劉　奇,柯常亮,陳潔文,林頌雄,蔡　楠,黃　珂,紀(jì)曉敏,李劉冬,*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東廣州 510300;2.汕尾市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站,廣東汕尾 516611)

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水產(chǎn)品中甲基汞測(cè)定方法的優(yōu)化

劉奇1,柯常亮1,陳潔文1,林頌雄1,蔡楠1,黃珂1,紀(jì)曉敏2,李劉冬1,*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(廣州),廣東廣州 510300;2.汕尾市海洋與漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站,廣東汕尾 516611)

本研究對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了優(yōu)化,建立了水產(chǎn)品中甲基汞殘留的快速測(cè)定方法。本方法采用硫酸和溴化鉀超聲輔助提取樣品中甲基汞,經(jīng)甲苯反萃,氣相色譜測(cè)定。結(jié)果顯示,在25.0～1000 μg/L濃度范圍內(nèi),甲基汞標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=21.49x-660.9,線性良好(r=0.9995);方法檢測(cè)限和定量限分別為7.58、25.0 μg/kg;加標(biāo)量為50.0、100、500、1000 μg/kg時(shí),回收率范圍為80.8%～108%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.56%～8.10%,表明該方法滿足水產(chǎn)品中甲基汞殘留測(cè)定的要求。方法優(yōu)化后步驟減半,耗時(shí)縮短三分之二,樣品分析效率大幅提高,適合批量測(cè)定水產(chǎn)品中甲基汞殘留。

甲基汞,水產(chǎn)品,氣相色譜法,快速測(cè)定

甲基汞是一種劇毒有機(jī)重金屬污染物,可對(duì)人體造成以神經(jīng)系統(tǒng)為主的全身性傷害[1],并有致癌作用[2]。甲基汞污染引起的日本水俁病事件是世界八大公害事件之一[3]。水體和底泥中70%以上的汞以甲基汞的形式存在[4],由于分子量小、脂溶性強(qiáng),甲基汞極易在水產(chǎn)品中富集,經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體[5]。研究表明,水產(chǎn)品是人類甲基汞暴露的主要來(lái)源[6]。為保障人體健康,聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定,水產(chǎn)品中肉食魚類和非肉食魚類甲基汞限量分別為1.0、0.5 mg/kg,中國(guó)、美國(guó)等采納了該標(biāo)準(zhǔn)[7-8];2015年起,歐盟將水產(chǎn)品及水生生物中汞和汞類化合物環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(EQS)設(shè)為20 μg/kg[9],進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)甲基汞的危害控制。近年來(lái),我國(guó)加強(qiáng)了食品質(zhì)量安全的監(jiān)管,水產(chǎn)品中甲基汞殘留的監(jiān)控覆蓋面和樣品數(shù)量大幅增加,對(duì)分析方法的要求也越來(lái)越高。

水產(chǎn)品中甲基汞殘留測(cè)定方法是近年來(lái)研究熱點(diǎn)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[10]、原子熒光法(AFS)[11-12]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICPMS)[13-14]和氣相色譜法[15]等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于甲基汞檢測(cè)研究。其中,GC-MS法靈敏度高,但需要四乙基硼化鈉(NaBEt4)等試劑進(jìn)行衍生,操作復(fù)雜,且NaBEt4室溫下遇到含有機(jī)物的蒸汽就會(huì)燃燒爆炸,危險(xiǎn)性高。AFS及ICPMS在定性和定量方面都具有較好的準(zhǔn)確度和靈敏度,但需與色譜串聯(lián),儀器復(fù)雜且價(jià)格昂貴。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)中水產(chǎn)品甲基汞殘留測(cè)定方法為氣相色譜法,該法具有靈敏度高、儀器價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì),在實(shí)際工作中被廣泛應(yīng)用;但其前處理操作繁雜,對(duì)色譜柱及巰基棉柱要求高,結(jié)果不穩(wěn)定[16],大批量樣品測(cè)定較難操作,需進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)。

