谷　巖,　梁　爽,　侯志廣,　趙曉峰,　王鑫宏,　逯忠斌

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,長(zhǎng)春　130118)

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液相色譜法測(cè)定芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻中的貯存穩(wěn)定性

谷巖,梁爽,侯志廣,趙曉峰,王鑫宏,逯忠斌*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,長(zhǎng)春130118)

建立了芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻樣品中殘留的高效液相色譜分析方法,并研究了二者在水稻樣品中的貯存穩(wěn)定性。貯存在-18℃和-20℃下水稻樣品經(jīng)提取凈化后,采用高效液相色譜儀-紫外檢測(cè)器,在240 nm波長(zhǎng)下對(duì)試樣中的芐嘧磺隆和仲丁靈進(jìn)行分離和定量分析。結(jié)果表明,芐嘧磺隆和仲丁靈的峰響應(yīng)面積與進(jìn)樣濃度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7和0.999 9。芐嘧磺隆的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～12.0%,回收率為77.2%～104.6%。仲丁靈的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%～7.6%,回收率為73.0%～106.4%。芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻5種基質(zhì)中貯存90 d后分解率小于5%,符合FAO/WHO聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的等同認(rèn)定要求。芐嘧磺隆和仲丁靈具有良好的穩(wěn)定性。

芐嘧磺隆;仲丁靈;水稻;高效液相色譜法;貯存穩(wěn)定性

芐嘧磺隆(bensulfuron-methyl,BSM)屬磺酰脲類(lèi)除草劑,主要用于水稻田防除一年生和部分多年生闊葉雜草和莎草科雜草[1-3]。仲丁靈(butralin)屬于二硝基苯胺類(lèi)芽前除草劑[4-5],對(duì)一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草具有良好的防效[6]。二者復(fù)配可擴(kuò)大殺草范圍,增強(qiáng)防治效果。對(duì)于二者的殘留分析方法，已報(bào)道的主要有高效液相色譜法[7-9]和氣相色譜法[10-11]等。而采用高效液相色譜同時(shí)分析芐嘧磺隆和仲丁靈的方法目前尚未見(jiàn)報(bào)道。在水稻樣品貯存過(guò)程中,目標(biāo)農(nóng)藥穩(wěn)定與否直接關(guān)系到試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性[12],因此,明確不同農(nóng)藥在基質(zhì)中的最佳貯存條件和貯存時(shí)間非常重要,從而保證被分析農(nóng)藥在貯存時(shí)期內(nèi)未發(fā)生變化。EPA[13]、OECD[14]和FAO[15]的準(zhǔn)則中對(duì)農(nóng)藥殘留的貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)做了要求與規(guī)定,殘留試驗(yàn)樣品應(yīng)該在采樣或收獲24 h內(nèi)冷凍貯存。研究表明，農(nóng)藥在低溫冷凍條件下貯存通常會(huì)更穩(wěn)定[16-19]。故本文選擇常用低溫冷凍溫度-18℃和-20℃,研究了芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻樣品中的貯存穩(wěn)定性,并建立了兩者的高效液相色譜分析方法。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1主要儀器和試劑

Agilent1200高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器);Thermo-BDS Hypersil C18色譜柱(5 μm,250 mm×4.6 mm);水浴恒溫振蕩器;超聲波清洗器;植物粉碎機(jī);高速攪拌器;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;減壓抽濾器;層析柱等玻璃器皿。

芐嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.5%),仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%),由德國(guó)Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司提供;32%芐嘧磺隆·仲丁靈可濕性粉劑(有效成分含量:2%芐嘧磺隆,30%仲丁靈),由江蘇省蘇州市寶帶農(nóng)藥提供。其他試劑包括：乙腈(色譜純);水(二次蒸餾水);冰乙酸,甲醇,二氯甲烷,乙酸乙酯(均為分析純);中性氧化鋁和弗羅里硅土。

