劉飛，肖鳳霞，李宇邦，宋小欣，陳康，闞海峰，3，葉燕瑩，劉慧（.廣東和翔制藥有限公司，廣東 廣州 50385；.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州50006；3.廣東省中醫(yī)院二沙島分院，廣東廣州5005）

均勻設(shè)計法優(yōu)選巴戟天鹽制工藝及鹽制前后5種糖含量比較研究

劉飛1，肖鳳霞2，李宇邦2，宋小欣2，陳康2，闞海峰2，3，葉燕瑩1，劉慧2
（1.廣東和翔制藥有限公司，廣東 廣州 510385；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；3.廣東省中醫(yī)院二沙島分院，廣東廣州510105）

目的優(yōu)選巴戟天鹽制工藝，比較巴戟天鹽制前后果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖5種糖質(zhì)量分數(shù)的差異。方法以耐斯糖質(zhì)量分數(shù)為指標(biāo)，采用均勻設(shè)計試驗法，優(yōu)選巴戟天鹽制工藝；采用HPLC-ELSD法測定巴戟天鹽制前后5種糖的質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果最佳巴戟天鹽制工藝如下:每100 g巴戟天飲片加食鹽水120 mL（含食鹽2 g），浸潤時間為8.5 h，蒸制時間為5.5 h；巴戟天鹽制后果糖質(zhì)量分數(shù)顯著增加（P＜0.05），蔗糖、耐斯糖、蔗果五糖質(zhì)量分數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。結(jié)論 均勻設(shè)計法所得的優(yōu)化工藝可靠、穩(wěn)定，可用于巴戟天鹽制工藝的優(yōu)選。

巴戟天；工藝優(yōu)選；均勻設(shè)計法

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根，味甘、辛，性微溫，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的功效，用于陽痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、風(fēng)濕痹痛等癥。2015年版《中國藥典》收載了巴戟肉、鹽巴戟天和制巴戟天3種炮制方法［1］，其中鹽巴戟天制后專入腎經(jīng)，溫而不燥，以補腎助陽為主，作用緩和，久服多服無傷陰之弊［2］。

近年來，為探索炮制工藝對中藥藥效物質(zhì)的影響，學(xué)者們開展了巴戟天炮制前后糖類和蒽醌類化合物的變化研究，采用單因素或正交設(shè)計試驗等方法，從蒽醌類化合物含量或糖類指紋圖譜變化等不同角度進行了比較分析［3-6］，證明炮制前后巴戟天中糖類發(fā)生了變化，對闡明其炮制機理有較高的參考價值。有研究表明，鹽制對耐斯糖等多種寡糖類指紋圖譜均有影響［7-9］，但未見同時對巴戟天炮制前后糖類成分含量變化的研究報道。2015年版《中國藥典》（四部）0213炮制通則中關(guān)于鹽巴戟天炮制工藝的加鹽水量、浸潤時間、蒸制時間等相關(guān)參數(shù)均未明確。因此，本文參照2015年版《中國藥典》將耐斯糖的質(zhì)量分數(shù)選作為炮制工藝的評價指標(biāo)，采用均勻設(shè)計法并結(jié)合耐斯糖等5種糖的質(zhì)量分數(shù)變化情況，探討鹽巴戟天蒸制工藝，明確相關(guān)工藝參數(shù)，對于規(guī)范巴戟天的飲片炮制有重要意義。

1　儀器與試藥

Waters E2695型高效液相色譜儀（Waters2424蒸發(fā)光檢測器，Empower3工作站，美國Waters公司）；DHG型鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；XS225A型分析天平（德國 Sartorius公司）；JYC-21ES10-X電磁爐（山東九陽股份有限公司）。

10批巴戟天經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院林勵研究員鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda Officinalis How.的干燥根，按2015年版《中國藥典》要求，除去雜質(zhì)，去掉木心及須根，切段至4～5 cm，干燥，來源見表1。果糖（美國Amresco公司，批號F20130516）；蔗糖（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號2CO60717）；耐斯糖、蔗果三糖、蔗果五糖（上海西寶生物有限公司，批號:AWG0714）；食鹽（江西中鹽新干鹽化有限公司，批號:C79328456）；甲醇為色譜純，水為超純水。

表1　10批巴戟天飲片的來源信息表Table 1 The source information of 10 batches of M.officinalis samples

2　方法與結(jié)果

2.1因素水平設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，影響巴戟天耐斯糖質(zhì)量分數(shù)的工藝因素有食鹽加水量（含食鹽2 g）（X1）、浸潤時間（X2）、蒸制時間（X3），每個因素設(shè)計6個水平，應(yīng)用U6（63）均勻設(shè)計表安排試驗，因素水平見表2。

