張丹青，丁秀云，李 婉，霍貴成（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

兩株嗜酸乳桿菌體外降解粘蛋白能力的研究

張丹青，丁秀云，李 婉，霍貴成*
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150030）

以從人體腸道中篩選，并經(jīng)16S rDNA鑒定的2株嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.0902為研究對(duì)象，體外評(píng)估兩株嗜酸乳桿菌降解粘蛋白的能力。體外粘蛋白降解能力的評(píng)估主要是通過液體培養(yǎng)法、SDS-PAGE蛋白分析以及平板降解實(shí)驗(yàn)三部分進(jìn)行。受試菌株在含粘蛋白的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不良，糞便菌群生長(zhǎng)良好；SDS-PAGE粘蛋白殘留分析檢測(cè)以及平板粘蛋白溶圈檢測(cè)表明受試菌株無粘蛋白降解活性，而糞便菌群產(chǎn)生陽性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩株嗜酸乳桿菌無體外降解粘蛋白活性。

嗜酸乳桿菌，粘蛋白降解，安全性

人類胃腸道表面覆蓋著一層保護(hù)性粘液，粘液主要由水（95%）、高分子量的粘蛋白（5%）以及極少量的電解質(zhì)、脂質(zhì)等構(gòu)成［1-2］。粘液層在粘膜屏障系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，能夠保護(hù)胃腸道內(nèi)壁免受病原體、毒素以及機(jī)械性的損傷［3］。據(jù)報(bào)道，粘液可以作為細(xì)菌生長(zhǎng)的養(yǎng)分來源，因此，細(xì)菌能夠生存、繁殖、定植于黏液層是其可以耐受胃腸道環(huán)境的重要優(yōu)勢(shì)［4］。

乳酸菌具有調(diào)整腸道微生物菌群平衡、緩解乳糖不耐受、降低膽固醇水平、抑制腸道不良微生物增殖等功能。然而，Ruas-Madiedo［5］研究發(fā)現(xiàn)一些兩岐雙岐桿菌、短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌菌株具有粘蛋白降解活性并且存在具有編碼與粘蛋白降解相關(guān)的酶的基因。Ruseler-van等［6］認(rèn)為消除粘液層可能會(huì)增加粘附在胃腸表面細(xì)菌的數(shù)量，也可能促進(jìn)正常的腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)移到其他腸道組織中，甚至導(dǎo)致一些致病菌轉(zhuǎn)移到其他組織。因此，粘蛋白降解活性被認(rèn)為是腸腔內(nèi)細(xì)菌是否具有潛在致病性和毒性的一個(gè)重要指標(biāo)，而粘蛋白降解實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)被推薦為益生菌菌株安全性評(píng)估的一項(xiàng)內(nèi)容［7］。本文對(duì)兩株益生嗜酸乳桿菌體外降解粘蛋白的能力進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)一步評(píng)估其潛在致病性及毒性，為乳酸菌安全性評(píng)價(jià)方面的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.0902 均來自乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；糞便菌群 取自健康

成年男性的新鮮糞便（F），滅菌后的糞便菌群（HF）；蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星公司；酵母粉、胰蛋白胨 OXOID公司；瓊脂粉 Solarbio公司；硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；葡萄糖、Tween-80、磷酸氫二鉀、葡萄糖 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BHI肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；胃粘蛋白、氨基黑10B 上海源葉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（TRIS）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、β-巰基乙醇、過硫酸銨、溴酚藍(lán) Biotopped公司。

DELTA 320pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；HVE-50全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本日立；SectrumLab54紫外分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海-恒科技有限公司；VD-1320潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳儀BIO-RAD（伯樂）中國(guó)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃粘蛋白純化 在Miller等［8］對(duì)粘蛋白純化方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。稱取10 g胃粘蛋白于500 mL 含0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液和幾滴甲苯的0.1 mol/L氯化鈉溶液中，室溫下攪拌24 h。1 h后用2 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)懸液的pH為7.2。10000 r/min、4℃離心后，取上清液冷卻至（0±2）℃，添加冰乙醇至終濃度為60%（v/v）。將得到的沉淀溶解于0.1 mol/L氯化鈉溶液中，再用冰乙醇沉淀兩次。粘蛋白沉淀顆粒用乙醇洗滌一次，然后溶解于4 L蒸餾水中并過濾，滲出液凍干后備用。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（B）、含0.3%胃粘蛋白的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（B+M）、添加1%葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（B+G）以及含有0.3%胃粘蛋白和1%葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（B+M+G）的配制參見文獻(xiàn)［9］。

