酸堿水解法、酶解法和發(fā)酵法[11],其中具有降解位點特異、快捷、可控、重復性高的酶解法[12]是最常用的方法。此外,酶解由于在比較溫和的條件下進行,可以很好的保存氨基酸的營養(yǎng)價值。因此,酶解蛋白質制備抗氧化肽是目前抗氧化研究領域的一個熱點。隨著對抗氧化活性肽研究的不斷深入,目前已經建立了多種評價抗氧化肽活性的方法。結合國內外學者對于各類植物蛋白質酶解產物以及多肽抗氧化性活性的研究,現有評價肽的抗氧化活性的常用方法主要有三類:體外化學法、細胞生物法、體內動物實驗法。

1.1體外化學法

由于體外抗氧化活性測定方法操作簡便、高效低毒、便于重復,該測定方法經常作為體內實驗的前期研究被廣泛使用。這種方法還可以分為兩大類:基于氫原子轉移(HAT)和電子轉移(ET)的反應。

基于氫原子轉移的抗氧化性活性測定方法主要是通過動力學曲線來定量分析其抗氧化能力,側重于檢測抗氧化劑通過提供氫原子從而捕獲自由基的能力。反應機制為:X·+AH→ XH+A·。在亞油酸體系中的抗氧化能力、氧自由基吸收能力(ORAC)、總自由基捕獲抗氧化參數(TRAP)等測定方法都屬于此類方法[13]。

基于電子轉移的抗氧化測定方法則是通過反應物顏色的變化來反應其抗氧化能力,側重于檢測抗氧化劑通過轉移電子達到還原一些組分的能力,這些組分包括羧基、自由基、金屬等[14]。反應機制為:X·+AH → X-+AH+·。常見的方法有測定還原能力、測定羥自由基、超氧陰離子自由基、ABTS自由基、DPPH自由基的清除能力[13]。

1.2細胞生物法

部分體外化學法測定肽的抗氧化性是在非生理溫度和pH的條件下,然而生物體內的氧化過程極其復雜,因而導致在采用體外化學法評價抗氧化肽活性時,顯示較高的抗氧化活性肽未必在生物體內也能取得良好的抗氧化效果。因此,所測定的抗氧化肽在生物體中的應用具有一定的局限性。細胞生物法可以提供吸收、新陳代謝等一系列生理功能的有效評價,已經成為目前研究生物活性肽的抗氧化活性和抗氧化機制的主流趨勢。

Huang等[19]建立用H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷模型,證實了甘薯蛋白SPD1可以通過減少HepG2細胞內過氧化氫的產生來發(fā)揮抗氧化活性;魏穎等[20]用油酸誘導的HepG2細胞模型評價玉米低聚肽對脂肪累積的影響,發(fā)現玉米低聚肽富含小肽段組分,對肝細胞的脂肪累積和抗氧化具有較好的預防保護作用;Zheng等[21]研究了脫脂花生粕蛋白對處于H2O2誘導下的PC12細胞的保護能力,研究發(fā)現花生粕蛋白能夠提高細胞內谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,并且能夠抑制細胞內脂質的過氧化來發(fā)揮抗氧化作用,證明花生粕抗氧化肽可以提高細胞在過氧化氫條件下的存活率;Lu等[22]用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細胞來測定抗氧化肽對處于過氧化氫環(huán)境下的PC12細胞的保護能力。研究發(fā)現:通過堿性蛋白酶酶解大麻籽抗氧化肽得到的抗氧化肽序列HVRETALV,與空白對照組相比,當其濃度為10 μg/mL時,細胞在過氧化氫環(huán)境下的存活率提高到了60%;梁盈等[23]通過H2O2誘導建立的HUVEC細胞氧化損傷模型,采用MTT和熒光顯微鏡觀察,從細胞水平深入研究大米抗氧化活性肽,發(fā)現大米活性肽對H2O2損傷的HUVEC有一定的保護作用;樊金娟等[24]以大鼠紅細胞為研究模型,證明了米糠抗氧化肽能抑制紅細胞及肝組織自氧化產生的MDA和由H2O2誘導產生的MDA,抑制率為41%～60%;而且能夠有效抑制血紅蛋白氧化反應和紅細胞溶血,抑制率為50% 左右,表明米糠抗氧化肽對大鼠紅細胞和血紅蛋白的氧化損傷具有保護作用;Garcia等[25]建立以H2O2和t-BOOH為氧化誘導劑的Caco-2細胞為模型,從細胞水平上研究了大豆抗氧化肽對氧化應激狀態(tài)下細胞的保護作用,發(fā)現大豆肽主要通過清除過多的ROS來發(fā)揮對氧化損傷細胞的保護作用。