表2　U6（63）均勻設(shè)計試驗的因素與水平表Table 2 Factors and levels of U6（63）uniform design

2.2巴戟天鹽制工藝

取巴戟天飲片（S9）6份，各100 g，分別加入相應(yīng)體積的食鹽水（含食鹽2 g），按規(guī)定時間浸潤后，置于蒸鍋中加熱蒸制，達到規(guī)定時間后取出，放涼，60℃下干燥5 h，備用。

2.3糖類質(zhì)量分數(shù)測定［1］

2.3.1對照品溶液的制備 分別取果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖對照品適量，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，用甲醇-水（體積比3∶97）定容，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為2.176、1.030、1.052、1.010、0.670 mg/mL的混合溶液，作為混合對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備 取巴戟天飲片，粉碎（過三號篩），取0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-水（體積比3∶97）50 mL，稱定質(zhì)量，沸水中加熱30 min，取出，冷卻，稱定質(zhì)量，用甲醇-水（體積比3∶97）補足減失的質(zhì)量，搖勻，放置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3色譜條件 色譜柱:Accusil C18柱（250 mm× 4.6 mm，10 μm）；流動相:甲醇-水（體積比3∶97）；柱溫:30℃；流速:0.8 mL/min；進樣量:10 μL；漂移管溫度:80℃；霧化溫度:50℃:N2壓力:3.5 MPa；增益:4。分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別按上述條件進樣測定，色譜圖見圖1。

圖1　混合對照品溶液（A）、巴戟天飲片（B）、鹽巴戟天（C）的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed references（A），M.officinalis（B），salt M.officinalis（C）

2.3.4線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.3.1”項下條件進樣，測定峰面積，以進樣量的自然對數(shù)值（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)，進行對數(shù)線性回歸處理，得到回歸方程，見表3。

結(jié)果表明，果糖進樣量在4.35～43.52 μg范圍內(nèi)，蔗糖進樣量在2.06～20.60 μg范圍內(nèi)，蔗果三糖進樣量在2.10～21.04 μg范圍內(nèi)，耐斯糖進樣量在2.02～20.20 μg范圍內(nèi)，蔗果五糖進樣量在1.34～13.40 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

表3　5種糖類成分的線性回歸方程Table 3 Linear regression equations of 5 kinds of saccharides

2.3.5精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.3.3”項下條件重復(fù)進樣5次，測定5種寡糖類成分的峰面積，結(jié)果表明，果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖峰面積的 RSD值分別為0.96%、1.06%、0.92%、0.90%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性試驗 取巴戟天飲片（S1）約0.5 g，精密稱定，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12、24 h按照“2.3.3”項下色譜條件進樣6次，測定峰面積。結(jié)果果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖峰面積的RSD值分別為1.12%、1.50%、1.11%、1.44%、1.62%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7重復(fù)性試驗 取巴戟天飲片（S1）約0.5 g，精密稱定，平行操作5份，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項下色譜條件測定峰面積，結(jié)果果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖峰面積的 RSD值分別為 1.10%、1.34%、0.98%、1.51%、1.73%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8加樣回收率試驗 取已知質(zhì)量分數(shù)（果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖分別為65.80、183.60、65.17、93.85、94.66 mg/g）的S1號樣品約0.25 g，共6份，精密稱定，分別準(zhǔn)確加入新配制的果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖質(zhì)量濃度分別為3.300、9.550、3.251、4.505、4.216 mg/mL的對照品溶液5 mL，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項下條件進樣，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果見表4。

2.3.9樣品測定 取巴戟天粉末（三號篩），約0.5 g，精密稱定，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項下色譜條件測定峰面積，采用外標(biāo)法計算耐斯糖質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表5。

表4　巴戟天中5種糖類成分的加樣回收率試驗Table 4 Recovery results of 5 saccharides in M.officinalis（n=6）

表5　U6（63）均勻設(shè)計試驗結(jié)果Table 5 Results of U6（63）uniform design

2.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行多元線性回歸分析，以各因素為自變量，耐斯糖質(zhì)量分數(shù)為因變量，得到回歸方程Y=7.184+0.011X1+0.238X2-0.952X3，P＜0.05。根據(jù)方程，得到巴戟天鹽制工藝的影響因素為蒸制時間＞浸潤時間＞食鹽水量。確定巴戟天最佳鹽制工藝為每100 g巴戟天飲片加食鹽水120 mL（含食鹽2 g），浸潤時間為8.5 h，蒸制時間為5.5 h。

2.5驗證試驗

取巴戟天飲片（S9）100 g，根據(jù)以上確定的最佳鹽制工藝條件進行驗證試驗，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項下條件進樣，測定峰面積，計算耐斯糖質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果測得耐斯糖的平均質(zhì)量分數(shù)為5.004%（RSD=0.67%，n=3），與預(yù)期值相近，表明該鹽制工藝穩(wěn)定、可靠。