1.2.3 菌種活化 KLDS 1.0901和KLDS 1.0902在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。F和HF則在BHI液體培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.2.4 粘蛋白降解—液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 取24 h培養(yǎng)物，分別以1%的量接種至B、B+M、B+G以及B+M+G，37℃培養(yǎng)48 h。測(cè)定培養(yǎng)液pH以及600 nm處的吸光度，每個(gè)樣品做三組平行，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

1.2.5 SDS-PAGE粘蛋白殘留實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 電泳樣品的制備 1.2.4中得到的B+M培養(yǎng)物用于粘蛋白殘留分析。取48 h培養(yǎng)液10 mL，

10000 r/min、4℃離心30 min，吸取上清至干凈離心管中，加入15 mL 99%的冰乙醇（冷凍的），10000 r/min 4℃離心30 min，棄去上清，得到的沉淀用6 mL 0.1 mol/L的NaCl溶液溶解。再加入15 mL 99%的冰乙醇，10000 r/min、4℃離心30 min，得沉淀，用0.5 mL 的10 mmol/L Tris-HCl緩沖液溶解，得到蛋白質(zhì)樣品；將蛋白質(zhì)樣品與等體積的2×SDS-PAGE凝膠電泳上樣緩沖液直接混合，電泳前沸水浴3～5 min，再置于冰浴3 min。

1.2.5.2 SDS-PAGE凝膠電泳 分別配制濃度為12.5%的分離膠以及濃度為5%的濃縮膠；上樣量為10 μL；電泳時(shí)，濃縮膠電壓為80 V，30 min；分離膠電壓為120 V，1 h。

1.2.5.3 固定 用異丙醇、乙酸、水（體積比為5∶2∶9）配制而成的固定液固定8 h。

1.2.5.4 染色 取0.75 g考馬斯亮藍(lán)R-250于500 mL脫色液，過濾，染色2～3 h。

1.2.5.5 脫色 用甲醇、乙酸、水（體積比為227∶37∶236）配制成的脫色液進(jìn)行脫色至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，觀察蛋白質(zhì)變化情況。

1.2.6 粘蛋白降解平板實(shí)驗(yàn) 取10 μL 24 h的細(xì)菌培養(yǎng)物分別接種至固體培養(yǎng)基表面（B+M、B+M+G），37℃厭氧培養(yǎng)72 h后，用含0.1%氨基黑10B的3.5 mol/L的醋酸染色30 min，之后用1.2 mol/L的醋酸洗凈，觀察接種區(qū)域周圍的變化情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 受試菌株在液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況

表1分別列出了KLDS1.0901、KLDS1.0902、F及HF在四種培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后測(cè)得的OD600 nm和pH，反應(yīng)出實(shí)驗(yàn)菌株在相應(yīng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況。

從表1中可以看出，HF在四種培養(yǎng)基中的兩項(xiàng)指標(biāo)基本無變化，說明無細(xì)菌生長(zhǎng)。兩株嗜酸乳桿菌在B+G、B+M+G中的OD600 nm明顯高于B以及B+M，而F則在四種培養(yǎng)基中均表現(xiàn)較高的OD600 nm。此外，嗜酸乳桿菌在含B+M中的OD600 nm與B并無明顯差異。培養(yǎng)基pH的變化在一定程度上與OD600 nm的變化趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)，受試菌株在B和B+M中的pH基本無差異，且高于B+G以及B+M+G。兩株嗜酸乳桿菌在相同培養(yǎng)基中的OD600 nm和pH相近。

2.2 SDS-PAGE粘蛋白殘留實(shí)驗(yàn)

SDS-PAGE法測(cè)定培養(yǎng)基中粘蛋白殘留結(jié)果如圖1所示，考馬斯亮藍(lán)染色用于分析蛋白殘留［10］。由圖1可以觀察到，在考馬斯亮藍(lán)染色方法下，F(xiàn)樣品殘留物有不同大小的片段出現(xiàn)，可以判定粘蛋白分子

