蔡東梅 龔國利

（陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021）

大腸桿菌中生物藥物的生產(chǎn)現(xiàn)狀及展望

蔡東梅 龔國利

（陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021）

大腸桿菌是表達藥用異源蛋白的首選微生物，此宿主目前已生產(chǎn)約30％被批準的藥用蛋白。大腸桿菌具有生長迅速、產(chǎn)率高、效益大及易擴大培養(yǎng)的優(yōu)勢，促使它成為生物技術(shù)行業(yè)中蛋白大規(guī)模生產(chǎn)常選擇的表達宿主。但大腸桿菌中密碼子偏好性的存在及糖基化、磷酸化和蛋白水解加工等翻譯后修飾的缺乏會限制其生產(chǎn)較復雜的重組生物藥物。綜述了大腸桿菌表達系統(tǒng)中幾項滿足生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)需求的相關(guān)創(chuàng)新技術(shù)，介紹如何利用相關(guān)技術(shù)進步使大腸桿菌糖基化異源蛋白和表達包括全長糖基化抗體在內(nèi)的復雜蛋白的過程，并對存在的問題及其研究前景進行展望，旨在為幫助大腸桿菌順利生產(chǎn)更復雜的藥用糖基化蛋白。

大腸桿菌；生物制藥學；密碼子偏好性；分子伴侶

藥物的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展需要表達大量正確折疊的重組蛋白。這些藥用重組蛋白普遍用于治療各種疾病，也常作為篩選新藥物的靶蛋白。大腸桿菌具有生長速度快、基因操作方便和重組蛋白合成速度快等優(yōu)點，使它成為表達多種重組蛋白最令人滿意的宿主之一［1，2］。在少數(shù)情況下，它能達到非常高的表達水平，其表達量能上升到細胞總蛋白的30％。大腸桿菌是第一個用來生產(chǎn)生物藥物的表達載體，它的發(fā)展促使了1982年用于糖尿病治療的人胰島素得到相關(guān)監(jiān)督部門的批準。1994年牛生長激素（bGH）的批準為生產(chǎn)源自大腸桿菌的藥用異源蛋白設(shè)立了新標準（表1）。引人矚目的一點是胰島素和牛生長激素都需要氧化蛋白折疊，此外，胰島素是一種異質(zhì)二聚體，重組胰島素和生長激素的成功獲得突出了基于大腸桿菌生產(chǎn)的多功能性和有效性。然而，由于大腸桿菌外源基因中存在大量會導致翻譯錯誤的稀有密碼子。這些錯誤若在藥用蛋白使用的情況下，即便低水平表達都能導致人體不良的免疫反應(yīng)，蛋白翻譯中存在的細胞錯誤也可能影響其三級結(jié)構(gòu)，從而間接影響重組蛋白生物活性。為了在大腸桿菌中獲得經(jīng)合適折疊加工且具有生物活性的藥用蛋白，這篇綜述中，我們將關(guān)注關(guān)鍵生化參數(shù)“理想調(diào)制”的內(nèi)容，包括大腸桿菌中密碼子偏好性、蛋白質(zhì)翻譯、分子伴侶及翻譯后修飾。

表1　大腸桿菌生產(chǎn)的生物藥物歸納表

1　大腸桿菌中密碼子偏好性

細胞質(zhì)中同源氨基酰化tRNA的水平可以顯示大腸桿菌中密碼子偏好性。較多的密碼子在基因組中能普遍存在，也能高水平地進行表達。稀有密碼子在基因組中也能經(jīng)常遇到，其表達水平較低，在大腸桿菌中稀有的密碼子在真核生物的基因組中卻是豐富存在的。含有稀有密碼子的外源基因表達時會出現(xiàn)翻譯錯誤，這是由于在相關(guān)位點上存在核糖體衰減，在這些位點上氨基酸和稀有密碼子tRNA耦合，這種現(xiàn)象不能避免［3］。此外，由于外源基因上稀有密碼子存在而導致的翻譯錯誤可能包括氨基酸替代、翻譯的移碼突變或提前終止等［4，5］。Kane等［6］發(fā)現(xiàn)在框架內(nèi)，稀有AGA密碼子中兩個氨基酸會存在跳躍現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的質(zhì)量很大程度上被密碼子的偏嗜性影響，這是由于賴氨酸并入了AGA密碼子處的精氨酸［7］。因此，如果蛋白的質(zhì)量由于翻譯錯誤存在瑕疵，即使處于非常高的水平，重組蛋白的表達也是無用的。在大腸桿菌中問題最多的稀有密碼子是AGA、AGG、CGG、CGA、CGG（精氨酸）、AUA（異亮氨酸）、GGA（甘氨酸）、CUA（亮氨酸）、CCC（脯氨酸）和AAG（賴氨酸）［8］。已經(jīng)有記錄表明，稀有精氨酸密碼子AGG和AGA，在大腸桿菌中分別出現(xiàn)的頻率為0.14％和0.21％［9］。

