徐雨靜，趙瑞芝，胡巧紅（.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州50006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州50405；3.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東廣州50006）

莪術(shù)對(duì)甲氨蝶呤在正常和氣滯血瘀大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

徐雨靜1，趙瑞芝2，3，胡巧紅1
（1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510405；3.廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院，廣東廣州510006）

目的探討莪術(shù)對(duì)正常和氣滯血瘀大鼠體內(nèi)甲氨蝶呤（MTX）藥動(dòng)學(xué)的影響，為臨床合理用藥提供依據(jù)。方法采用束縛和冰水浴2周構(gòu)建大鼠氣滯血瘀模型。將正常大鼠和氣滯血瘀大鼠各分成單用組（MTX 5.17 mg/kg）和聯(lián)合用藥組（MTX 5.17 mg/kg，醋莪術(shù)0.93 g/kg），灌胃給藥，于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼眶靜脈叢采血500 μL/次，固相萃取（SPE）法處理血漿后用HPLC法進(jìn)行分析，DAS2.0軟件非隔室模型估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果除Tmax外，正常組與模型組主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；聯(lián)合用藥組與單用組比較，AUC0-t、AUC0-∞、Cmax均表現(xiàn)出增大趨勢(shì)。結(jié)論 血瘀模型對(duì)甲氨蝶呤藥動(dòng)學(xué)無(wú)顯著影響；模型和正常情況下，莪術(shù)均可促進(jìn)MTX吸收，兩者合用時(shí)應(yīng)減少M(fèi)TX劑量并關(guān)注MTX毒副反應(yīng)。

甲氨蝶呤；莪術(shù)；藥動(dòng)學(xué)；氣滯血瘀

甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是一種抗葉酸類(lèi)抗腫瘤藥物，可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞增生，破壞絨毛，使胚胎停止發(fā)育、壞死脫落最終吸收，被認(rèn)為是治療異位妊娠最常用和有效的藥物［1］。中醫(yī)理論認(rèn)為妊娠屬于少腹瘀血證。莪術(shù)性溫味辛，具有破血行氣、消積止痛的功能。近幾年來(lái)，臨床有應(yīng)用莪術(shù)結(jié)合MTX治療異位妊娠的報(bào)道［2］，而莪術(shù)對(duì)MTX體內(nèi)過(guò)程的影響尚不清楚。研究表明，疾病狀態(tài)會(huì)改變藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過(guò)程，進(jìn)而影響藥效和毒性［3］。本文擬考察莪術(shù)對(duì)MTX在正常和氣滯血瘀大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的影響，探討其藥效增強(qiáng)作用機(jī)制，為臨床合理用藥提供參考。

1　儀器與材料

1.1儀器

Agilent1200高效液相色譜儀，配VWB檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）；VG3渦旋震蕩儀（德國(guó)IKA公司）；G20型臺(tái)式離心機(jī)（河北省安新縣白洋離心機(jī)廠(chǎng)）；Milli-Q型純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；LBYXC40全自動(dòng)動(dòng)態(tài)血沉測(cè)定儀（廣州中利醫(yī)療儀器科技有限公司）；SPE萃取柱（Waters公司Sep-Pak Vac 1cc，批號(hào):039035127A）。

1.2試藥

醋莪術(shù)（廣西，批號(hào):150200561，康美藥業(yè)有限公司）；MTX對(duì)照品（廣州綠百草生物科技有限公司，批號(hào):10038-201104）；甲氨蝶呤片（上海信誼藥廠(chǎng)有限公司，批號(hào):120306）；NaHCO3（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):20120327，分析純）；甲酸、甲醇均為色譜純，水為超純水。

1.3動(dòng)物

健康雄性SD大鼠24只，SPF級(jí)，體質(zhì)量（300± 20）g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào):00115397。

2　方法

2.1莪術(shù)提取液的制備

將醋莪術(shù)飲片搗碎，用水浸泡1 h后，加熱回流煎煮3次，濾過(guò)，合并濾液，將藥液濃縮后得莪術(shù)水煎液。

2.2樣品的處理

將血漿100 μL加到活化后的SPE萃取柱上，靜置吸附后，以水1.0 mL洗脫，棄去洗脫液，再以含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%甲酸的甲醇1.0 mL洗脫，EP管收集洗脫液。將收集的樣品置氮吹儀下吹干，用甲醇-0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）甲酸水 100 μL復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜后，取10 μL進(jìn)樣分析。

