李利華（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

魚腥草多酚的超聲波輔助提取及抗氧化性能研究

李利華
（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

研究魚腥草多酚的超聲波輔助提取工藝和抗氧化性能。以多酚提取率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化魚腥草多酚提取工藝；通過體外對(duì)羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O·）的清除作用評(píng)價(jià)其抗氧化活性。研究結(jié)果表明，魚腥草多酚最佳提取工藝為乙醇濃度50%、超聲浸提溫度50℃、超聲浸提時(shí)間60 min、料液比1∶35，超聲功率200 W，此條件下魚腥草多酚的提取率為3.734%±0.025%，其中浸提溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)魚腥草多酚提取率具有顯著性影響。魚腥草多酚具有一定的清除·OH和O·的能力，且清除率與多酚濃度呈劑量效應(yīng)關(guān)系，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)其對(duì)·OH和O·的清除率均低于同濃度的陽(yáng)性對(duì)照品VC。

魚腥草，多酚，超聲波輔助提取，抗氧化性能

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.），又名蕺菜、折耳根、狗點(diǎn)耳，屬三白草科蕺菜屬，為三白草科植物蕺菜的新鮮全草或干燥的地上部分，因全草帶魚腥味而得名，在我國(guó)南方省區(qū)分布廣泛［1］。魚腥草是國(guó)家衛(wèi)生部正式確定的“藥食兼用型”植物之一，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)含有揮發(fā)油、多糖、黃酮類等多種藥效成分，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿除濕等功效，在臨床上用于治療肺炎、肺膿瘍、熱痢、痔瘡、水腫、脫肛、濕疹、瘧疾等［2］。

植物多酚（Plant polyphenol）又稱植物單寧，是植物的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物的根、木、果、葉、皮中，屬于天然多元酚類有機(jī)化合物［3］。近年來(lái)，多酚類化合物的生物活性和其對(duì)人體的保健防病功效成為研究的熱點(diǎn)。大量研究已證實(shí)，多酚類化合物是優(yōu)良的天然抗氧化劑，能夠阻止脂質(zhì)自氧化，延緩人體衰老，清除體內(nèi)多余自由基等作用［4-5］。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)植物中多酚類化合物提取及應(yīng)用的研究報(bào)

道較多［6-8］，而有關(guān)魚腥草中多酚類物質(zhì)的提取卻鮮見報(bào)道。本研究采用超聲波輔助提取法從魚腥草中提取多酚，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間及料液比對(duì)魚腥草多酚提取率的影響，通過正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化；并通過體外對(duì)羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O·）的清除作用，評(píng)價(jià)魚腥草多酚的抗氧化性能，為進(jìn)一步研究魚腥草的藥理和保健功效提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮魚腥草 于2015年4月初采挖于陜南山區(qū)，將新鮮魚腥草分別用自來(lái)水和二次蒸餾水沖洗干凈，于60℃干燥至恒質(zhì)量，粉碎，過40目篩，備用；福林試劑、沒食子酸、無(wú)水乙醇、碳酸鈉、雙氧水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、三羥基氨甲烷、鄰苯三酚等試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水二次蒸餾水。

KQ-700VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV型紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；TD-214型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；DHG-9140B型電熱恒溫干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；中草藥粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚腥草多酚的提取工藝流程 魚腥草→清洗→干燥（60℃）→粉碎→石油醚脫脂→利用超聲波輔助浸提多酚→過濾→測(cè)定上清液多酚提取率→優(yōu)化多酚提取工藝→得到多酚提取液→濃縮（測(cè)抗氧化性能）→干燥→魚腥草粗多酚。

1.2.2 多酚的含量測(cè)定 以沒食子酸為對(duì)照品，采用Folin-Ciocalteau法［9］制做標(biāo)準(zhǔn)曲線，于765 nm處測(cè)定吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.9772C+0.1141，R2=0.9992。

精密移取魚腥草多酚提取液1.0 mL于25 mL比色管中，依次加福林試劑1.0 mL和15%碳酸鈉溶液4 mL，以50%乙醇定容至刻線，常溫下避光反應(yīng)2 h，于波長(zhǎng)765 nm下測(cè)定吸光度，每個(gè)樣品平行測(cè)定三次取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多酚含量及提取率：

