于小龍,　徐　進(jìn),　張　昊,　許景升,黃　雯,　胡曉梅,　馮　潔*,　王學(xué)利

(1. 天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院, 天津　300384; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京　100193)

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PMA-PCR方法快速檢測(cè)VBNC狀態(tài)青枯菌

于小龍1,2,徐進(jìn)2,張昊2,許景升2,黃雯2,胡曉梅2,馮潔2*,王學(xué)利1*

(1. 天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院, 天津300384; 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100193)

青枯菌為應(yīng)對(duì)逆境脅迫,可進(jìn)入活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)(viablebutnon-culturable,VBNC)。本文利用疊氮溴化丙錠(PMA)與PCR技術(shù)相結(jié)合,建立了一種快速有效區(qū)分青枯菌死活細(xì)胞的分子檢測(cè)方法?；趆rcS基因序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)青枯菌種特異性檢測(cè)引物hrcSf/hrcSr;利用PMA對(duì)青枯菌Po82菌株的細(xì)胞懸浮液樣品進(jìn)行預(yù)處理,隨后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明,當(dāng)樣品中PMA質(zhì)量濃度為3μg/mL、曝光時(shí)間大于5min時(shí),PMA可有效抑制死亡菌體細(xì)胞中的DNA擴(kuò)增;且對(duì)可培養(yǎng)和VBNC狀態(tài)細(xì)胞中的DNA擴(kuò)增沒(méi)有影響;本試驗(yàn)建立的PMA-PCR方法能有效對(duì)包括VBNC狀態(tài)在內(nèi)的青枯菌活菌進(jìn)行檢測(cè),避免了假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

青枯菌;疊氮溴化丙錠;活的非可培養(yǎng)狀態(tài)

茄科雷爾氏菌[Ralstonia solanacearum (Smith, 1896)Yabuuchietal. 1996]簡(jiǎn)稱(chēng)青枯菌,引起植物細(xì)菌性青枯病。青枯菌可以侵染54個(gè)科,超過(guò)450種寄主植物,包括馬鈴薯、香蕉、番茄、煙草、豇豆、花生、腰果、木瓜、油橄欖和生姜等諸多重要糧食及經(jīng)濟(jì)作物[1]。在我國(guó),青枯病自20世紀(jì)30年代首次于長(zhǎng)江中下游地區(qū)被報(bào)道以來(lái),目前已向南擴(kuò)散至20°N的海南省、向北擴(kuò)散至42°N河北壩上地區(qū)[2],成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要限制因子。

作為研究寄主植物與病原細(xì)菌互作的模式系統(tǒng)之一,青枯菌毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及致病分子機(jī)理等方面的研究已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。但作為土壤習(xí)居菌,青枯菌于土壤及水體環(huán)境中生態(tài)流行學(xué)研究領(lǐng)域的工作則相對(duì)滯后。一種觀點(diǎn)認(rèn)為青枯菌利用植物殘?bào)w降解后產(chǎn)生的芳香族化合物作為營(yíng)養(yǎng)代謝底物,從而得以在土壤中長(zhǎng)期存活[3];另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為青枯菌,特別是3號(hào)小種,在土壤環(huán)境中可進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viablebutnon-culturableVBNC),并于該狀態(tài)下長(zhǎng)期存活[4]。VBNC狀態(tài)是細(xì)菌為應(yīng)對(duì)極端溫度、滲透壓、寡營(yíng)養(yǎng)和重金屬等逆境脅迫而普遍采用的一種生存策略。1982年,VBNC狀態(tài)細(xì)菌首次被報(bào)道。目前已知85種細(xì)菌存在VBNC狀態(tài),其中僅有5種植物相關(guān)細(xì)菌,分別為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorenscence)、地毯草黃單胞菌柑橘致病變種(Xanthomonas axonopodispv. citri)、大豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)[5]、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和茄科雷爾氏菌(R.solanacearum)[6-8]。

