袁海戀，施溯筠（延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉133002）

響應(yīng)面法優(yōu)化林蛙皮中透明質(zhì)酸的提取工藝

袁海戀，施溯筠*
（延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉133002）

以中國(guó)林蛙皮為原料，用透明質(zhì)酸提取得率作為衡量提取工藝的指標(biāo)。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在料液比1∶40（g/mL）的條件下，利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析法探索了雙酶（堿性蛋白酶+胰蛋白酶）水解的酶解溫度、酶解時(shí)間（h堿性蛋白酶=h胰蛋白酶）、加酶量（堿性蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶1）3個(gè)因素作為自變量及其交互作用對(duì)響應(yīng)值透明質(zhì)酸得率的影響，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，并確定最佳提取工藝條件為加酶量55000 U/g、酶解時(shí)間14 h、酶解溫度50℃，在此條件下，平均透明質(zhì)酸提取得率為27.6839 mg/g，葡萄糖醛酸的含量為13.8420 mg/g，轉(zhuǎn)化成百分含量為42.2%。說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化雙酶法提取林蛙皮透明質(zhì)酸條件準(zhǔn)確可行。

林蛙皮，透明質(zhì)酸，響應(yīng)面分析法，酶解提取

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，簡(jiǎn)稱HA）又名玻璃酸，是一種線性大分子黏多糖，存在于動(dòng)物的各種組織細(xì)胞間質(zhì)中，該物質(zhì)在1934年首次從牛眼玻璃體中分離出來(lái)［1］。早期用來(lái)提取HA的材料主要為牛玻璃體、臍帶、公雞雞冠等，但由于其獲取困難，使其生產(chǎn)成本增加，且近年來(lái)陸生生物不斷發(fā)生各種疫情，如禽流感、瘋牛病，使得利用這些生物組織為原料提取的HA在應(yīng)用中存在一定風(fēng)險(xiǎn)。因此研究利用相對(duì)安全的兩棲類生物組織作為提取HA的原料具有較大的實(shí)際價(jià)值。中國(guó)林蛙（Rana chensinensis David）是一種珍貴的兩棲類藥用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其中哈蟆油很早就收入中國(guó)藥典，在民間利用歷史悠久，有很高的藥用、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［2］。林蛙皮作為生產(chǎn)哈蟆油的副產(chǎn)品來(lái)源廣泛，成本較低；而且與豬皮中粗脂肪含量達(dá)到

10%相比［3］，林蛙皮中脂肪含量2.499%［4］明顯較少，這使得前期處理相對(duì)簡(jiǎn)單，降低了成本。

HA水溶液所形成凝膠的獨(dú)特網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和分子內(nèi)羥基氫鍵使其具有極好的保水性和流變特性，因而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化妝品等領(lǐng)域［5］。透明質(zhì)酸的提取方法一般采用中性鹽提取法和水提取法，但提取得率較低。目前，酶法提取因其高效性、溫和性等優(yōu)點(diǎn)廣泛使用。因此，本實(shí)驗(yàn)以林蛙皮為原料，對(duì)酶解過(guò)程中的溫度、時(shí)間、加酶量等條件進(jìn)行研究，運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化林蛙皮中透明質(zhì)酸提取工藝。旨在為今后林蛙皮中透明質(zhì)酸的大規(guī)模生產(chǎn)和其產(chǎn)品的深加工提供可行性依據(jù)，對(duì)林蛙皮的綜合利用及新產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮林蛙皮 長(zhǎng)白山輝煌生物科技有限公司提供，于-80℃冷凍備用；堿性蛋白酶（20萬(wàn)U/g）、咔唑 上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶 ＜5萬(wàn)U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化十六烷基吡啶（CP）、濃硫酸、四硼酸鈉、無(wú)水乙醇、95%乙醇、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉 均為分析純。