現(xiàn)有幾種方法可以用來避免大腸桿菌中密碼子的偏嗜性。一種方法是基于密碼子偏好性去合成全基因組，這是目前首選的能改善大腸桿菌中外源蛋白表達的方法［10］，但這一方法全基因合成的花費較高。另一種方法是利用外源基因序列的定點誘變產(chǎn)生密碼子，然而，這一方法昂貴且隨機性強，因為無論何時總有幾個核苷酸需要被修正。第三種策略則通過大腸桿菌菌株與能編碼tRNA的質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)化，最終同源得到稀有密碼子［11］。通過增加限制性tRNA的拷貝數(shù)，大腸桿菌就能匹配外源基因中密碼子的偏好性頻率。幾種商業(yè)化質(zhì)粒，如pRARE，現(xiàn)在已被用于大腸桿菌中稀有tRNA的共表達。另外，這些質(zhì)粒中包含p15A復制起始位點，該復制起始位點可以維護存在Cole1復制起始位點的大腸桿菌菌株。幾種可用的商業(yè)化菌株如BL21 （DE3）Codonplus-RIL，BL21（DE3）codonPlus-RP 和Rosetta（DE3），這些菌株的質(zhì)粒含有編碼tRNA為稀有密碼子的基因序列［12］。這一方法在提高重組人干擾素的生產(chǎn)上已有應(yīng)用。含有人類干擾素-α2a基因和argU基因的質(zhì)粒能編碼稀有tRNA為精氨酸（AGG/AGA），大腸桿菌BL21（DE3）的共轉(zhuǎn)化會導致IFN-α2a和重組蛋白具有更高水平的表達，這些蛋白可占總蛋白的25％［13］。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)在替換稀有精氨酸密碼子為更常使用的密碼子后，人干擾素2 b的產(chǎn)量會增加9.5-11.5倍［14］。含有pRARE質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta（DE3）菌株也被用來表達不同的人源蛋白，研究表明實驗的68種蛋白中的35種其重組蛋白產(chǎn)量都能急劇增加［15，16］。

2　蛋白質(zhì)翻譯

大腸桿菌中有效的翻譯起始位點需要一個核糖體結(jié)合位點（RBS），核糖體起始位點包括Shine-Dalgarno（SD）序列和翻譯起始密碼子［5］。Shine-Dalgarno（SD）序列一般位于起始密碼子AUG上游的第7-9個核苷酸［17］。當翻譯起始位點從含有共識（Shine-Dalgarno，SD）序列AAGGAGG的mRNA開始時會更有效，核糖體結(jié)合位點的二級結(jié)構(gòu)對于翻譯起始非常關(guān)鍵，而翻譯效率通過大量存在的胸腺嘧啶和腺嘌呤會進一步增加［18］。翻譯起始位點的效率同樣也受到起始密碼子后核苷酸的影響，并發(fā)現(xiàn)腺嘌呤在高度表達的基因中會普遍存在［19］。故翻譯起始會受到各種因素的影響，包括共識的SD序列，起始密碼子的核苷酸上游，核糖體結(jié)合位點的二級結(jié)構(gòu)在內(nèi)［20］。阻止核糖體連接的mRNA的二級結(jié)構(gòu)在很大程度上可能會影響蛋白表達［21］。同樣也觀察到單一堿基的變化會破壞靠近SD區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)，也會導致RNA噬菌體MS2外殼蛋白表達水平發(fā)生500倍的改變。Seo和Park等［22］已開發(fā)一種極有效和簡單的方法去設(shè)計5'-非翻譯區(qū)（5' UTR），這能用于大腸桿菌中的可調(diào)表達，因為含有SD和AU序列的5' UTR在蛋白翻譯中發(fā)揮顯著的作用，重裝蛋白的表達水平能被5' UTR區(qū)域中簡單變化所操縱。研究發(fā)現(xiàn)，mRNA中的二級結(jié)構(gòu)能被RNA解旋酶破壞，如大腸桿菌的DEAD蛋白質(zhì)。