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)魚腥草多酚提取率的影響

固定超聲功率200 W，分別選取體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇作為溶劑，在超聲浸提時(shí)間50 min、超聲浸提溫度60℃、料液比1∶30的條件下提取魚腥草多酚，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)魚腥草多酚提取率的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.2 超聲浸提時(shí)間對(duì)魚腥草多酚提取率的影響

固定超聲功率200 W，分別選取超聲浸提時(shí)間為20、 35、50、65、80 min，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲浸提溫度60℃、料液比1∶30的條件下提取魚腥草多酚，考察浸提時(shí)間對(duì)魚腥草多酚提取率的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.3 料液比對(duì)魚腥草多酚提取率的影響 固定超聲功率200 W，分別選取料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g∶mL），在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲浸提溫度60℃、超聲浸提時(shí)間50 min的條件下提取魚腥草多酚，考察料液比對(duì)魚腥草多酚提取率的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3.4 超聲浸提溫度對(duì)魚腥草多酚提取率的影響

固定超聲功率200 W，分別選取超聲浸提溫度為40、50、60、70、80℃，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、浸提時(shí)間50 min、料液比1∶30的條件下提取魚腥草多酚，考察浸提溫度對(duì)魚腥草多酚提取率的影響，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)，超聲浸提時(shí)間，料液比，超聲浸提溫度的最佳水平范圍進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化魚腥草多酚超聲波輔助提取的最佳提取條件，因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table1 The factors and levels of the orthogonal design

1.2.5 魚腥草多酚的抗氧化性能研究

1.2.5.1 對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［10］。比色管中依次加入5.0 mmol·L-1鄰二氮菲1.0 mL，pH7.4 PBS緩沖溶液3.8 mL，不同濃度的魚腥草多酚提取液1.0 mL，5.0 mmol·L-1FeSO41.5 mL及0.1%H2O21.0 mL，搖勻后于37℃水浴保溫60 min，于536 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)樣品，用蒸餾水取代多酚提取液測(cè)定吸光度值A(chǔ)損傷，用蒸餾水取代多酚提取液和0.1%H2O2，測(cè)定吸光度值A(chǔ)未損。配制同濃度VC做陽(yáng)性對(duì)照。按下式計(jì)算對(duì)·OH清除率：

1.2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 17.0和Origin 8.0

軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并制圖，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（meana±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)魚腥草多酚提取率的影響

由圖1可知，魚腥草多酚的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈先增大后減小的趨勢(shì)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%時(shí)提取率達(dá)最大值，之后提取率開始下降。根據(jù)相似相溶原理，適當(dāng)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)，溶劑極性增加，有利于多酚的溶出，而當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過50%，溶劑與多酚極性差異增大，多酚不能充分溶解，提取率下降［12］。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%左右為最佳提取劑濃度。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多酚提取率的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on extraction yield of the polyphenol

2.1.2 超聲浸提時(shí)間對(duì)魚腥草多酚提取率的影響

由圖2可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，魚腥草多酚提取率先明顯增大，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到65 min時(shí)提取率最高，為3.660%±0.021%，之后繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，提取率開始下降。這是由于在一定時(shí)間內(nèi)浸提時(shí)間越長(zhǎng)，多酚的溶出量越多，但浸提時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)成分溶出量增加，多酚提取率降低［13］。因此選擇超聲浸提時(shí)間65 min左右為最佳浸提時(shí)間。

圖2 超聲浸提時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響Fig.2 Influence of ultrasonic duration on extraction yield of the polyphenol

2.1.3 料液比對(duì)魚腥草多酚提取率的影響 由圖3可知，隨著料液比的增加，魚腥草多酚的提取率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，多酚的提取率最高，為3.574%±0.018%；之后料液比繼續(xù)增大，多酚提取率趨于平穩(wěn)并略有下降。這是由于料液比低于1∶40，多酚溶出不完全，提取率增加較快，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，多酚的溶出已基本達(dá)飽和。從能耗角度考慮，選擇料液比1∶40左右為最佳提取料液比。

圖3 料液比對(duì)多酚提取率的影響Fig.3 Influence of ratio of material to liquid on extraction yield of the polyphenol

2.1.4 超聲浸提溫度對(duì)魚腥草多酚提取率的影響

由圖4所示，魚腥草多酚的提取率隨浸提溫度的升高先增加后減小，當(dāng)浸提溫度為50℃時(shí)魚腥草多酚提取率最大，為3.428%±0.016%，之后提取率開始下降。這可能是浸提溫度過高使已溶出的多酚物質(zhì)氧化或分解［14］。因此，選擇超聲浸提溫度為50℃左右為最佳浸提溫度。