UV-2201型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；D2F-6090真空烘箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科技儀器有限公司；FA-2004電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；FA25高剪切分散乳化機(jī) 上海FLUKO弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；Z-36HK高速臺(tái)式離心機(jī) 天津市醫(yī)療器械廠；雷磁PHSJ-4F型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝 林蛙皮經(jīng)過(guò)高剪切分散乳化機(jī)剪切后過(guò)60目篩，再與0.2 mol/L NaCl溶液以一定比例相溶，并將料液加熱至95℃維持20 min后迅速冷卻至室溫。7000 r/min離心10 min取上清液，調(diào)pH為8.5［6］先加入堿性蛋白酶水解。酶解結(jié)束后，6000 r/min離心7 min取上清液，調(diào)pH為8.5再加入胰蛋白酶水解。6000 r/min離心7 min取上清液，再向其中加入等體積的1%氯化十六烷基砒啶（CP）［7］，靜置6～8 h，收集多糖與CP絡(luò)合沉淀，并將其加入0.4 mol/L NaCl溶液中，攪拌均勻，解離6～8 h。調(diào)節(jié)解離液pH6.0～6.5，向其中加入3倍體積95%乙醇沉淀，充分?jǐn)嚢璐龠M(jìn)沉淀反應(yīng)的發(fā)生，待沉淀物充分集中后，7000 r/min離心10 min收集沉淀，用無(wú)水乙醇脫水3～5次，再進(jìn)行真空干燥即得到HA精品。

1.2.2 透明質(zhì)酸含量測(cè)定 采用Bitter-Muir咔唑法［8］測(cè)定葡萄糖醛酸的含量，葡萄糖醛酸在HA化合物中的含量為46.43%，通過(guò)換算，即可知最佳工藝得到的HA精品的含量。

其中，C：經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的葡萄糖醛酸的濃度，mg/g；V：測(cè)量吸光度時(shí)所用體積，mL。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 料液比對(duì)HA得率的影響 在酶解溫度50℃，酶解時(shí)間6 h+6 h，酶用量（胰蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶1）55000 U/g的條件下，在適宜的pH8.5的條件下進(jìn)行，選取料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50五個(gè)水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，研究不同料液比對(duì)林蛙皮HA得率的影響，確定最佳料液比。

1.2.3.2 加酶量對(duì)HA得率的影響 在料液比1∶40，酶解溫度50℃，適宜的pH8.5，酶解時(shí)間6 h+6 h，酶用量（胰蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶1）分別為25000、35000、45000、55000、65000 U/g的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究酶用量對(duì)林蛙皮HA得率的影響，確定最佳酶用量。

1.2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)HA得率的影響 在料液比1∶40，酶解溫度50℃，酶用量（胰蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶1）55000 U/g的條件并在適宜的pH8.5的條件下進(jìn)行，兩種酶水解時(shí)間比1∶1，選取水解總時(shí)間為6、8、10、12、14 h，研究酶解時(shí)間對(duì)林蛙皮HA得率的影響，確定最佳酶解時(shí)間。

1.2.3.4 酶解溫度對(duì)HA得率的影響 在料液比1∶40，酶解時(shí)間6 h+6 h，酶用量（胰蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶1）55000 U/g的條件下，在適宜的pH8.5的條件下進(jìn)行，選取酶解溫度為30、40、50、60、70℃五個(gè)水平進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，研究酶解溫度對(duì)林蛙皮HA得率的影響，確定最佳酶解溫度。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table1 Factors and levels in the response surface experiments

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。響應(yīng)曲面模型的回歸方程式和顯著性統(tǒng)計(jì)通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行計(jì)算和分析處理［9-12］，系數(shù)的顯著性通過(guò)F檢驗(yàn)和p值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA含量及純度測(cè)定

圖1所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.22x-0.0126，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)品葡糖醛酸在1.0～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 提取HA單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn) 如圖2所示，在料液比1∶40之前，HA得率隨著料液比的增大而增加；在料液比為1∶40時(shí)，得率最大達(dá)26.2 mg/g；隨后得率變化趨于平緩，并伴有下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榱滞芷A幾乎被全部溶出后，過(guò)多加入的溶劑增大了其他雜質(zhì)的大量溶出，還會(huì)使?jié)饪s過(guò)程中HA損失增大，從

而導(dǎo)致HA得率有所降低，因此選取料液比為1∶40。

圖1 葡萄糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucuronic acid

圖2 料液比對(duì)HA得率的影響Fig.2 The effect of ratio of liquid to solid on the yield of HA

2.2.2 加酶量單因素實(shí)驗(yàn) 如圖3所示，隨著加酶量的增加，HA得率呈逐漸上升趨勢(shì)。加酶量小于55000 U/g時(shí)，得率隨加酶量增加而增加，之后隨加酶量的增大得率反而略有下降。這可能因?yàn)榧用噶吭?5000 U/g條件下，酶濃度已趨于飽和，HA幾乎完全被釋放出來(lái)。繼續(xù)增加酶量，由于酶的本質(zhì)也是蛋白質(zhì)，過(guò)多的酶可能會(huì)與融出的HA結(jié)合，反而使HA得率降低，因此選擇酶用量為55000 U/g。