1.2色譜條件

流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰乙酸。

土壤、稻田水、稻殼、植株提取樣品梯度洗脫條件：0～6 min，保持55%乙腈；7～20 min，保持80%乙腈；21 ～33 min，保持55%乙腈。保留時(shí)間：芐嘧磺隆為6.3～6.5 min；仲丁靈為16.8～17.0 min。

糙米提取樣品梯度洗脫條件：0～13 min，保持58%乙腈；13～21.5 min，保持79%乙腈；22～35 min，保持58%乙腈。保留時(shí)間：芐嘧磺隆為5.6～5.8 min；仲丁靈為17.6～17.8 min。

土壤、稻田水、稻殼、植株提取樣品梯度洗脫條件:0～6 min,保持55%乙腈；7～20 min,保持80%乙腈；21～33 min,保持55%乙腈。保留時(shí)間:芐嘧磺隆為6.3～6.5 min；仲丁靈為16.8～17.0 min。

糙米提取樣品梯度洗脫條件:0～13 min,保持58%乙腈；13～21.5 min,保持79%乙腈；22～35 min,保持58%乙腈。保留時(shí)間:芐嘧磺隆為5.6～5.8 min；仲丁靈為17.6～17.8 min。

1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別稱(chēng)取芐嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品0.0102 g、仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g(均精確至0.000 2 g),分別置于10 mL容量瓶中,甲醇定容配制成標(biāo)準(zhǔn)母液,分別稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L共5個(gè)不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,搖勻,按照1.2給出的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以進(jìn)樣濃度x為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的色譜峰響應(yīng)面積值y為縱坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.4樣品前處理

1.4.1樣品的提取

稻田土壤、糙米、稻殼:稱(chēng)取土壤50.0 g,糙米20.0 g,稻殼10.0 g,于具塞三角瓶中,加入80 mL乙腈和10 mL水,恒溫水浴振蕩1 h,在輔有助濾劑的布氏漏斗中減壓抽濾,收集濾液,置于裝有7 g氯化鈉的具塞量筒中上下振蕩150次,靜置1 min,再上下振蕩100次,靜置1 h,取40 mL上清液濃縮后待凈化。

水稻植株:稱(chēng)取植株20.0 g,加入80 mL乙腈,組織搗碎后,在輔有助濾劑的布氏漏斗中減壓抽濾,收集濾液,置于裝有7 g氯化鈉的具塞量筒中上下振蕩150次,靜置1 min,再上下振蕩100次,靜置1 h,取40 mL上清液濃縮后待凈化。

稻田水:量取50 mL稻田水,置于250 mL分液漏斗中,加入1 mol/L鹽酸溶液,pH調(diào)至2～3,乙酸乙酯(40、40、40 mL)萃取3次,過(guò)裝有適量無(wú)水硫酸鈉的漏斗后,用平底燒瓶收集濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40℃下減壓濃縮至近干,氮?dú)獯蹈珊?5 mL甲醇定容,過(guò)0.22 μm濾膜,待液相色譜測(cè)定。

1.4.2柱層析凈化

裝柱：用于凈化土壤、糙米、稻殼提取物的層析柱從下至上依次為2 cm無(wú)水硫酸鈉、2 g弗羅里硅土和2 cm無(wú)水硫酸鈉;用于凈化植株提取物的層析柱從下至上依次為2 cm無(wú)水硫酸鈉、3 g中性氧化鋁和2 cm無(wú)水硫酸鈉。

凈化：將土壤、植株、稻米和稻殼提取后濃縮的樣品轉(zhuǎn)移至層析柱中,先用20 mL二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)預(yù)淋洗,再用100 mL二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)洗脫,洗脫液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在40℃下減壓濃縮至近干,隨后用氮?dú)獯蹈伞艋蟮耐寥罉悠酚? mL甲醇定容;植株、糙米、稻殼樣品用2 mL甲醇定容,用0.22 μm濾膜除菌,待液相色譜測(cè)定。