本研究對(duì)甲基汞殘留檢測(cè)氣相色譜法樣品前處理過(guò)程進(jìn)行改進(jìn),建立了水產(chǎn)品中甲基汞殘留量檢測(cè)新方法,方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、環(huán)保且成本低,為水產(chǎn)品中甲基汞風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

氣相色譜儀(配μECD檢測(cè)器)7890A型,Agilent公司;色譜柱DB-5型(30 m×0.25 mm×0.25 μm),Agilent公司;電子天平XP205DR型,瑞士梅特勒公司;冷凍離心機(jī)DL-6000B型,上海安亭科學(xué)儀器廠。

氯化甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(CAS 115-09-3)96.0%,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;甲苯色譜純,Sigma-Aldrich公司;五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)、溴化鉀、濃硫酸均為分析純。

硫酸銅溶液(1.0 mol/L):稱取62.5 g CuSO4·5H2O加純水溶解定容至250 mL;溴化鉀-硫酸混合溶液:稱取180 g溴化鉀溶于200 mL純水中,取55.0 mL濃硫酸溶于100 mL純水中,將兩份溶液混合定容至500 mL。

1.2儀器條件

參考朱霞萍等[17]方法。進(jìn)樣口溫度250 ℃;進(jìn)樣量1 μL,不分流進(jìn)樣;恒流模式,柱流速2 mL/min;μECD檢測(cè)器溫度300 ℃,尾吹氣50 mL/min;初始柱溫60 ℃,保持1 min,以20 ℃/min升至130 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升至280 ℃,保持1 min。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液準(zhǔn)確稱取氯化甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.0626 g,以甲苯溶解定容至50.00 mL容量瓶,配成質(zhì)量濃度為1000 mg/L的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,2～5 ℃條件下可儲(chǔ)存1年。

三、總之，玉米粗縮病是具有毀滅性的病害，只要發(fā)生就會(huì)很難治理，雖然在病株上噴施藥劑但也難恢復(fù)正常生長(zhǎng)。因此，加強(qiáng)在玉米粗縮病常發(fā)地區(qū)定點(diǎn)監(jiān)測(cè)和預(yù)報(bào)，定期調(diào)查小麥、田間雜草和玉米粗縮病的病株率，同時(shí)也調(diào)查灰飛虱越冬基數(shù)、發(fā)生密度和帶毒率，及時(shí)清除田間雜草，改變種植模式使用種子包衣，在科學(xué)的引導(dǎo)下農(nóng)民集中使用藥劑防治，將農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治相結(jié)合，才能有效控制灰飛虱和玉米粗縮病的發(fā)生，控制粗縮病的危害蔓延，盡可能的降低產(chǎn)量損失，提高玉米產(chǎn)量，增加農(nóng)民收入。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)中間溶液準(zhǔn)確移取甲基汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL,以甲苯定容至100.0 mL容量瓶,配成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,2～5 ℃條件下可儲(chǔ)存6個(gè)月。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)使用溶液使用時(shí),移取一定體積的甲基汞標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,用甲苯配制成質(zhì)量濃度分別為25.0、50.0、100、200、500、1000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4樣品前處理

新鮮魚、蝦、貝取可食肌肉組織搗碎、混勻,稱取2.00 g樣品于50 mL具塞離心管中,加入1.00 mol/L硫酸銅溶液0.5 mL、純水4.0 mL,渦旋混勻;向離心管中加溴化鉀-硫酸混合溶液2.0 mL,渦旋混勻;250 W超聲提取10 min;5500 r/min,4 ℃離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL具塞離心管。再向樣品殘?jiān)尤?.00 mol/L硫酸銅溶液0.5 mL、純水4.0 mL、溴化鉀-硫酸混合溶液2.0 mL,按以上步驟重復(fù)提取一次,合并兩次提取液。向提取液中加入4.0 mL甲苯,渦旋混合,靜置分層,吸取1.0 mL上層甲苯于進(jìn)樣瓶中,用于氣相色譜儀分析。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品前處理