研究表明，從T7啟動子起始時，DEAD蛋白質(zhì)的表達會將β-半乳糖苷酶表達量增加30倍，但在lac啟動子起始時，表達水平卻沒有顯著增加［23］。然而當DEAD蛋白質(zhì)不表達時，從T7啟動子起始的β-半乳糖苷酶的表達與lac啟動子相比，雖然最終轉(zhuǎn)錄率增加10倍，但表達量卻減少10倍［24，25］。所以DEAD-box蛋白質(zhì)在穩(wěn)定mRNA時發(fā)揮了重要作用，因此DEAD-box蛋白質(zhì)能被用以改善伴有疑似問題mRNA二級結(jié)構(gòu)的基因表達。

在細菌基因組中，UAA是使用最頻繁的終止密碼子；其次是UGA和UAG。在翻譯過程中，閱讀終端密碼子中的一個錯誤會延長蛋白合成，直到mRNA中另一個終止密碼子出現(xiàn)。連讀會導致含有額外C末端氨基酸的肽的合成，在人IFN-α2b中若用UGA替換UAA，蛋白表達水平會增加2倍［26］。研究表明，轉(zhuǎn)錄終止子能通過在mRNA的3'末端產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)使mRNA穩(wěn)定。在大腸桿菌中，終止密碼子UAA更為普遍地用于翻譯終止。通過增加連續(xù)終止密碼子或使用一個延長的UAAU終止密碼子，翻譯終止的效率能得到改善［27］。蛋白合成過程中的翻譯錯誤能導致框架遷移突變、過早截斷、更低的表達量和氨基酸的錯誤摻入，會對大腸桿菌中重組蛋白質(zhì)量產(chǎn)生不利影響，而高水平表達和正確的表觀分子質(zhì)量卻不能保證重組蛋白的翻譯完整［28，29］。

3　優(yōu)化蛋白折疊的分子伴侶

使用大腸桿菌宿主進行生物藥物生產(chǎn)時遇到的一個主要問題是：異源蛋白質(zhì)主要以不溶性聚集物包涵體的形式進行積累。而從這些包涵體中提取重組蛋白是一個冗長、繁瑣的過程，需要一系列變性和復性步驟才能獲得可溶并正確折疊的重組蛋白。一種改善大腸桿菌中蛋白質(zhì)溶解度的策略是使用分子伴侶。在蛋白質(zhì)合成過程中，通過分子伴侶和新生多肽鏈的相互作用阻止折疊過程中的聚集。一些分子伴侶能阻止蛋白聚集，而一些能促進折疊錯誤的蛋白重新折疊和溶解［30］。在大腸桿菌中應(yīng)用最廣泛和重要的細胞質(zhì)伴侶是DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL和GroES和觸發(fā)因素（表2），這些伴侶能單獨及組合使用，用以改善大腸桿菌中蛋白質(zhì)的溶解度［31，32］。改善蛋白質(zhì)再折疊的最有效并已廣泛使用的伴侶組合是GroEL-GroES和DnaK-DnaJGrpE［33-35］。另外觀察到DnaK-DnaJ-GrpE能協(xié)助未折疊蛋白的釋放，GroEL-GroES能阻止肽的降解，觸發(fā)因素與GroEL合作能改善GroEL和底物的結(jié)合，從而促進蛋白的折疊［36］。其他的伴侶如ClpB（Hsp 100），與DnaK組合后能增溶蛋白并防止其聚集［37］。其他熱休克蛋白，如IpbA和IpbB，也能阻止熱變性蛋白聚集。為了改善大腸桿菌中重組異源蛋白的生產(chǎn)，應(yīng)該分析分子伴侶的不同組合，從而確定最有效的組合方式。研究表明，Skp和FkpA伴侶的共表達會增加大腸桿菌中抗體片段的溶解度［38］。相關(guān)信息表明GroEL-GroES的共表達會導致65％的抗B型利鈉肽單鏈抗體（scFV）能以可溶形式存在，這一組合的可溶產(chǎn)量會比無伴侶時高2.4倍［39］。