1.5方法的準(zhǔn)確度和精密度

用未施用過(guò)芐嘧磺隆和仲丁靈的稻田水、土壤、植株、稻殼和糙米樣品(空白對(duì)照)分別進(jìn)行3個(gè)添加水平(0.05、0.5、1.0 mg/L)的添加回收試驗(yàn),每個(gè)水平重復(fù)5次。按照上述樣品前處理方法和色譜條件測(cè)定方法回收率。

1.6貯存穩(wěn)定性試驗(yàn)

32%芐嘧磺隆·仲丁靈可濕性粉劑的田間試驗(yàn)施藥濃度通常為低劑量(推薦劑量)和高劑量(1.5倍推薦劑量,有效成分504 g/hm2),本試驗(yàn)在室內(nèi)模擬田間試驗(yàn),濃度設(shè)置為有效成分2 520 g/hm2(高劑量的5倍)。

分別稱(chēng)取稻田土壤空白樣品5.0 kg、稻田水空白樣品3.0 L、植株空白樣品 2.0 kg、糙米空白樣品2.0 kg、稻殼空白樣品1.0 kg置于不同容器內(nèi),再分別稱(chēng)取0.052 5、0.030 5、0.020 6、0.020 6和0.010 3 g 32%芐嘧磺隆·仲丁靈可濕性粉劑,兌水溶解后均勻噴施于土壤、稻田水、植株、糙米和稻殼樣品中,混勻,置于-18℃和-20℃冰箱內(nèi)保存(使用溫度記錄儀觀察溫度變化)。每個(gè)樣品的每個(gè)溫度處理設(shè)3次重復(fù)。在施藥后 0.5 h、7、15、30、60、90 d采集樣品,檢測(cè)樣品中芐嘧磺隆和仲丁靈的濃度變化。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

為了能使芐嘧磺隆和仲丁靈與雜質(zhì)有效分離,先后試驗(yàn)了甲醇-水,乙腈-水,乙腈-0.1%冰乙酸的流動(dòng)相對(duì)兩種除草劑的峰形、分離度、出峰時(shí)間,最終選擇乙腈-0.1%冰乙酸,并根據(jù)樣品基質(zhì)不同設(shè)置梯度洗脫,使芐嘧磺隆和仲丁靈有較好的分離效果,峰形對(duì)稱(chēng),保留時(shí)間適中,可以滿(mǎn)足分析要求。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

芐嘧磺隆的最大吸收在238 nm處,仲丁靈的最大吸收在240 nm處,綜合樣品中2個(gè)有效成分的含量,確定240 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3方法的線(xiàn)性關(guān)系

結(jié)果表明,芐嘧磺隆和仲丁靈峰響應(yīng)面積值y與進(jìn)樣濃度x有著良好的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性回歸方程為：芐嘧磺隆y=26.873x+0.797 7,相關(guān)系數(shù)為0.999 7;仲丁靈y=113.42x+1.018 8,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。(圖1)

圖1　芐嘧磺隆和仲丁靈的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1　Standard curve of bensulfuron-methyl and butralin

2.4方法精密度和準(zhǔn)確度

在選定的色譜條件下,以3倍信噪比計(jì)算得芐嘧磺隆和仲丁靈的方法最小檢出量(LOD)為0.310 ng和0.057 ng,最低檢測(cè)濃度均為0.100 mg/L。不同方法添加回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2和表1。由表可知:在3個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加水平下,平均回收率為73.0%～106.4%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～12.0%,分析結(jié)果符合農(nóng)藥殘留量分析與檢測(cè)技術(shù)的要求。

圖2　水稻土壤中的芐嘧磺隆和仲丁靈的色譜圖(芐嘧磺隆:6.3～6.5 min,仲丁靈:16.8～17.0 min)Fig.2　Chromatograms of two pesticides in paddy soil (bensulfuron-methyl:6.3～6.5 min,butralin:16.8～17.0 min)