細胞生物法通過吸收、新陳代謝等一系列生理功能既可以方便的得出抗氧化肽的生物活性和利用性,又能研究其作用機制,很好的彌補了體外化學法的局限性;同時也可以彌補體內動物實驗法成本高、耗時長的缺陷。但在相關的研究中,經常采用腫瘤細胞來構建細胞氧化損傷模型。由于腫瘤細胞內內源性的活性氧含量較高,可能會對實驗結果造成一定的影響,不能真實反映活性肽的抗氧化機制。

1.3體內動物實驗法

相比細胞生物法,體內動物實驗法是建立在生理學、毒理學及病理學的基礎上,采用生化技術對實驗動物進行各項指標測試,測定結果可以更加準確有效的評價抗氧化肽在生物體內的抗氧化作用。因此,很多研究學者也通常采用這種評價方法來檢驗抗氧化肽對蛋白質和脂質的保護作用。大鼠或者小鼠常被作為實驗的研究對象。通過建立有效的動物模型,測定血漿、腦、肝臟、心臟等組織的相關指標,如抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、過氧化氫酶CAT、乳酸脫氫酶LDH、谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px等)的活性、脂質過氧化產物丙二醛MDA的含量,以進一步在生理代謝水平上驗證和評價抗氧化肽的抗氧化能力。

王莉娟等[26]用D-半乳糖建立小鼠衰老模型,給予不同濃度的大豆抗氧化肽進行灌胃處理,考察了大豆抗氧化肽對實驗小鼠腦指數、心指數、肝指數、脾指數、腎指數的變化。通過測定小鼠血清中MDA的含量,SOD的活力;小鼠腦、肝組織中MDA的含量,SOD、GSH-Px、CAT的活力,發(fā)現大豆抗氧化肽可以提高衰老小鼠血清中SOD活力、降低MDA含量;降低衰老小鼠肝、腦組織MDA含量;提高肝、腦組織SOD活力、GSH-Px、CAT活力。Yin等[27]發(fā)現用小麥抗氧化肽喂飼由非甾體抗炎藥(NSAIDs)誘導的大鼠胃組織損傷和氧化應激模型時,能提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的活性,降低非甾體抗炎藥誘發(fā)的胃上皮細胞變性、氧化應激和NO的水平。黃慧明等[28]采用注射溴代苯的方法誘導建立過氧化肝組織損傷小鼠模型,通過測定模型小鼠肝組織和血中的脂質過氧化物含量和過氧化物酶(超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶)的活性來鑒定蠶絲蛋白肽的抗氧化功能。結果表明,蠶絲蛋白肽具有明顯的抗氧化作用,其抗氧化作用途徑之一就是提高抗氧化酶活力,降低脂質過氧化產物丙二醛的含量。朱艷華等[29]通過測定由FeSO4與H2O2誘導大鼠肝勻漿產生的MDA的含量,發(fā)現玉米抗氧化肽能抑制自由基誘導的大鼠肝線粒體腫脹,使大鼠肝線粒體腫脹度低于對照組,且劑量關系明顯,表明其具有保護大鼠肝線粒體氧化損傷的作用。王才立等[30]通過D-半乳糖建立小白鼠氧化損傷模型,利用超濾和納濾技術對通過復合酶法制備的小麥胚芽多肽進行分級分段和純化后,得到的不同分子量的麥胚抗氧化肽進行體內抗氧化活性的評價,實驗結果表明:小麥胚芽多肽能夠使小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px以及T-AOC的指標升高,降低小鼠血清和肝臟中脂質過氧化物的MDA含量,具有良好的抗氧化活性。總體來說,隨著多肽質量濃度的升高,抗氧化活性也隨之增強,分子量在2000 u以下的小麥胚芽多肽具有較強的抗氧化活性。

2　植物蛋白源肽抗氧化作用機制的研究

越來越多的研究表明,氧化應激在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中都扮演著重要的角色?？寡趸碾m然對多種疾病顯示出了一定的預防和輔助治療作用,但其抗氧化機制還有待深入研究。隨著人們對抗氧化活性肽研究的不斷深入,闡明其抗氧化作用機制也成為了亟需解決的問題。從目前的研究結果來看,主要從以下幾個方面對抗氧化肽發(fā)揮抗氧化作用的機制進行探討。