2.3樣品中MTX的測(cè)定

參照本實(shí)驗(yàn)室前期方法，應(yīng)用HPLC法測(cè)定樣品中的MTX［4］，色譜條件:Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬公司）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫（0～8 min，10∶90；8～10 min，60∶40；10 min，100∶0）；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為302 nm；柱溫為27℃；進(jìn)樣量為10 μL。在上述色譜條件下，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾MTX的測(cè)定。MTX在0.052～5.006 mg/L線(xiàn)性關(guān)系良好（r= 0.999 6），檢測(cè)限為0.052 mg/L，提取回收率68%～74%，日間、日內(nèi)精密度均小于5.9%，提取回收率為68%～74%。

2.4氣滯血瘀模型的建立

參照文獻(xiàn)［5］方法進(jìn)行建模:每日冰水浴8 min，大鼠固定器束縛2 h。隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，模型組出現(xiàn)爪尾部紫暗、大便稀、體質(zhì)量減輕、被毛無(wú)光澤等癥狀。造模2周后測(cè)定血黏度，模型組血黏度顯著升高，提示模型成功。

2.5藥動(dòng)學(xué)研究

將正常大鼠和模型大鼠各分為單用組和聯(lián)用組，每組6只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。單用組灌胃給予MTX（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaHCO3溶液溶解）5.17 mg/kg，聯(lián)用組灌胃MTX 5.17 mg/kg和莪術(shù)提取液0.93 g/kg，灌胃容積為10 mL/kg。灌胃后用乙醚麻醉，于給藥后0.17、0.33、0.67、1、2、4、6、8、9 h眼眶靜脈叢采血500 μL，置于抗凝管中，所得血樣靜置1 h后，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，按“2.2”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法分析。

3　結(jié)果

各組MTX的平均血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。用DAS2.1.1藥動(dòng)學(xué)軟件，非隔室模型估算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見(jiàn)表 1。組間比較用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)（SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件）。由表1可見(jiàn)，MTX藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與Kuroda等［6］所描述的一致，表現(xiàn)為吸收迅速，并迅速分布、消除。正常組中，與單用組相比，聯(lián)用組血漿 MTX的 AUC0-t、Cmax顯著升高（P＜0.05），Cmax、AUC0-t、AUC0-∞分別增加 64.8%、28.1%、30.4%，CL降低16.4%。模型組中，聯(lián)合用藥組顯示與正常組相同的趨勢(shì)，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞分別比單用組增加21.3%、22.0%、33.2%，CL則降低34.7%，Tmax提前79.9%。模型組與正常組比較，達(dá)峰時(shí)間明顯提前，其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。無(wú)論是正常組還是模型組，聯(lián)合用藥組均表現(xiàn)出AUC0-t、AUC0-∞、Cmax增加，Tmax推遲的趨勢(shì)，提示莪術(shù)可提高甲氨蝶呤的生物利用度。

圖1　大鼠體內(nèi)MTX的平均血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線(xiàn)Figure 1 Drug concentration-time profiles of methotrexate after oral administration with methotrexate alone or combined with Curcumae Rhizoma（n=6）

表1　MTX的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1 Pharmacokinetic parameters of methotrexate，n=6）

表1　MTX的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 1 Pharmacokinetic parameters of methotrexate，n=6）

單用組中，模型組與正常組比較:*P＜0.05；正常組中，聯(lián)用組與單用組比較:#P＜0.05。

參數(shù)　　正常-單用　　正常-聯(lián)用　　模型-單用　　模型-聯(lián)用AUC0-t/（mg·h·L-1）　0.654±0.182　0.838±0.099#　0.691±0.044　0.843±0.110 AUC0-∞/（mg·h·L-1）　1.887±0.826　2.460±1.240　2.413±1.847　3.213±1.488 MRT0-t/h　4.132±0.140　3.902±0.409　4.163±0.292　4.04±0.398 t1/2/h　14.317±12.59　13.705±7.245　15.932±13.349　16.4392±7.304 Cmax/（mg·L-1）　0.126±0.037　0.201±0.043#　0.150±0.050　0.182±0.057 CL/（L·h·kg-1）　3.104±1.025　2.500±1.051　3.001±1.462　1.958±0.986 Tmax/h　0.417±0.037　0.639±0.267　0.278±0.0857*　0.5±0.183

