陳燕芹，劉 紅，，李玉華，賈貴飛，卯明江，袁希群，李 果（.貴州省應(yīng)用化學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州畢節(jié)55700；.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)化工實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，貴州畢節(jié)55700）

小茴香總多酚的顯色條件及微波輔助提取條件的優(yōu)化

陳燕芹1，劉 紅1，2，李玉華1，賈貴飛2，卯明江2，袁希群2，李 果2
（1.貴州省應(yīng)用化學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州畢節(jié)551700；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)化工實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，貴州畢節(jié)551700）

為了探明小茴香中多酚類物質(zhì)的顯色條件及微波輔助提取工藝，更深入的開發(fā)利用小茴香。以小茴香為原料，通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)合，研究了小茴香總多酚的顯色條件及其微波輔助提取的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最佳顯色條件為：取2.00 mL萃取液（1 g樣品萃取后定容到100 mL），加入4.50 mL的10%碳酸鈉溶液，3.00 mL、50% 的Folin-ciocalteu溶液，在室溫下顯色60 min。微波萃取工藝為：提取溫度70℃，乙醇濃度50%，提取時(shí)間5 min，固液比1∶50（g∶mL），在此微波提取條件下總多酚的提取率為12.52 mg/g。方法研究表明濃度在0～8 μg/mL時(shí)濃度與其吸光度值有良好線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=0.0864x－0.0055，R2=0.9992，精密度實(shí)驗(yàn)RSD值為1.16%，回收率為97.43%± 1.57%。

小茴香，多酚，微波提取，顯色條件

多酚是一種植物次生代謝產(chǎn)物，具有生物活性，能發(fā)揮抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、捕捉自由基、防治冠心病等功效［1-3］。因此，其提取與應(yīng)用研究日益受到重視，人們?cè)噲D尋找富含多酚的植物材料，以便加快開發(fā)利用多酚。建立多酚的簡(jiǎn)便和快捷的測(cè)定方法及提取方法是進(jìn)一步研究和利用多酚的基礎(chǔ)［1，3］。

小茴香又名香絲菜，為傘形科茴香屬植物［4-8］，是一種具有氣香、味辛的烹調(diào)香料，可用于泡菜及肉類的調(diào)制，也是一種分布廣泛的中藥［5］，主要成分為脂肪油、甾醇及生物堿、氨基酸、葑酮、茴香酮、茴香醛等［6-9］。近年來有關(guān)小茴香相關(guān)成分的研究已有報(bào)道，如謝建春等［7］經(jīng)GC-MS確認(rèn)小茴香含有茴香醛、茴香酮等；李玉華等［9］研究了同時(shí)測(cè)定小茴香中茴香醛及蘆丁的方法。多酚類物質(zhì)是小茴香中的重要功能成分，但對(duì)小茴香多酚的研究報(bào)道較少。

不同植物中所含酚類的種類和含量都有差異，

因此不同植物中多酚提取條件和測(cè)定的方法也有差異［1］，本文研究了Folin-Ciocalteu法測(cè)定小茴香總多酚含量的適宜條件及微波輔助法提取小茴香多酚的最佳提取條件，以期為其質(zhì)量控制及以后的研究開發(fā)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小茴香 購(gòu)自畢節(jié)佳誠(chéng)超市；沒食子酸、鎢酸鈉等試劑 均為分析純；福林酚試劑 參考蔡文國(guó)等［1］的方法配制，使用時(shí)加入1倍蒸餾水稀釋。

V5800可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；MDS-10微波消解萃取工作站 上海新儀；101A-2鼓風(fēng)干燥箱 蘇州偉羅自動(dòng)化烘箱科技有限公司；DFY-300中藥粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；SD-RO10超純水機(jī) 北京惠源三達(dá)水處理設(shè)備有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 江蘇億通電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 顯色條件樣品溶液及對(duì)照品溶液的制備 小茴香在105℃烘干24 h后，用粉碎機(jī)粉碎并過60目篩，置于真空干燥器中保存?zhèn)溆?。稱取干燥的小茴香樣品1 g（精確到0.1 mg）于萃取罐中，加入50%的乙醇溶液40 mL，置于微波萃取儀中，在功率400 W，60℃下萃取5 min，將萃取液稍冷后抽濾，用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中待用。