2.1抑制自由基機制

生理代謝過程中所產生的自由基在機體內扮演著多種功能,如信號傳導、預防感染等[31-33]。然而機體內過多的活性自由基反過來會導致正常的細胞組織出現損傷,引發(fā)動脈粥樣硬化、糖尿病及癌癥等多種疾病[34-35]。目前的研究普遍認為,抗氧化活性肽主要通過兩條途徑來清除自由基:一條是通過螯合金屬離子來降低Fenton反應的速率,進而減少羥自由基的數量;另一條則是通過抗氧化活性肽的抽氫反應生成穩(wěn)定的自由基,中斷自由基的鏈式反應[36]。

Niranjan等[37]研究表明:當植物抗氧化肽的N端為疏水性氨基酸,比如纈氨酸(Val)或者亮氨酸(Leu),其抗氧化活性較高,可能是由于疏水性氨基酸的作用讓抗氧化活性肽與脂肪酸之間的相互作用增強,導致抗氧化活性肽對自由基的捕捉能力增加。通過捕捉自由基反應鏈的過氧化自由基,阻止或減弱自由基鏈反應的進行。徐力[38]等通過堿性蛋白酶水解玉米蛋白得到的抗氧化肽序列Leu-Asp-Tyr-Glu,因為Tyr具有酚羥基結構,能提供質子猝滅自由基,與Tyr鄰近的Asp和Glu的羧酸根具有吸電子作用,使Tyr酚羥基上氧電子云密度減弱,更有利于質子的釋放,增強了Tyr的質子供體效應。此外,玉米抗氧化肽的N-端為疏水性氨基酸Leu,使抗氧化肽與脂肪酸的相互作用增強,提高了其對脂質自由基的捕捉能力。

Nrf2-Keap1信號通路是機體抗氧化的重要途徑之一,Nrf2通過調節(jié)下游抗氧化酶基因的表達和GSH的合成清除機體中的自由基等活性氧,保證氧化還原系統(tǒng)平衡,防止DNA受到損傷[39-42]。郭鈺潔等[43]用鷹嘴豆生物活性肽處理由H2O2誘導的Caco-2細胞和HT-29細胞,發(fā)現Nrf2-Keap1信號通路中的Nrf2及下游的抗氧化酶NQO1、HO-1 和γ-GCS的mRNA表達量增多,Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS的蛋白表達量也增多。其抗氧化機理可能是鷹嘴豆生物活性肽引起Nrf2與Keap1發(fā)生解離,Nrf2進入到細胞核,與ARE的特異識別位點GCTGAGTCA進行結合,啟動ARE調控的NQO1、HO-1和γ-GCS基因表達。NQO1表達量的增多可以維持內源抗氧化物的還原性;HO-1表達量增多能夠產生更多的膽紅素,而膽紅素具有很強的抗氧化性;γ-GCS 能夠促進GSH的產生。在這些抗氧化酶的作用下,氧化應激被抑制,多余的ROS得以清除,最終實現機體氧化還原狀態(tài)的平衡。

2.2抑制抗氧化防御系統(tǒng)機制

在正常條件下,生物機體會不斷的生成自由基,同時也存在著由內源性抗氧化劑(谷胱甘肽等)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物酶等)組成的防御系統(tǒng),用于維持自由基的代謝平衡正常,使得機體內自由基的產生與清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)。然而,當內源性或外源性刺激促使機體內自由基產生過多導致抗氧化酶活性降低時,就會對DNA、RNA、蛋白質以及脂質等造成過氧化損傷引起細胞功能障礙[44]。通過在體外建立細胞氧化損傷模型,測定抗氧化活性肽對細胞中CAT、GSH-Px等酶含量的變化情況,可以明確抗氧化活性肽保護細胞可以免受自由基的氧化損傷的機制。Zhu等[45]建立由H2O2誘導的PC12細胞模型,發(fā)現麥胚抗氧化肽通過提高PC12細胞的存活率和細胞內CAT、SOD的水平,抑制線粒體膜電位的降低和細胞內Ca2+的積累,可以有效抑制由氧化應激造成的細胞損傷。范金波等[46]通過H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞損傷,發(fā)現:絲膠抗氧化肽通過提高細胞中總抗氧化能力、SOD、CAT 和GSH-Px酶水平以及細胞的NO水平;來發(fā)揮其對細胞免受損傷的保護作用,而且存在劑量依賴關系。