由于進(jìn)入VBNC狀態(tài)的細(xì)菌無(wú)法采用常規(guī)平板畫(huà)線技術(shù)培養(yǎng),故而造成VBNC狀態(tài)細(xì)菌的假陰性檢測(cè)結(jié)果,致使以該狀態(tài)存在的細(xì)菌成為隱性初侵染源,進(jìn)而對(duì)公共衛(wèi)生安全、糧食安全以及食品安全構(gòu)成潛在的威脅。目前常用于VBNC狀態(tài)細(xì)菌檢測(cè)的方法分別基于顯微光學(xué)、免疫學(xué)以及分子檢測(cè)技術(shù)[8]。PMA-PCR和EMA-PCR是近年來(lái)基于常規(guī)PCR技術(shù)發(fā)展起來(lái)用于VBNC狀態(tài)細(xì)菌的檢測(cè)方法。這兩種方法克服了常規(guī)PCR無(wú)法區(qū)分活體細(xì)菌與死亡菌體釋放出的游離DNA的缺陷,可有效避免假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。

疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide,PMA)與溴化乙錠單疊氮溴(ethidiummonoazidebromide,EMA)是光敏DNA染料,無(wú)法透過(guò)擁有完整結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜,只能修飾細(xì)胞死亡后暴露出來(lái)的DNA,并與之形成穩(wěn)定的共價(jià)氮碳鍵,從而阻斷DNA分子的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),在強(qiáng)光照射下剩余的PMA和EMA與水分子反應(yīng)生成沒(méi)有活性的羥胺[9]。PMA與EMA較其他方法更快捷,并且能與PCR結(jié)合,達(dá)到快速檢測(cè)的目的,但由于溴化乙錠單疊氮溴(EMA)具有細(xì)胞毒性[10]并且其檢測(cè)上限為108cfu/mL[11],故本試驗(yàn)選用PMA為光敏DNA染料。

本研究以用常規(guī)方法難以檢測(cè)的VBNC狀態(tài)青枯菌為切入點(diǎn),旨在建立VBNC狀態(tài)青枯菌的快速分子檢測(cè)技術(shù)體系,藉此為植物繁殖材料的帶菌檢測(cè)與防控策略的效果評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持,并為進(jìn)一步深入解析青枯菌生態(tài)流行學(xué)規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株及培養(yǎng)方法:本研究使用的青枯菌菌株與環(huán)境菌株材料均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室,詳見(jiàn)表1。

表1　特異性驗(yàn)證所用青枯菌菌株Table 1　Ralstonia solanacearum strains used in this study

參試菌株均采用NA平板于28℃條件下培養(yǎng),培養(yǎng)基配方如下:葡萄糖10g、多聚蛋白胨5g、牛肉膏3g、酵母提取物0.5g、瓊脂18g,調(diào)pH至7.0。定容至1L,121℃滅菌20min。

試劑和耗材:疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide)(BiotiumCat.No.40013)、 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(BioTekeCat.No.DP2002)、MarkerI(BingDa)、PCR儀(AppliedBiosystems)、Advantage2PolymeraseMix(Cat.No.639201);其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1青枯菌死菌懸浮液的制備

分別挑取室溫條件下保存于滅菌去離子水中的各供試菌株,于紅四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride,TZC)培養(yǎng)平板上畫(huà)線,30℃條件下培養(yǎng)48h后,挑取典型的青枯菌野生型菌落,轉(zhuǎn)至普通NA培養(yǎng)平板,30℃條件下培養(yǎng)48h。采用比濁法,挑取各純培養(yǎng)物,分別于滅菌去離子水中配制成濃度為3×108cfu/mL的細(xì)菌懸浮液, 100℃水浴處理10min,獲得青枯菌死菌細(xì)胞懸浮液。并于NA平板上畫(huà)線,驗(yàn)證致死效果后備用。

1.2.2PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中登錄的青枯菌Po82菌株的hrcS基因核苷酸序列(NC_017575.1 1330556-1330816),利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerBLAST進(jìn)行青枯菌種特異性引物設(shè)計(jì),交由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3PCR擴(kuò)增條件

根據(jù)預(yù)試驗(yàn),確立反應(yīng)體系。25μL體系中包括PCRMix10μL,hrcSf(0.099nmol/μL)1μL,hrcSr(0.106nmol/μL) 1μL,樣品1μL,ddH2O12μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s,59℃退火30s,72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。

1.2.4PCR特異性試驗(yàn)