甲基汞在生物組織中易與硫結(jié)合,必須破壞硫化合物并將其轉(zhuǎn)化為鹵代甲基汞,才可將甲基汞提取至有機(jī)溶劑中[18]。Hintelmann[19]研究表明,硫酸銅、硫酸和溴化鉀混合溶液對(duì)甲基汞的提取效果優(yōu)于鹽酸、氫氧化鉀等提取液,且產(chǎn)生乙基汞等雜質(zhì)較少。本研究利用Cu2+置換出組織中的甲基汞,通過(guò)溴化鉀-硫酸混合溶液將甲基汞轉(zhuǎn)化為溴化甲基汞,以達(dá)到對(duì)樣品中的甲基汞提取分離的目的。圖1為在本實(shí)驗(yàn)條件下得到的濃度為50.0 μg/L甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和加標(biāo)量為100 μg/kg的牡蠣樣品(B)氣相色譜圖。從圖中可以看出,本方法對(duì)樣品處理后得到的甲基汞色譜峰峰型尖銳、對(duì)稱,信號(hào)響應(yīng)高,基體干擾小。硫酸銅、硫酸和溴化鉀混合溶液對(duì)甲基汞的提取和純化達(dá)到了滿意效果。

圖1　甲基汞標(biāo)準(zhǔn)品(A)和牡蠣樣品(B)氣相色譜圖Fig.1　Gas chromatograms of MMC standard solution(A) and 100 Oyster tissue spiked with MMC(B)

表1　GB/T5009.17-2003和本方法甲基汞檢測(cè)前處理過(guò)程比較Table 1　Comparison of the preparation procedure for MMC determination using GB/T5009.17-2003 or primary method

注:表中所列耗時(shí)為作者處理一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品所需時(shí)間,結(jié)果因操作不同可能存在差異。

本研究用毒性較小的甲苯代替苯作為萃取劑[20],降低了實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)境和操作人員健康造成的危害。同時(shí),本研究在反萃過(guò)程中采用5500 r/min高速離心處理,避免乳化現(xiàn)象,有助于提高回收率。

此外,本研究采用超聲10 min輔助提取樣品中的甲基汞,各樣品回收率可達(dá)80%以上(表2);與振蕩提取60 min處理[16]相比,本方法不僅能提高提取速率,也能增大提取效率。

2.2方法效率評(píng)估

GB/T 5009.17-2003處理一個(gè)樣品至少需12步,經(jīng)3次轉(zhuǎn)移和1次過(guò)柱與洗脫,共耗時(shí)約100 min(表1),其操作過(guò)程繁雜,尤其巰基棉富集過(guò)程容易導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性欠佳[16]。本研究前處理過(guò)程只需7步,經(jīng)1次轉(zhuǎn)移過(guò)程,單個(gè)樣品耗時(shí)僅約30 min,前處理簡(jiǎn)便、快速。本方法所有操作在離心管中完成,避免了多次轉(zhuǎn)移對(duì)目標(biāo)物造成的損失,保證了回收率,也節(jié)約了實(shí)驗(yàn)試劑和材料,降低成本。

此外,GB/T5009.17-2003法需在實(shí)驗(yàn)前制備巰基棉,整個(gè)制備過(guò)程約需5 d,制備過(guò)程對(duì)溫度、水分要求較高,且?guī)€基棉吸附效率對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大。本研究實(shí)驗(yàn)前只需簡(jiǎn)單的溶液配制,操作簡(jiǎn)單。

2.3線性關(guān)系

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)氣相色譜測(cè)定,以峰面積為縱坐標(biāo)y,以甲基汞的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x,作線性回歸分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。所得線性方程為y=21.49x-660.9,線性相關(guān)系數(shù)r=0.9995,甲基汞在25.0～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)有良好線性。

圖2　甲基汞標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.2　Calibration curve for MMC determination