表2　在大腸桿菌中用來改善蛋白溶解度的分子伴侶種類

另一種策略為通過降低生長溫度來提高重組蛋白的溶解度［40］。在較低溫度下生長會降低蛋白合成速度，也會阻止胞漿中折疊中間體的聚集。此外，它也能通過阻止分子內(nèi)和分子間的疏水性改為相互作用去減少包涵體的形成，從而減少蛋白的聚集［41］。此方法已有效地提高了干擾素α-2、人生長激素及Fab片段等藥用蛋白的溶解度［42，43］。為便于大腸桿菌中可溶重組蛋白的生產(chǎn)，也可優(yōu)化表達載體、啟動子及表達宿主的選擇，融合標簽的應(yīng)用、蛋白合成速度、培養(yǎng)基組成、誘導濃度和時間等參數(shù)［44-46］。研究表明，異源蛋白分泌到大腸桿菌的周質(zhì)中可能會提供一個生產(chǎn)復雜藥用蛋白的機會。因為周質(zhì)中的Dsb蛋白家族會幫助形成二硫鍵和氧化周質(zhì)環(huán)境，從而促進異源蛋白的正確折疊。除此之外，周質(zhì)中含有的極少宿主蛋白和低蛋白水解活性物質(zhì)有利于下游加工，最終能獲得高收益的藥用蛋白。通過周質(zhì)分泌，各種藥用蛋白已經(jīng)被研制成功，如商業(yè)化Fab片段、Leucentis和Cimza，以及一些全長無糖基化的抗體和scFvs［47］。OmpA、LamB、PhoA、STII、PelB 和木聚糖酶等分泌信號已被用于靶向大腸桿菌周質(zhì)中的異源蛋白。Yim等［48］利用木聚糖酶信號肽去獲得了高水平表達的粒細胞集落刺激因子（G-CSF），其在大腸桿菌周質(zhì)中的產(chǎn)量能達4.2 g/L。另一個研究報道使用LamB信號肽后胰島素樣生長因子I（IGF）在周質(zhì)中能高水平表達，其產(chǎn)量能達4.3 g/L［49］。除了信號肽，周質(zhì)分泌的效率也依賴于大腸桿菌菌株、啟動子強度和生長溫度。在一些情況下，一些周質(zhì)伴侶如二硫鍵氧化酶（DsbA）、異構(gòu)酶（DsbC）和肽基異構(gòu)酶的共表達能提高大腸桿菌中異源蛋白的產(chǎn)量。Reilly等［50］報道DsbA和DsbC的過表達能改善周質(zhì)中全長抗體重輕鏈的組裝效率，也能增加產(chǎn)量從0.1-1.05 g/L。另一個研究報道：當anti-CD20 scFv和周質(zhì)伴侶Skp共表達時，anti-CD20 scF的產(chǎn)量隨著改進的抗原結(jié)合親和力而增加［51］。Lee等［52］報道了大腸桿菌中一種全長IgG有效表達系統(tǒng)的發(fā)展，研究表明5' UTR序列的修飾和DsbC折疊酶的共表達會導致重輕鏈具有極高的表達水平，并且IgG組件在周質(zhì)中也被顯著改善。在高度優(yōu)化的條件下，最終制備出全組裝和功能上活躍的IgG，其產(chǎn)量高達362 mg/mL。這些研究清楚地表明，未來通過合適的工程加工，大腸桿菌宿主最終能高效及省時生產(chǎn)藥用克隆抗體。