分別以52個(gè)青枯菌菌株和3個(gè)參照環(huán)境菌株DNA為擴(kuò)增模板,用特異性引物hrcSf/hrcSr進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系及程序同1.2.3,以滅菌去離子水為陰性對(duì)照,擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂凝膠電泳檢測(cè),觀察結(jié)果。

1.2.5引物擴(kuò)增靈敏度

用核酸濃度測(cè)定儀(Gene公司,NanoVueplus)測(cè)定所提取的Po82基因組DNA濃度,并10倍梯度依次稀釋為25ng/μL、2.5ng/μL、250pg/μL、25pg/μL、2.5pg/μL；按1.2.1方法制備濃度為3×108cfu/mL的Po82菌懸液，10倍梯度稀釋至3×101cfu/mL。利用特異性引物hrcSf/hrcSr,按1.2.3的反應(yīng)體系和程序分別對(duì)梯度稀釋的Po82基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察結(jié)果。

1.2.6樣品的PMA處理方法

PMA溶液于-20℃避光保存。取500μL制備好的菌懸液置于1.5mL離心管中,加入2μL濃度為 1mg/mL的PMA溶液,使PMA的終濃度為4μg/mL;PMA與菌懸液混合均勻后在室溫條件下避光放置5min,利用500W的鹵素?zé)羝毓?min,光照交聯(lián)時(shí)樣品置于冰上(避免過(guò)熱),且在距光源50cm處;交聯(lián)后的懸浮液1 000g離心5min,所得沉淀溶于500μL無(wú)菌水中。

1.2.7青枯菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)

高溫處理:將1mL3×108cfu/mL的菌懸液分別以50、52、54、56、58、60、62、64和66℃處理30min后,分別取1μL涂布于NA平板,48h后查看菌落數(shù)。

確定青枯菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)后,采用PMA-PCR進(jìn)行檢測(cè),對(duì)照組為同濃度的青枯菌死菌和可培養(yǎng)狀態(tài)的活菌。

2　結(jié)果與分析

2.1特異性引物設(shè)計(jì)

基于我們?cè)缙诎l(fā)表的Po82全基因組序列中hrcS基因,設(shè)計(jì)了12對(duì)引物,從中篩選獲得了一對(duì)特異性引物(hrcSf/hrcSr)(表2),可擴(kuò)增獲得大小為246bp的目的片段。

表2　青枯菌hrcS基因PCR擴(kuò)增引物序列Table 2　Primer sequences of Ralstonia solanacearum hrcS gene

2.2PCR條件的確立

在反應(yīng)體系中分別加入7.5、10、12.5μLPCRMix,擴(kuò)增條帶無(wú)明顯差異;不同退火溫度:56、57、58、59、60、61℃所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶無(wú)明顯差異;引物含量分別為0.6、0.8、1.0、1.2μL所得到的擴(kuò)增條帶也無(wú)明顯差異(圖1);由此擬定25μL反應(yīng)體系組成為:PCRMix10μL、上下游引物各1μL、樣品1μL、ddH2O12μL、退火溫度59℃。

圖1　引物hrcSf/hrcSr PCR條件驗(yàn)證結(jié)果Fig.1　PCR conditions validation with primers hrcSf/hrcSr

2.3PCR特異性與靈敏度驗(yàn)證

2.3.1特異性驗(yàn)證

以55個(gè)參試菌株的DNA為模板(表1),采用特異性引物hrcSf/hrcSr進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,所有青枯菌DNA均能擴(kuò)增出246bp左右的單一特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果一致。而甘露醇雷爾氏菌、腸桿菌和金黃桿菌等對(duì)照細(xì)菌則未產(chǎn)生擴(kuò)增條帶(圖2)。

2.3.2靈敏度驗(yàn)證

以特異性引物hrcSf/hrcSr分別對(duì)不同濃度梯度的Po82基因組DNA與菌懸液進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)置無(wú)菌水為模板的陰性對(duì)照,結(jié)果顯示:最低DNA和菌體懸浮液的檢測(cè)濃度分別為25pg/μL和3×103cfu/mL(圖3)。

2.4高溫脅迫誘導(dǎo)青枯菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)