圖4 超聲浸提溫度對(duì)多酚提取率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic temperature on extraction yield of the polyphenol

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2極差分析可知，各因素對(duì)魚腥草多酚的提取率影響主次順序?yàn)椋篋（超聲浸提溫度）＞A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（料液比）＞B（超聲浸提時(shí)間），優(yōu)化得到最佳工藝條件為A2B1C1D2，即：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲浸提溫度50℃，超聲浸提時(shí)間60 min，料液比1∶35。由表3方差分析可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲浸提溫度對(duì)魚腥草多酚的提取具有顯著性影響。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取魚腥草干粉試樣5份，按照優(yōu)化得到的最佳工藝條件乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲浸提溫度50℃，超聲浸提時(shí)間60 min，料液比1∶35進(jìn)行魚腥草多酚提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得魚腥草多酚平均提取率為3.734%± 0.025%，RSD為1.36%，表明該工藝條件重復(fù)性好，科學(xué)可行，能夠滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal experiment and its results

表3 方差分析表Table3 Analysis results of variance

2.4 抗氧化性能實(shí)驗(yàn)

2.4.1 對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用 由圖5可看出，隨著濃度的增加，魚腥草多酚對(duì)·OH的清除率逐漸增大，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最大清除率為40.92%±1.56%；和同濃度VC對(duì)照可見，VC對(duì)·OH的清除率高于同濃度的魚腥草多酚，說(shuō)明魚腥草多酚對(duì)·OH具有一定的清除作用，但清除效果不及同濃度的VC。

圖5 魚腥草多酚對(duì)·OH的清除作用Fig.5 Scavenging effect of the polyphenol extract from Houttuynia cordata Thunb.on·OH

圖6 魚腥草多酚對(duì)O·的清除作用Fig.6 Scavenging effect of the polyphenol extract from Houttuynia cordata Thunb.on O·

3 結(jié)論與討論

3.1 以魚腥草為原材料，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)魚腥草多酚的超聲波輔助提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化得到的超聲波輔助提取魚腥草多酚的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲浸提溫度50℃，超聲浸提時(shí)間60 min，料液比1∶35，超聲功率200 W。在此工藝條件下，魚腥草多酚達(dá)到最大提取率3.734%±0.025%。各因素對(duì)提取率影響的主次順序?yàn)椋撼暯釡囟龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞超聲浸提時(shí)間，其中浸提溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)魚腥草多酚的提取具有顯著性影響。

3.3 本研究?jī)?yōu)化所得的魚腥草多酚為粗多酚類物質(zhì)，由于植物多酚為一大類物質(zhì)，包括酚酸、單寧類、黃酮類及花色苷類等，因此還需進(jìn)一步對(duì)粗多酚分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，研究其抗氧化性能與多酚類活性成分的構(gòu)效關(guān)系及抗氧化機(jī)理。

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Study on ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of polyphenol from Houttuynia cordata Thunb.

LI Li-hua
（Chemical and Environmental Sciences，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

The paper studied the ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of polyphenol from Houttuynia cordata Thunb.Using the extraction rate of polyphenol as the index，through the single factor experiments and orthogonal experimental designs，the ultrasonic-assisted extraction of polyphenol from Houttuynia cordata Thunb.was optimized，and the antioxidant activity of the polyphenol extract was evaluated by scavenging hydroxyl free radical（·OH）and superoxide anion free radical（O2-·）in vitro.Results showed that the optimum extraction conditions were determined as following：ethanol concentration of 50%，ultrasound extraction temperature of 50℃，ultrasound extraction duration of 60 min，ratio of solid to liquid of 1∶35（g∶mL），and ultrasound power of 200 W，and the highest yield 3.734%±0.025%was obtained under these conditions.Extraction temperature and ethanol concentration significantly affected the extraction rate of the polyphenol.The polyphenol extract obtained had some scavenging capacity against·OH and O2-·in a dosage-dependent manner，and the scavenging capacity against·OH and O2-·was a little weaker than VCunder the tested concentration.

Houttuynia cordata Thunb.；polyphenol；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2016）08-0295-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.053

2015－09－08

李利華（1977-），女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分的分析、檢測(cè)，E-mail：lilhqlm@126.com。

陜西省科技廳資助科研項(xiàng)目（2014JQ2055）；陜西省教育廳資助科研項(xiàng)目（2014JK1145）。