2.4檢出限與定量限

本研究以甲基汞添加量為50.0 μg/kg的空白樣品考察方法靈敏度。加標(biāo)樣品按上述方法進(jìn)行提取、凈化、測(cè)定并計(jì)算信噪比。以3倍信噪比(S/N=3)時(shí)對(duì)應(yīng)的添加濃度為檢出限,以10倍信噪比(S/N=10)對(duì)應(yīng)的添加濃度為定量下限,依此計(jì)算得出,本方法檢出限為7.58 μg/kg,定量限為25.0 μg/kg,陳雪昌等[1]利用高效液相色譜-原子熒光法測(cè)定水產(chǎn)品中甲基汞定量限為20 μg/kg,靈敏度同本法相近。該法檢出限遠(yuǎn)低于國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限量[7],結(jié)果靈敏可靠,可以滿足甲基汞檢測(cè)工作等需求。

2.5回收率與精密度

本研究以草魚、卵形鯧鲹、對(duì)蝦、牡蠣等4種代表性水產(chǎn)品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(表2),空白加標(biāo)樣品中未檢出甲基汞。每種水產(chǎn)品分別做4個(gè)濃度水平,每個(gè)水平做6個(gè)重復(fù),按上述方法測(cè)定樣品中的甲基汞含量,考察方法的回收率和精密度。結(jié)果顯示(表2),4種水產(chǎn)品在加標(biāo)濃度為50.0、100、500、1000 μg/kg時(shí),回收率范圍為80.8%～108%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.56%～8.10%。由此可見(jiàn),本方法測(cè)定4種不同水產(chǎn)品基質(zhì)中甲基汞都有較高的回收率和良好的精密度,可以滿足水產(chǎn)品中甲基汞殘留檢測(cè)要求。

表2　不同水產(chǎn)品加標(biāo)回收率與精密度(n=6)Table 2　Recovery and precision for MMC determination in different aquatic product(n=6)

3　結(jié)論

本研究對(duì)甲基汞氣相色譜法前處理過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化,改進(jìn)后的方法甲基汞提取和凈化過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、環(huán)保、節(jié)約,檢測(cè)結(jié)果雜質(zhì)干擾少,在25.0～1000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好,方法靈敏、可靠,回收率高,精密度和準(zhǔn)確度都可以滿足實(shí)際工作中大量樣品檢測(cè)需求。

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Method optimization for methylmercury determination in aquatic products

LIU Qi1,KE Chang-liang1,CHEN Jie-wen1,LIN Song-xiong1,CAI Nan1,HUANG Ke1,JI Xiao-min2,LI Liu-dong1,*

(1.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation,Ministry of Agriculture,Guangzhou 510300,China;2. Shanwei Oceanic and Fishery Environment Monitoring Station,Shanwei 516611,China)

A method was developed for methylmercury(MMC)fast determination in aquatic products through standard method optimizing. Samples were extracted by sulfuric acid and potassium bromide in assist of ultrasound,back-extracted by toluene,detected by gas chromatography(GC). As shown,calibration curve(y=21.49x-660.9)was in good linearity with a correlation coefficient of 0.9995 in the range of 25.0～1000 μg/L. The limit of detection(LOD)and the limit of quantitation(LOQ)were 7.58 and 25.0 μg/kg,respectively. While spiked at 50.0,100,500 and 1000 μg/kg,the recoveries of MMC ranged from 80.8% to 108% with relative standard deviation(RSD)of 1.56%～8.10%. It indicated that the method was qualified to detect MMC residue in aquatic products. After optimization,efficiency of sample analysis was greatly improved because of the reduction of half procedures and two thirds time saving,which made the method suitable for quantitation of MMC in batch samples.

methylmercury;aquatic products;GC;fast determination

2015-04-13

劉奇(1987-),男,碩士研究生,研究實(shí)習(xí)員,研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全,E-mail:liuqi03@hotmail.com。

李劉冬(1959-),男,本科，研究員,研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全,E-mail:168LLd@163.com。

國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專項(xiàng)(GJFP2014009)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,2014TS10)；農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目(NYJG201306)。

TS254.7

A

1002-0306(2016)03-0299-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.054