如表3所示,菌懸液經(jīng)52℃以上的高溫處理30min后,按常規(guī)方法涂板培養(yǎng),其菌落計(jì)數(shù)為0。表明處理后的青枯病菌進(jìn)入了VBNC狀態(tài),將樣品室溫靜置35d后,所有樣品恢復(fù)可培養(yǎng)狀態(tài)。

圖2　引物hrcSf/hrcSr特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.2　Specificity of the primer set hrcSf/hrcSr for detection of Ralstonia solanacearum

圖3　引物hrcSf/hrcSr靈敏度驗(yàn)證結(jié)果Fig.3　Sensitivity of the primer set hrcSf/hrcSr for detection of cell suspension and total DNA of Ralstonia solanacearum

2.5處于VBNC狀態(tài)青枯菌的PMA-PCR檢測(cè)

對(duì)進(jìn)入VBNC狀態(tài)的菌懸液進(jìn)行PMA-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示(圖4),經(jīng)過(guò)PMA預(yù)處理的樣品1～9產(chǎn)生特異性擴(kuò)增條帶, 而滅活組11則無(wú)特異性條帶,表明PMA-PCR能檢測(cè)處于VBNC狀態(tài)的青枯病菌,并有效避免了常規(guī)平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。

2.6PMA-PCR 檢測(cè)方法的假陽(yáng)性驗(yàn)證

為驗(yàn)證PMA-PCR是否產(chǎn)生假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果,分別采用常規(guī)平板計(jì)數(shù)、PCR與PMA-PCR對(duì)3組死菌樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(表4)表明,常規(guī)PCR能以死菌DNA作為模板正常擴(kuò)增,檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性;而PMA-PCR僅以活菌為檢測(cè)靶標(biāo),未出現(xiàn)假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果(圖5),平板計(jì)數(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了PMA-PCR的可靠性。

表3　不同溫度處理后青枯菌Po82涂板計(jì)數(shù)結(jié)果Table 3　Colony number of bacterial suspensionsof Ralstonia solanacearum strain Po82 treated bydifferent temperatures

圖4　不同溫度處理樣品PMA-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4　PMA-PCR products of bacterial suspensions of Ralstonia solanacearum strain Po82 treated by different temperatures

圖5死菌樣品PCR與PMA-PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.5Comparison of PCR and PMA-PCR for detection of dilution series of dead Ralstonia solanacearum cells

表4　常規(guī)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、常規(guī)PCR法、PMA-PCR測(cè)定滅活青枯菌的比較Table 4　Comparison of plate counting, PCR andPMA-PCR for detection of dead Ralstonia solanacearum cells

3　討論

VBNC狀態(tài)是細(xì)菌特有的逆境生理生態(tài)響應(yīng)機(jī)制,該狀態(tài)下的細(xì)菌具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)、維持低水平呼吸與代謝速率、保持高ATP等級(jí),且基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及蛋白翻譯合成均發(fā)生了相應(yīng)改變,并可于適當(dāng)條件下恢復(fù)可培養(yǎng)狀態(tài)。VBNC狀態(tài)的細(xì)菌與環(huán)境監(jiān)測(cè),食品加工和檢測(cè)技術(shù)以及疾病控制等諸多領(lǐng)域均密切相關(guān),且目前對(duì)細(xì)菌可培養(yǎng)與VBNC兩者狀態(tài)之間相互轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機(jī)理尚不清楚,因此研究VBNC狀態(tài)的細(xì)菌對(duì)于了解細(xì)菌的致病機(jī)理及生態(tài)適應(yīng)性至關(guān)重要[12-14]。