4　討論

臨床研究顯示，MTX聯(lián)用活血化瘀中藥治療異位妊娠的療效與MTX聯(lián)用米非司酮相當(dāng)，但在包塊吸收、縮短住院時(shí)間、減小毒副反應(yīng)等方面更優(yōu)［7］，然而其作用機(jī)制尚不清楚。莪術(shù)為破血藥，中醫(yī)理論認(rèn)為破血藥具有破積堅(jiān)攻的效果，為婦科常用藥。本文考察了莪術(shù)對(duì)MTX在正常和氣滯血瘀大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的影響，結(jié)果顯示莪術(shù)可提高M(jìn)TX的生物利用度，從而提高療效，這可能是縮短住院時(shí)間的原因。MTX毒性較大，生物利用度提高的同時(shí)有可能導(dǎo)致毒性增強(qiáng)，提示臨床活血化瘀中藥聯(lián)合應(yīng)用MTX時(shí)應(yīng)密切觀(guān)察其毒副反應(yīng)。

據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道，機(jī)體微環(huán)境的改變常通過(guò)影響藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)而影響藥物的體內(nèi)過(guò)程。本文中血瘀模型對(duì)MTX藥動(dòng)學(xué)影響主要表現(xiàn)為T(mén)max提前，AUC0-t、Cmax均有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示血瘀狀態(tài)對(duì)MTX藥動(dòng)學(xué)影響不明顯。然而，血液中的藥動(dòng)學(xué)行為是機(jī)體不同臟器總體處理結(jié)果的綜合，尚不能反映MTX在臟器分布的變化，因此血瘀模型是否影響MTX臟器分布并進(jìn)而影響其藥效和毒性，還有待進(jìn)一步探討。

［1］曹澤毅.中華婦產(chǎn)科學(xué)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:1447.

［2］王風(fēng)梅，王宏霞，王桂忠.活血化瘀消癥湯結(jié)合MTX治療異位妊娠的護(hù)理與療效觀(guān)察［J］.中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（23）:317-318.

［3］鞏仔鵬，陳穎，張瑞杰，等.疾病狀態(tài)下的中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2015，40（2）:169-173.

［4］李楊，趙亞，盧傳堅(jiān)，等.銀屑靈2號(hào)方對(duì)甲氨蝶呤大鼠體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2015，26（5）:655-657.

［5］王婷婷，賈乘，陳宇，等.大鼠氣滯血瘀證模型的建立及影響因素分析［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37（11）:1629-1633.

［6］KURODA T，NAMBA K，TORIMARU T，et al.Species differences in oral bioavailability of methotrexate between rats and monkeys［J］.Biol Pharm Bull，2000，23（3）:334-338.

［7］張季青，陳月玲，高麗萍，等.甲氨蝶呤聯(lián)合活血化瘀中藥治療異位妊娠40例［J］.福建中醫(yī)藥，2009，40（2）: 11-12.

［8］薛春苗，張冰，李連珍，等.虛寒狀態(tài)下藥物代謝酶CYP3A和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp變化的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37（9）:602-605.

（責(zé)任編輯：陳翔）

Effect of Curcumae Rhizoma on the pharmacokinetics of methotrexate in normal and blood stasis rats.

XU Yujing1，ZHAO Ruizhi2，3，HU Qiaohong1
（1.School of Parmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.The Second Clinical College，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.GuangdongProvincial Academy of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the effect of Curcumae Rhizoma on the pharmacokinetics of methotrexate in normal and blood stasis rats to provide a basis for clinical rational use of drugs.Methods The method of bondage and ice water bath were applied to establish the blood stasis rat model.The normal and blood stasis rats were divided into methotrexate group（5.17 mg/kg）and combination group（methotrexate 5.17 mg/kg combined with Curcumae Rhizoma 0.93 g/kg）respectively.After intragastric administration，the blood was collected from orbit venousplexus at different interval.Serum samples were prepared by solid phase extraction（SPE）method，and the drug concentration was determined by HPLC method.The data were analyzed by pharmacokinetic software DAS（2.1）with non-compartment modal.Results Except for Tmax，other pharmacokinetic parameters of the normal groups had no statistical difference with model groups. Compared with the methotrexate groups，AUC0-t、AUC0-∞、Cmaxwas increased in combination groups. Conclusion Blood stasis model had no significant effects on the pharmacokinetics parameter of methotrexate.Curcumae Rhizoma could promote the absorption of methotrexate both in normal and model state，indicating that the dose of methotrexate should be reduced when combined with Curcumae Rhizoma. Key words:methotrexate；Curcumae Rhizoma；pharmacokinetics；blood stasis

R969.5

A

1006-8783（2016）04-0403-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016052401

2016-05-24

廣東省中醫(yī)院資助項(xiàng)目（YK2013B1N11）

徐雨靜（1992—），女，2014級(jí)碩士研究生，Email:yujing0715@126.com；通信作者:胡巧紅（1969—），女，博士，教授，從事微粒給藥系統(tǒng)、藥物新劑型與新技術(shù)研究，Email:hu_qiaohong@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-08 9:24 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160708.0924.002.html