參照文獻(xiàn)［1］配制200 μg/mL的沒食子酸溶液。

1.2.2 福林酚法（Folin-ciocalteu）顯色條件的優(yōu)化

1.2.2.1 10%碳酸鈉溶液加入量的影響 取洗凈的50 mL容量瓶，加入1.2.1中制備的小茴香提取溶液2.00 mL（制備方法見1.2.1），分別加入不同體積的10% Na2CO3溶液（0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00 mL），并加入2.00 mL 50%Folinciocalteu溶液，用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，室溫放置60 min后在760 nm處測(cè)定其吸光度大小，確定碳酸鈉溶液用量對(duì)反應(yīng)體系的影響。

1.2.2.2 Folin-ciocalteu溶液加入量的影響 取洗凈的50 mL容量瓶，加入小茴香提取溶液2.00 mL，10%碳酸鈉溶液4.00 mL，再分別加入不同體積的50% Folin-ciocalteu溶液（0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00 mL），用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，室溫放置60 min后在760 nm處測(cè)定其吸光度，確定50%Folin-ciocalteu溶液加入量的最佳范圍。

1.2.2.3 顯色時(shí)間的影響 取洗凈的50 mL容量瓶，加入小茴香提取溶液2.00 mL，10%碳酸鈉溶液4.00 mL，50%Folin-ciocalteu溶液3.00 mL，用蒸餾水定容至50 mL，搖勻，室溫下每間隔5 min測(cè)定一次吸光度，確定反應(yīng)時(shí)間的合理范圍。

1.2.2.4 顯色條件的正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以10%碳酸鈉溶液添加量、50%Folin-ciocalteu溶液添加量以及顯色時(shí)間為因素，以760 nm處的吸光度為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，研究小茴香提取液的最佳顯色條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平見表1。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采取1.2.2節(jié)優(yōu)化的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL沒食子酸溶液置于50 mL容量瓶中，依次加入10%的碳酸鈉4.50 mL，50%的Folin-ciocalteu溶液3.00 mL，再用蒸餾水定容至50 mL，室溫下放置60 min，在760 nm處測(cè)定吸光度［1］。小茴香中多酚含量以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)的含量計(jì)算，提取率（y）按式（1）進(jìn)行計(jì)算。

表1 小茴香多酚顯色的正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Table1 The factors and levels of orthogonal design

式中，c為代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的濃度，μg/mL；V1為提取后定容的體積，mL；V2為取樣進(jìn)行顯色的體積，mL；m為樣品的稱量質(zhì)量，g；50為顯色后定容的體積。

1.2.4 微波輔助提取條件的優(yōu)化

1.2.4.1 提取溫度的選擇 稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品6份，加入40 mL、50%的乙醇溶液，分別在30、40、50、60、70、80℃下微波提取5 min，冷卻抽濾，將濾液用蒸餾水定容到100 mL，取2.00 mL樣品溶液按1.2.2節(jié)確定的顯色條件測(cè)定其吸光度，并計(jì)算提取率。

1.2.4.2 提取時(shí)間的選擇 稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品5份，加入40 mL、50%的乙醇溶液，分別置于60℃下微波2、4、5、6、8 min，冷卻抽濾，濾液用蒸餾水定容至100 mL，取2.00 mL按1.2.2節(jié)確定的顯色條件測(cè)定其吸光度，并計(jì)算提取率。

1.2.4.3 乙醇濃度的選擇 稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品7份，分別加入乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液40 mL，在60℃下微波提取5 min，抽濾，將濾液用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，取2.00 mL提取液按1.2.2節(jié)確定的顯色條件測(cè)定其吸光度，并計(jì)算提取率。

1.2.4.4 固液比的選擇 稱取1 g（精確到0.1 mg）樣品6份，分別加入50%的乙醇溶液10、20、30、40、50、60、70 mL，在60℃下微波提取5 min，抽濾，將濾液用蒸餾水定容至100 mL，取2.00 mL按1.2.2節(jié)確定的顯色條件測(cè)定其吸光度，并計(jì)算提取率。

1.2.4.5 提取條件的正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度及固液比為因素進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，研究小茴香多酚的提取條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素及水平見表2。