圖3 加酶量對(duì)HA得率的影響Fig.3 The effect of total enzyme amount on the yield of HA

2.2.3 酶解時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 如圖4所示，隨著酶解時(shí)間的增加，在低于12 h時(shí)HA的得率逐漸增加，當(dāng)高于12 h后HA的得率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能是由于隨著酶解時(shí)間的增加，HA有一部分開始降解，同時(shí)其他成分也可能開始溶出，因此選取酶解時(shí)間12 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)HA得率的影響Fig.4 The effect of enzyme hydrolysis time on the yield of HA

圖5 酶解溫度對(duì)HA得率的影響Fig.5 The effect of enzyme hydrolysis temperature on the yield of HA

2.2.4 酶解溫度單因素實(shí)驗(yàn) 如圖5所示，隨著酶解溫度的不斷升高，酶促反應(yīng)逐漸加快，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，達(dá)到林蛙皮HA的得率最高值為26.88 mg/g，之后隨著酶解溫度的進(jìn)一步升高，HA得率反而降低。這是由于酶的本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)，超過(guò)最適溫度后會(huì)因逐漸變性而失去活性，所以導(dǎo)致林蛙皮HA的得率降低，因此選取提取溫度為50℃。

2.3 響應(yīng)面法提取HA條件的優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定提取料液比為1∶40。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn) 對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件Design-Expert 8.0.6進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合，得到預(yù)測(cè)模型如下：

Y=26.02+1.15A+0.33B+0.29C-0.24AB+0.32AC+0.16BC-5.14A2+1.06B2-7.98C2，其中Y為HA得率。

表3為回歸分析結(jié)果，回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)p=0.7820＞0.05不顯著，并且該模型的總決定系數(shù)R2=0.9981，調(diào)整決定系數(shù)R=0.9956，說(shuō)明該模型的擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，因此該回歸模型成立，可以用此模型對(duì)酶解提取林蛙皮中HA得率進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。

各因素的p值可以反映出各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，p值越小，表明對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，即重要性越大。從方差分析表可知：加酶量（A）的p＜0.0001達(dá)到極顯著水平；酶解時(shí)間（B）的p=0.0273和酶解溫度（C）的p=0.0472有統(tǒng)計(jì)顯著性，即各因素對(duì)透明質(zhì)酸提取得率的影響順序：加酶量（A）＞酶解時(shí)間（B）＞酶解溫度（C）。二次項(xiàng)中AB、AC、BC三項(xiàng)的p值均大于0.05，說(shuō)明因素之間的交互作用不顯著，表明各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。而二次項(xiàng)中，A2、B2、C2三項(xiàng)的p值均小于0.001，說(shuō)明三項(xiàng)的影響極顯著。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Response surface layout design and experimental result

表3 回歸方程模型方差分析表Table3 Analysis of variance for the developed regression equation

2.3.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面分析圖（見圖6），考察所擬合的響應(yīng)面曲面的形狀，分析加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)HA得率的影響，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響可以通過(guò)各圖直觀反映出來(lái)。

圖6 加酶量、酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)HA得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface maps of add enzyme amount，enzyme hydrolysis time，enzyme hydrolysis temperature on the yield of HA

如圖6所示，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，A與B、A與C、B與C之間交互作用都不顯著，它們對(duì)Y值的影響規(guī)律并不會(huì)隨著另一因素的改變而有明顯變化。三個(gè)因素對(duì)Y值的影響以及各因素之間的交互影響與表3方差分析結(jié)果一致。

2.3.4 最優(yōu)條件的確定 根據(jù)所得到的模型，對(duì)響應(yīng)面結(jié)果利用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行優(yōu)化分析，以HA得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到相應(yīng)的提取優(yōu)化工藝條件：酶解時(shí)間14.00 h，酶解溫度50.29℃，加酶量為55886.78 U/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行林蛙皮HA的提取實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際情況，將修正后提取HA的最佳工藝條件定為加酶量55000 U/g，酶解時(shí)間14 h，酶解溫度50℃，在此條件下，平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到HA平均得率為27.6839 mg/g（RSD=0.89%），與預(yù)測(cè)值27.4568 mg/g相對(duì)誤差約為0.85%，與預(yù)測(cè)值非常接近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化雙酶法提取林蛙皮透明質(zhì)酸條件準(zhǔn)確可行。此外，由Bitter咔唑法測(cè)得最佳工藝得到的HA精品中葡萄糖醛酸的吸光度為0.597，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算得葡萄糖醛酸的含量為13.8420 mg/g，轉(zhuǎn)化成百分含量為42.2%。