4　翻譯后修飾

生物技術(shù)專家多會在藥用蛋白大規(guī)模生產(chǎn)中選擇大腸桿菌。然而，若大腸桿菌中沒有翻譯后修飾（PTMs）過程，就會限制其生產(chǎn)重組生物藥物。糖基化、磷酸化等翻譯后修飾對于蛋白的功能活性非常關(guān)鍵，但由于缺乏PTM細胞機器，在大腸桿菌中這些修飾過程不能發(fā)生［53，54］。蛋白質(zhì)的N-連接糖基化是真核生物中最重要的翻譯后修飾方式之一。Wacker等［55］在微生物空腸彎曲菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的N-連接糖基化途徑，也將功能活躍的N-連接糖基化途徑成功地轉(zhuǎn)入大腸桿菌中?？漳c彎曲菌含有pgl基因簇，這一基因簇在各種糖蛋白的合成中會涉及到。通過向大腸桿菌中成功轉(zhuǎn)入pgl途徑，大腸桿菌生產(chǎn)了各種糖基化蛋白。雖然細菌的N-聚糖結(jié)構(gòu)與真核生物中不一樣，但把空腸彎曲菌的糖基化途徑轉(zhuǎn)入大腸桿菌的分子工程已經(jīng)為在大腸桿菌中表達糖化蛋白鋪平了道路［56，57］。Valderrama-Rincon等［56］已經(jīng)成功在大腸桿菌中設(shè)計了真核的糖基化途徑，包括酵母尿苷、二磷酸-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶Alg13和 Alg14、甘露糖Alg1 和 Alg2，以及從空腸彎曲菌中得到的寡糖PglB在內(nèi)的4種真核糖基轉(zhuǎn)移酶，在大腸桿菌中共表達用來合成能成功轉(zhuǎn)移到靶向真核蛋白中天冬酰胺殘基上的聚糖。這一方法也可用來開發(fā)針對多種細菌病原體的糖綴合物疫苗，與目前基于化學物質(zhì)的疫苗生產(chǎn)方法相比，這種替代方法更高效和方便。目前，使用這一技術(shù)開發(fā)的痢疾桿菌O1復合糖疫苗已經(jīng)成功通過I期臨床試驗。初步的療效和安全性研究已經(jīng)證明糖綴合物疫苗雖然安全，但能引起強烈的免疫反應(yīng)。最終利用空腸彎曲桿菌N-連接糖基化體系生產(chǎn)出同時能針對革蘭氏陰性和陽性病原體的糖綴合物疫苗［28，58-61］。

5　展望

目前雖然生產(chǎn)重組蛋白的酵母、哺乳動物細胞系和轉(zhuǎn)基因動植物中存在不同的表達系統(tǒng)，但是改善大腸桿菌表達系統(tǒng)的相關(guān)技術(shù)仍在不斷出現(xiàn)。大腸桿菌系統(tǒng)中遺傳操作方便、基因組充分表征、宿主菌株種類多、成本較低、表達水平高等優(yōu)點促使優(yōu)化大腸桿菌中異源蛋白的生產(chǎn)。但偏置密碼子偏好性、蛋白質(zhì)溶解度、mRNA穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)等限制因素會妨礙大腸桿菌系統(tǒng)過表達異源基因。因為異源蛋白中稀有密碼子存在而出現(xiàn)的翻譯錯誤會導致氨基酸取代或移碼突變，最終出現(xiàn)不期待的產(chǎn)品，所以重組蛋白密碼子偏好性在確定其表達水平上起著關(guān)鍵作用。在基因組中替換稀有密碼子為常見密碼子能加強大腸桿菌中治療蛋白的表達。同樣，稀有密碼子的tRNA編碼基因的共表達能夠增加大腸桿菌中治療蛋白的表達水平。此外，異源蛋白的周質(zhì)分泌會帶來折疊和溶解度適當、純化方便、蛋白高產(chǎn)量等優(yōu)點。在大腸桿菌周質(zhì)中已生產(chǎn)被批準的治療用抗體片段，表明此方法在商業(yè)上可行。最近一系列研究已表明大腸桿菌菌株能針對每種藥用蛋白進行特異性改造，從而獲得高產(chǎn)量和高質(zhì)量的產(chǎn)品，最終會為人類的健康作出卓越的貢獻。

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（責任編輯 狄艷紅）

The Current Status and Future Perspectives of Production of Biopharmaceuticals in Escherichia coli

CAI Dong-mei GONG Guo-li
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021）

Escherichia coli is the most preferred microorganism to express heterologous protein for therapeutic use，as around 30％ of the approved therapeutic proteins are currently being produced using it as a host. Due to its rapid growth，high yield，cost-effectiveness，and easy scale-up process，E. coli is chosen as an expression host in biotech industry for large-scale production of proteins. However，codon preference in E. coli and absences of post-translational modifications，such as glycosylation，phosphorylation and proteolytic processing limit its use for the production of slightly complex recombinant biopharmaceuticals. On purpose of helping E. coli to produce more complex and also glycosylated proteins for therapeutic use，this review summarizes the several novel technological advancements meeting the requirements of biotech industry，mainly focusing on the process of E. coli glycosylating heterologous proteins and expressing complex proteins including fulllength glycosylated antibodies via those advancements. Further potential problems and prospects of futures researches are also discussed.

Escherichia coli；biopharmaceuticals；codon preference；molecular chaperones

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.007

2015-12-05

蔡東梅，女，碩士研究生，研究方向：中藥生物技術(shù)；E-mail：caidongmei328@163.com

龔國利，男，博士，教授，研究方向：應(yīng)用微生物技術(shù)；E-mail：gongguoli@sust.edu.cn