1.2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià) 參照文獻(xiàn)［1］對(duì)小茴香總多酚的Folin-ciocalteu比色法進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2007對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1進(jìn)行正交設(shè)計(jì)及分析，n=3。

表2 提取條件的實(shí)驗(yàn)因素與水平Table2 The factors and levels of the extraction

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色條件對(duì)小茴香多酚測(cè)定的影響

2.1.1 10%碳酸鈉溶液加入量的影響 由圖1可知，顯色對(duì)碳酸鈉溶液的用量具有很強(qiáng)的依賴性，當(dāng)碳酸鈉溶液加入量逐漸增大時(shí)，吸光度呈明顯的增大趨勢(shì)，當(dāng)碳酸鈉溶液的加入量為4.00 mL時(shí)溶液顯色較為完全，所以碳酸鈉溶液的加入量為4.00 mL是反應(yīng)體系最佳的顯色條件。

圖1 碳酸鈉溶液加入量對(duì)吸光度的影響Fig.1 Effect of Na2CO3on the absorbance

2.1.2 Folin-ciocalteu溶液加入量的影響 由圖2可知，反應(yīng)體系的吸光度隨Folin-ciocalteu溶液加入量的增大先增后降，F(xiàn)olin-ciocalteu溶液的加入量為3.00 mL時(shí)溶液的吸光度最大。所以確定Folin-ciocalteu溶液的最佳加入量為3.00 mL。

圖2 Folin-ciocalteu溶液加入量對(duì)吸光度的影響Fig.2 Effect of Folin-ciocalteu reagent on the absorbance

2.1.3 顯色時(shí)間的影響 由圖3可以得到體系的吸光度隨顯色時(shí)間的增加逐漸增大；顯色時(shí)間到50 min后，整個(gè)反應(yīng)體系的吸光度的趨于平緩，這表明體系反應(yīng)基本完成。為了保證顯色反應(yīng)完全，確定以55～65 min作為正交優(yōu)化的范圍。

圖3 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effect of reaction time on the absorbance

2.1.4 顯色條件的正交實(shí)驗(yàn) 按1.2.2.4的方法進(jìn)行顯色條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表3。由表3結(jié)果可以看出，時(shí)間的極差最大，所以時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響最大，F(xiàn)olin-ciocalteu溶液添加量次之，碳酸鈉的加入量影響最小。所以可以得到小茴香總多酚測(cè)定的最佳顯色條件的是A3B2C2，即顯色時(shí)間為60 min，50%Folin-ciocalteu溶液的加入量為3.00 mL，10%碳酸鈉溶液的加入量為4.5 mL。按此條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得吸光度的平均值為0.349，RSD為0.92%。

表3 小茴香總多酚顯色條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of orthogonal test of Foeniculum vulgare Mill

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.3方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其線性回歸方程為y=0.0864x-0.0055，R2=0.9992。表明沒食子酸濃度為0～8 μg/mL范圍內(nèi)其吸光度值呈良好的線性關(guān)系，該方程可以用于小茴香多酚實(shí)驗(yàn)的定量測(cè)定。

2.3 微波輔助提取條件

2.3.1 提取溫度的選擇 由圖4可知，提取溫度低于70℃時(shí)，隨溫度升高提取率增加，這是由于多酚在乙醇中的溶解度隨著溫度的升高而增大。但是當(dāng)溫度大于70℃時(shí)，提取率降低，因?yàn)檫^高的溫度可能導(dǎo)致多酚小部分分解［10］。故選擇提取溫度為50～70℃。

圖4 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of total polyphenol

圖5 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of total polyphenol

2.3.2 提取時(shí)間的選擇 由圖5可知，提取時(shí)間小于5 min時(shí)，小茴香多酚的提取率隨時(shí)間的增加而增加；提取時(shí)間大于5 min，多酚提取率降低。原因可能是隨著提取時(shí)間的增加，小茴香多酚的溶出越多，但隨著微波時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，多酚吸收過量微波，熱量大量聚集使多酚發(fā)生分解，導(dǎo)致多酚提取率降低［11］。故提取時(shí)間選擇為4～6 min。