被降解，即F粘蛋白降解陽性，而兩株嗜酸乳桿菌以及HF樣品均無降解片段出現(xiàn)，即粘蛋白降解陰性。在此項(xiàng)測(cè)試中，與F相比，兩株嗜酸乳桿菌均無粘蛋白降解活性。

表1 受試菌株48 h培養(yǎng)后的OD600 nm和pHTable1 The OD600 nmand pH of testing strains cultivated over 48 h

圖1 SDS-PAGE分析菌液中粘蛋白殘留Fig.1 SDS-PAGE analysis of mucin residues in basal medium with mucin cultures incubated with bacterial strains

2.3 粘蛋白降解平板實(shí)驗(yàn)分析

菌落周圍出現(xiàn)溶解圈則表明該菌具有粘蛋白降解活性。受試菌株粘蛋白降解平板實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖2所示，在B+M中，F(xiàn)生長(zhǎng)良好，形成較大菌落，且菌落周圍出現(xiàn)透明的溶解圈；HF不形成菌落且無溶解圈出現(xiàn)；菌株KLDS1.0901、KLDS1.0902生長(zhǎng)不良且無溶解圈（圖2a）。在B+M+G中，F(xiàn)生長(zhǎng)良好，形成較大菌落但周圍未出現(xiàn)溶解圈，這是由于在有葡萄糖存在的條件下，F(xiàn)優(yōu)先利用葡萄糖；菌株KLDS1.0901、KLDS1.0902的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于不添加葡萄糖的培養(yǎng)基，形成清晰的菌落但周圍無溶解圈出現(xiàn)（圖2b），這是由于乳酸菌可以利用葡萄糖進(jìn)行代謝活動(dòng)。

圖2 受試菌株平板粘蛋白降解圖Fig.2 Mucin degradation assay in agarose petri dish

3 結(jié)論

本研究通過三項(xiàng)測(cè)試評(píng)估了兩株嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.0902的體外粘蛋白降解活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該2株菌在體外環(huán)境下不能降解粘蛋白，但在胃腸道環(huán)境下是否具有粘蛋白降解活性還需要進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果與Zhou JS［11］，F(xiàn)ernández M F［9］，F(xiàn)umiaki等［12］對(duì)嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、動(dòng)物雙歧桿菌亞種的研究結(jié)果一致。這些研究結(jié)果表明，許多益生雙歧桿菌和乳酸菌可能沒有降解粘蛋白的能力。盡管雙歧桿菌屬的大多數(shù)長(zhǎng)雙歧桿菌以及假小鏈雙歧桿菌沒有粘蛋白降解活性，研究者們發(fā)現(xiàn)一些兩岐雙岐桿菌、短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌菌株不僅具有粘蛋白降解活性并且具有編碼與粘蛋白降解相關(guān)的酶的基因［5，13］。鑒于前人的研究成果，有必要將粘蛋白降解活性的評(píng)估納入為益生菌安全性評(píng)價(jià)的內(nèi)容之一。

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Study on mucin degradation activity of two strains of Lactobacillus acidophilus in vitro

ZHANG Dan-qing，DING Xiu-yun，LI Wan，HUO Gui-cheng*
（Northeast Agriculture University，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Harbin 150030，China）

In this study，the ability to degrade mucin of two strains of Lactobacillus acidophilus（KLDS1.0901 and KLDS1.0902）screened from the human intestine and identified by 16S rDNA in vitro was evaluated.Mucinolytic activity was examined using the following three tests：growth in liquid medium，SDS-PAGE analysis of degraded mucin residues，and degradation assay in Petri dish.The test strains fell to grow in the liquid medium containing mucin，while fecal sample grew well.In the SDS-PAGE analyses of mucin residues and observation of mucinolytic zone in agar plate，the two test strains also showed no mucin degradation activity，while fecal sample yielded positive results.The results demonstrated that strains tested were unable to degrade gastrointestinal mucin in vitro.

Lactobacillus acidophilus；mucin degradation；safety

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0155-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.023

2015－10－08

張丹青（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：a10090119@163.com。

*通訊作者：霍貴成（1958-），男，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail：gchuo58@126.com。

國(guó)家863項(xiàng)目（2011AA100902）。