Grey等2001年首次報(bào)道了采用銅制劑誘導(dǎo)青枯菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)[8]。本研究嘗試了采用高溫脅迫誘導(dǎo)青枯菌2號(hào)小種Po82菌株快速進(jìn)入VBNC狀態(tài),并使用常規(guī)平板培養(yǎng)與PMA-PCR結(jié)合驗(yàn)證其是否被成功誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC狀態(tài)。初步試驗(yàn)結(jié)果顯示52℃及以上溫度可成功誘導(dǎo)Po82進(jìn)入VBNC狀態(tài),68℃為青枯菌的致死溫度。去除脅迫后,進(jìn)入VBNC狀態(tài)的Po82菌株可復(fù)蘇至可培養(yǎng)狀態(tài)。但隨著脅迫溫度的升高,復(fù)蘇時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng):52～56℃處理,室溫下靜置數(shù)小時(shí)后即可復(fù)蘇;58～62℃處理,2d后可復(fù)蘇;64～66℃,復(fù)蘇時(shí)間則延長(zhǎng)至35d。該結(jié)果與OliverandBockian等描述的通過(guò)簡(jiǎn)單溫度變化可引起VBNC狀態(tài)細(xì)菌復(fù)蘇基本吻合[15-16],本研究結(jié)果同時(shí)提示我們應(yīng)重新審視澳大利亞政府生物安全官方文件報(bào)道的青枯菌致死溫度為52℃的結(jié)論,以及悶棚、生物熏蒸和50℃溫湯浸種等高溫物理防治措施能否達(dá)到預(yù)期的青枯病防治效果[17-19]。

本研究錨定與致病密切相關(guān)的hrp基因簇中保守基因hrcS作為青枯菌種水平檢測(cè)靶標(biāo)。hrp基因簇廣泛存在于植物與動(dòng)物病原細(xì)菌中,其編碼產(chǎn)物參與組裝形成Ⅲ型分泌系統(tǒng),并通過(guò)該系統(tǒng)直接將Ⅲ型效應(yīng)子注入寄主細(xì)胞,以抑制植(動(dòng))物的防御反應(yīng)。與野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)等植物病原細(xì)菌不同,青枯菌的hrp基因簇是與祖先基因共同進(jìn)化的核心基因組成員,而非通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得的致病島[20]。細(xì)菌自然進(jìn)化過(guò)程中核心基因經(jīng)受了更大的選擇壓力,因此在種水平上具有高度保守性,以此類(lèi)基因作為檢測(cè)靶標(biāo),比利用基因間隔區(qū)序列和未知功能片段更為可靠。

綜上所述,本研究建立的PMA-PCR檢測(cè)方法能從混合狀態(tài)下的純培養(yǎng)菌中特異性檢測(cè)出1×103cfu/mL的青枯菌活菌,并能夠有效區(qū)分死細(xì)胞和VBNC狀態(tài)的菌體,為處于VBNC狀態(tài)的青枯菌檢測(cè)提供了更為準(zhǔn)確、科學(xué)的檢測(cè)方法,具有一定的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Rapiddetectionofviablebutnon-culturable(VBNC) Ralstonia solanacearumbyPMA-PCRmethod

YuXiaolong1,2,XuJin2,ZhangHao2,XuJingsheng2,HuangWen2,HuXiaomei2,FengJie2,WangXueli1

(1.CollegeofHorticultureandLandscape,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China;2.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,Beijing100193,China)

Ralstonia solanacearumcanenterintotheVBNCstate(viablebutnon-culturable)inresponsetoadverseenvironmentalconditions.Anovelmethodtodifferentiateviable/deadcellsofR.solanacearumwasestablishedbyusingaDNAdyeofpropidiummonoazide(PMA)incombinationwiththepolymerasechainreaction(PMA-PCR).OnthebasisofhrcSgenesequence,aspecies-specificprimersethrcSf/hrcSrwasdesignedfordetectionofR.solanacearum.Sampleswerepre-treatedwithPMAwhichboundDNAfromdeadcellssothatonlyviablecellscanbeamplifiedbyPCR.Afinalconcentrationof3μg/mLPMAand5-minexposuretimewasfoundtocompletelyinhibitPCRamplificationfromDNAofdeadcells,andhadnoinhibitioneffectonviableandviablebutnon-culturable(VBNC)cells.ThePMA-PCRmethodestablishedinthisworkcandetectviableandviablebutnon-culturable(VBNC)cellsandavoidfalsepositiveandfalsenegationresultofR.solanacerum.

Ralstonia solanacerum;propidummonoazide;viablebutnon-culturable

2014-12-31

2015-02-09

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303015); 國(guó)家自然科學(xué)基金(31272008，31371908); 天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目(201002250)

E-mail:wxlzxp@sohu.com;jfeng@ippcaas.cn

S436.411

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.026