2.5貯存穩(wěn)定性

芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻土壤、稻田水、植株、糙米和稻殼中的殘留量與施藥后的取樣時(shí)間之間的穩(wěn)定性見(jiàn)圖3,由圖3可知,水稻殘留樣品中芐嘧磺隆和仲丁靈的殘留量隨貯存時(shí)間無(wú)明顯變化,-18℃與-20℃差異不顯著,經(jīng)數(shù)據(jù)分析得出兩者在此條件下貯存,分解率均小于5%,符合FAO/WHO聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的等同認(rèn)定要求。由此證明,兩者在低溫冷凍貯存過(guò)程中穩(wěn)定性良好。

表1　芐嘧磺隆和仲丁靈在不同水稻樣品中的添加回收率(n=5)Table 1　Recoveries of bensulfuron-methyl and butralin in different matrix(n=5)

圖3　芐嘧磺隆和仲丁靈的貯存穩(wěn)定性Fig.3　Storage stability of bensulfuron-methyl and butralin

3　結(jié)論與討論

本文建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定水稻樣品中芐嘧磺隆和仲丁靈兩種藥物殘留的分析方法。根據(jù)相似相溶原理,采用甲醇、二氯甲烷、乙腈、丙酮和乙酸乙酯的溶液作為水稻樣品的提取液,結(jié)果發(fā)現(xiàn),二氯甲烷提取土壤樣品時(shí),會(huì)出現(xiàn)土壤凝結(jié)現(xiàn)象,提取效果不好。丙酮提取植株后葉綠素等雜質(zhì)峰較多。甲醇和乙酸乙酯做提取溶劑時(shí)添加回收率較乙腈低,故最終選擇乙腈作為提取溶劑。分別采用上述溶劑的混合溶液作為水稻樣品的淋洗液,當(dāng)選用二氯甲烷/甲醇=7/3(V/V)時(shí),提取效果好,回收率較高,較穩(wěn)定。由于植株中色素等雜質(zhì)較多,而中性氧化鋁對(duì)于色素的吸附優(yōu)于弗羅里硅土,且該方法回收率達(dá)到農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求,故選擇中性氧化鋁柱層析凈化植株樣品。

其次,比較了-18℃和-20℃下芐嘧磺隆和仲丁靈在水稻樣品中的貯存穩(wěn)定性,樣品貯存90 d后農(nóng)藥穩(wěn)定性好,分解率均小于5%,兩個(gè)溫度差異不顯著,符合FAO/WHO聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的等同認(rèn)定要求。

綜上所述,本方法前處理簡(jiǎn)便快速、凈化效果好,芐嘧磺隆和仲丁靈在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好、檢測(cè)靈敏可靠,水稻樣品中的芐嘧磺隆和仲丁靈在低溫(-18℃和-20℃)冷凍條件下貯存穩(wěn)定性良好。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Storage stability of bensulfuron-methyl and butralin in rice samples using HPLC

Gu Yan,Liang Shuang,Hou Zhiguang,Zhao Xiaofeng,Wang Xinhong,Lu Zhongbin

(College of Resource and Environment, Jilin Agricultural University, Changchun130118, China)

A method has been developed for determining bensulfuron-methyl and butralin residues in rice samples by high performance chromatography (HPLC), and the storage stability of different test samples under different conditions (-18℃ and -20℃) were also investigated. The results showed that the peak area of bensulfuron-methyl and butralin are positively correlated to their concentration with correlation coefficients of 0.999 7 and 0.999 9, respectively. The relative standard deviations for bensulfuron-methyl detection were 0.5%-12.0%, and the average recovery rates were 77.2%—104.6%. The relative standard deviations for butralin detection were 0.8%—7.6%, and the average recovery rates were 73.0%—106.4%. Both bensulfuron-methyl and butralin had good storage stability and their degradation rates were both less than 5% in rice matrix during 90 days storage period.

bensulfuron-methyl;butralin;rice;HPLC;storage stability

2014-11-27

2015-02-03

農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥殘留試驗(yàn)項(xiàng)目(2014NCJ09)

E-mail:luzong1979@aliyun.com

S 451.2

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.028