3 討論與結(jié)論

以新鮮林蛙皮為原料，采用復(fù)合酶解法提取HA得率為27.6839 mg/g，與傳統(tǒng)的水提醇沉法HA得率14.7 mg/g［3］及單酶提取法HA得率12 mg/g［13］相比，HA提取得率都有顯著提高。本實(shí)驗(yàn)使用堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶法提取HA，堿性蛋白酶的催化環(huán)境pH堿性較強(qiáng)，HA不斷被分解，而胰蛋白酶的催化環(huán)境為中性，游離的HA不會(huì)被降解。盡管HA在堿性蛋白酶的催化環(huán)境中會(huì)分解，但胰蛋白酶催化能力較弱，單酶水解林蛙皮得到的HA仍然小于雙酶法，所以先使用堿性蛋白酶初步水解林蛙皮，然后在中性pH下用胰蛋白酶進(jìn)一步水解林蛙皮，則可獲得更高得率的HA。

經(jīng)過(guò)最佳工藝分離提取的HA精品中葡萄糖醛酸的含量為42.2%，目前國(guó)內(nèi)外一般以葡糖醛酸含量表示HA的純度，保健食品及化妝品級(jí)HA的葡糖醛酸含量為35%～45%，藥用級(jí)為42%～48%［14］。本研究分離提純的透明質(zhì)酸其純度完全達(dá)到了食品和化妝品的要求，該產(chǎn)品無(wú)毒無(wú)害，安全性高。

采用雙酶酶解林蛙皮的方法提取透明質(zhì)酸，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理以及響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬合了加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度這3個(gè)因素對(duì)HA得率的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型合理可靠，能較好地預(yù)測(cè)林蛙皮中透明質(zhì)酸的提取得率。又該模型確定的最佳工藝條件為加酶量55000 U/g，酶解時(shí)間14 h，酶解溫度50℃，在此條件下，得到林蛙皮HA平均得率為27.6839 mg/g；通過(guò)模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到因素的主效應(yīng)關(guān)系為：加酶量＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。本工藝提高了HA的提取得率，而且與其他動(dòng)物組織相比，從林蛙皮中提取的HA更加優(yōu)良，為林蛙皮的進(jìn)一步綜合開發(fā)和利用提供新的參考依據(jù)。

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Optimization of extraction process for hyaluronic acid from Rana chensinensis by response surface methodology

YUAN Hai-lian，SHI Su-yun*
（Collage of Pharmacy，Yanbian University，Yanji 133002，China）

With Rana chensinensis David skin as the research object，the hyaluronic acid（HA）rate was set as a measure indicator.Under the condition of solid-liquid ratio 1∶40（g/mL），three extraction parameters including enzyme temperature，enzyme hydrolysis time（time of double enzyme was equal）and enzyme amount（dosage ratio of double enzyme was 1∶1）of double enzyme（alkaline proteinase and trypsin enzyme）hydrolysis method as the respective variables and hyaluronic acid rate as response value were explored by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory based on single factor experiment，so as to study the interaction of the respective variables and their influence on the HA extraction rate and set up the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model.The optimum extraction condition was enzyme amount 55000 U/g under the optimal temperature 50℃for a duration of 14 h.Under these conditions，the average extraction yield of HA was up to 27.6839 mg/g，glucuronide content was 13.8420 mg/g，namely whose purity 42.2%in extraction.Besides，the response surface methods were also proved to be available to extract HA exactly.

Rana chensinensis David skin；hyaluronic acid；response surface analysis methodology；enzyme hydrolysis extraction

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.032

2015－08－17

袁海戀（1990-），女，碩士，研究方向：藥物活性成分及美容保健品的研究與開發(fā)，E-mail：y15253090921@163.com。

*通訊作者：施溯筠（1972-），女，博士，副教授，研究方向：天然藥物活性成分的研究，E-mail：shsy@ybu.edu.cn。

國(guó)家自然基金（81260251）。