2.3.3 乙醇濃度的選擇 由圖6可知隨著乙醇濃度的增加，提取率呈先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，多酚的提取率最大。原因可能是隨著乙醇濃度的提高，小茴香多酚的溶出越多，但乙醇濃度的進(jìn)一步提高，小茴香中其他脂溶性成分的溶出增大，從而抑制了多酚的溶出。所以選擇40%～60%為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

圖6 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total polyphenol

2.3.4 固液比的選擇 由圖7可知當(dāng)固液比在1∶10～1∶50（g/mL）時(shí)，多酚的提取率隨著固液比的增大而提高，但是當(dāng)固液比大于1∶50（g/mL）時(shí)，多酚的提取率有所降低。這可能是固液比增加時(shí)，水含量也相應(yīng)增加，水與小茴香樣品接觸的機(jī)會(huì)增多，使多酚與乙醇接觸的機(jī)會(huì)相應(yīng)減少，導(dǎo)致多酚提取量減少［10］。故選擇固液比為1∶40～1∶60（g/mL）。

圖7 固液比對(duì)多酚提取率的影響Fig.7 Effect of liquid ratio on extraction rate of total polyphenol

2.3.5 提取條件的正交實(shí)驗(yàn) 按1.2.4.5的方法進(jìn)行提取條件的正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表4。

表4 小茴香總多酚微波輔助提取正交實(shí)驗(yàn)Table4 The orthogonal experimental results of of total polyphenol by microwave-assisted extraction

從表4結(jié)果得到，影響多酚提取率的各因素中，其主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞固液比＞乙醇濃度＞提取溫度。小茴香多酚提取的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組合為B2D2C2A3，即提取溫度為70℃，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間為5 min，固液比為1∶50（g/mL）。按該組合進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，總多酚的提取率的平均值為12.52 mg/g，比表4中2號(hào)實(shí)驗(yàn)的提取率略高。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一樣品平行測(cè)定6次，吸光度平均值為0.308，其RSD為1.16%表明該方法具有較高的精密度。

2.4.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 以方法1.2.4.5優(yōu)化的提取條件提取6個(gè)樣品，按1.2.2.4優(yōu)化的顯色條件進(jìn)行測(cè)定，得小茴香提取率平均值為12.52 mg/g，RSD為1.06%，表明方法的重現(xiàn)性較好。

2.4.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 對(duì)已知總多酚含量的小茴香樣品3份按1.2.5方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得平均回收率為97.43%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高。以2.4.2中平均提取率作為真值，樣品質(zhì)量乘以平均提取率作為本底值。

Optimizatin of chromogenic condition and extraction by microwave assisted of total polyphenol from Foeniculum vulgare Mill

CHEN Yan-qin1，LIU Hong1，2，LI Yu-hua1，JIA Gui-fei2，MAO Ming-jiang2，YUAN Xi-qun2，LI Guo2
（1.Key Laboratory on Applied Chemistry，Bijie 551700，China；2.Experiment Teaching Center for Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University of Engineering Science，Bijie 551700，China）

The best chromogenic conditions and microwave extraction technology of total polyphenol in Foeniculum vulgare Mill were researched by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the chromogenic conditions were taking 2.00 mL extract liquor added 4.50 mL 10%sodium carbonate solution，3.00 mL 50%Folin-ciocalteu reagent，respectively，reacted sixty minutes at the room temperature.The microwave extraction technology was following，extraction temperature was 70℃，the concentration of ethanol was 50%，extraction time was 5 min，ratio of material to liquid was 1∶50（g∶mL），under this condition，the average extraction ratio was 12.52 mg/g.Method study showed that concentration had a good linear relationship with absorbance value if the concentration was in the range of 0～8 μg/mL，the linear regression equation was y=0.0864x-0.0055，the correlation coefficient was R2=0.9992，the recovery rate was 97.43%±1.57%.

Foeniculum vulgare Mill；polyphenol；microwave extraction；chromogenic conditions

TS207

B

1002-0306（2016）08-0299-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.054

2015－10－22

陳燕芹（1976-），女，碩士，副教授，主要從事光譜分析方法的研究及應(yīng)用，E-mail：chenyanqin1227@126.com。

貴州省科技廳聯(lián)合基金（黔科合J字LKB［2013］05號(hào)）。