2.3抑制脂質過氧化機制

氧自由基反應和脂質過氧化反應在機體的新陳代謝過程中扮演著極其重要的作用。在正常情況下,兩者處于協(xié)調與動態(tài)平衡狀態(tài),維持著體內許多生理生化反應和免疫反應。但是,當這種協(xié)調與動態(tài)平衡產生紊亂或者失調時,就會引起脂質過氧化,形成脂質過氧化產物,如丙二醛(Malonaldehyde,MDA)和4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal,HNE)等。抗氧化活性肽的抗氧化性可以通過測定脂質過氧化而得到體現[47]。抑制脂質過氧化的測定方法主要有硫代巴比妥酸法、共輒亞油酸體系測定法和電子自旋共振法[48-49],這三種方法均可用于檢測活性肽是否可抑制脂質過氧化反應,從而進一步了解其抗氧化機制。Zhu[45]等發(fā)現小麥胚芽抗氧化肽能夠通過降低過氧化氫誘導的PC12細胞內的MDA的作用,發(fā)揮其抗氧化作用。Xie[50]等建立小鼠肝損傷模型評價了決明子多肽的抗氧化活性,證明了其抗氧化機制與降低細胞內 MDA 的水平有關。林金鶯[51]等以火麻仁種仁為原料,通過分步酶解和枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵兩種方法對火麻仁蛋白質進行了水解,最后采用飛行離子色譜鑒定得到了具有很明顯抑制脂肪過氧化的能力的純化酶解多肽:Phe-Leu-Lys-Leu-Thr-Ala-Glu-Arg和純化發(fā)酵多肽:Arg-Ser-Arg-Lys-Gly-Phe-Glu-Trp-Leu-Arg-Val-Lys,其抗氧化機制主要是肽序列中的堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)可與不飽和脂肪酸反應生成鹽,從而可抑制不飽和脂肪酸的氧化反應的發(fā)生。

3　展望

目前,盡管國內外學者對于植物源抗氧化活性肽已經做了很多的研究,越來越多的抗氧化活性肽序列片段被分離鑒定出來,但仍然有很多問題亟需解決:一些已發(fā)現的抗氧化活性肽序列,其活性僅僅只在體外實驗和細胞實驗中被證實,還缺乏通過動物模型進一步從機體內進行更加深入的研究,在分子營養(yǎng)學水平上明確抗氧化肽在體內的抗氧化作用機制,例如,通過哪種信號通道發(fā)揮其抗氧化作用等更深層次的作用機制;抗氧化肽的分離制備技術由于成本高、耗時耗力、而且蛋白回收率不高等缺點在一定程度上阻礙了抗氧化肽的商品化進程,探索新型快速并能大規(guī)模從植物源蛋白中制備抗氧化活性肽的方法迫在眉睫;針對新發(fā)現的抗氧化活性肽序列,還未能進一步進行構效關系和分子修飾等方面的研究;抗氧化肽作為功能性食品或藥品,最終都要通過攝入體內發(fā)揮其功效。從體外篩選出的抗氧化活性肽還需研究在消化過程中的降解規(guī)律以及其胃腸穩(wěn)定性是否遭到破壞。隨著研究的深入和生物技術的快速發(fā)展,這些問題都會被一一解決,從而為抗氧化活性肽的應用打開更加廣闊的空間。

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Progress in evaluation methods and action mechanism of antioxidant activity for plant protein-derived peptides

CAO Xiao-zhou,LIU Yong-xiang,YU Ling,SU An-xiang,SHEN Xin-chun*

(College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing,Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

Natural,safe,and efficient antioxidant peptides derived from many plant proteins have received much attentions from researchers at home and abroad. The evaluation methods and the molecular mechanism of antioxidant activity for plant protein-derived peptides were summarized in the present review,which will shed some lights on the further development and utilization of antioxidant peptides derived from plant proteins.

plant protein-derived peptides;antioxidant activity;evaluation methods;mechanism

2015-12-16

曹小舟(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：農產品深加工與副產品綜合利用，E-mail：15951912672@163.com。

沈新春(1966-)，男，博士，教授，研究方向：農產品深加工與副產品綜合利用、分子營養(yǎng)，E-mail：shenxinchun@njue.edu.cn。

國家自然科學基金項目(31271983)；江蘇省自然科學基金(BK20141484)；江蘇省高校自然科學研究重大項目(14KJA550002)；2015年度江蘇省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新團隊；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目。

TS210.9

A

1002-0306(2016)13-0355-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.065