2.6 巴戟天鹽制前后5種糖的質(zhì)量分數(shù)測定

取巴戟天飲片（S1～S10）和鹽巴戟天（Z1～Z10）各0.5 g，精密稱定，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.3”項下條件進樣，測定峰面積，計算5種糖的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表6。

表6　生巴戟天與鹽巴戟天中糖類成分測定結(jié)果Table 6 The content of saccharides in M.officinalis and salt M.Officinalis　w/%

對表中果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖的質(zhì)量分數(shù)分別使用SPSS19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行配對t檢驗（給定顯著性水平α=0.05），結(jié)果表明巴戟天鹽制后，果糖、蔗糖、耐斯糖、蔗果五糖的成分發(fā)生了顯著變化（P＜0.05）；炮制前后耐斯糖質(zhì)量分數(shù)均高于2.0%，符合《中國藥典》要求。

3　討論

均勻試驗法具有簡便、高效的特點，與正交試驗法相比，能夠大大減少試驗次數(shù)，結(jié)合回歸分析，建立的回歸方程精確、可靠，運用該方法建立的鹽制工藝合理科學(xué)，擺脫傳統(tǒng)憑經(jīng)驗與火候炮制的主觀性，為實際生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

糖類作為巴戟天的主要活性成分之一，其含量高低對巴戟天鹽制前后的藥效變化產(chǎn)生重要影響［8］。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，巴戟天鹽制前后，除耐斯糖質(zhì)量分數(shù)外，其他糖類成分也發(fā)生了顯著變化，因此進一步對巴戟天鹽制前后糖類成分變化作比較，以初步探究鹽巴戟天炮制機理。巴戟天鹽制后專入腎經(jīng)，溫而不燥，以補腎助陽為主，其炮制機理可能與糖類含量變化有一定聯(lián)系。在本研究中，巴戟天鹽制前后糖類質(zhì)量分數(shù)發(fā)生了顯著變化，鹽巴戟天中果糖質(zhì)量分數(shù)顯著增大，蔗糖、耐斯糖、蔗果五糖成分的質(zhì)量分數(shù)顯著減小，與文獻［9-10］結(jié)果一致，初步推測在加熱蒸制過程中，巴戟天的糖類成分轉(zhuǎn)化為果糖等成分，對緩和巴戟天燥性起到一定作用，為進一步探討巴戟天鹽制機理提供依據(jù)。

本研究對巴戟天炮制前后的果糖、蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖5種糖進行了比較分析，而在其他研究中亦發(fā)現(xiàn)鹽制對巴戟天的其他糖類成分、水晶蘭苷、蒽醌類等成分質(zhì)量分數(shù)也有影響［5，11-12］，因此，在今后研究中將以此為基礎(chǔ)，結(jié)合藥效學(xué)進行系統(tǒng)分析比較，為探討中藥傳統(tǒng)炮制機理繼續(xù)努力。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2015年版一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:81-82.

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（責(zé)任編輯：陳翔）

The optimization of the salt processing procedure of Morinda officinalis How. by uniform design and the comparison of 5 kinds of saccharides′s content

LIU Fei1，XIAO Fengxia2，LI Yubang2，SONG Xiaoxin2，CHEN Kang2，KAN Haifeng2，3，YE Yanying1，LIU Hui2
（1.Guangdong Hexiang Pharmaceutical Co.，LTD，Guangzhou 510385，China；2.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；3.Ershadao Section of Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510105，China）

Objective To optimize the processing procedure of salted Morinda officinalis，and to compare the content of saccharides in different process.Methods Nystose as evaluation index，uniform design was used to optimize the processing procedure of salted Morinda officinalis.High performance liquid chromatography was used to determine the content of saccharides in different process.Results The optimal process was as follows:100 g Morinda officinalis How.steamed 5.5 h after 8.5 h infiltrated by 120 mL salt water（with 2 g salt）.The content of fructose was significantly increased（P＜0.05），and the content of sucrose，nystose，1F-fructofuranosylnystose was significantly decreased after processing with salt water（P＜0.05）.Conclusion The optimized technology is reliable and stable to be suitable for the processing procedure of salted Morinda officinalis.

Morinda officinalis How.；process optimization；uniform design

R282.2

A

1006-8783（2016）04-0415-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050903

2016-05-09

廣州市荔灣區(qū)科技計劃項目（20143116025）

劉飛（1981—），男，本科，制藥工程師，主要從事中藥飲片生產(chǎn)及質(zhì)量管理、中藥炮制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Email:6784345@qq.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-011 14:52 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1452.005.html