任怡菲高琴鄧婷婷李想黃文勝陳舜勝陳穎

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

基于數(shù)字PCR的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系精準定量檢測方法建立

任怡菲1，2高琴2鄧婷婷3李想2黃文勝3陳舜勝1陳穎3

（1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；3. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

為了促進轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的順利實施，對未獲我國農(nóng)業(yè)部批準的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系進行精準定量檢測方法研究，以保障我國進出口轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測監(jiān)管?；谵D(zhuǎn)基因水稻LL62品系外源插入片段和水稻基因組DNA的3'端旁側(cè)序列設(shè)計數(shù)字PCR檢測體系，建立了精準定量檢測方法。結(jié)果顯示，設(shè)計的引物探針反應(yīng)效率高，基于此建立的數(shù)字PCR方法高度特異于轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系檢測；方法可重復(fù)性好，生成微滴數(shù)相對標(biāo)準偏差（RSD）值介于0.60％-11.11％；準確度高，3個混合樣品（10％、1％和0.1％）測定值與真實值之間的偏差（bias）分別為0.12、0.09和0.10，相對標(biāo)準偏差（RSD）介于0.09％-10.31％。建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系微滴數(shù)字PCR定量檢測方法簡便快捷、特異性強、重復(fù)性好、準確度高，可準確有效地對農(nóng)產(chǎn)品和食品中轉(zhuǎn)基因水稻LL62成分進行精準定量分析。

轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系；微滴數(shù)字PCR；品系特異性；定量

自1996年國際上首次種植轉(zhuǎn)基因作物至今已有19個年頭，轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展可謂突飛猛進，截至2014年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達1.815億hm2［1］。由于公眾對轉(zhuǎn)基因作物食用安全和環(huán)境安全性的擔(dān)憂，很多國家和地區(qū)均實施了標(biāo)識管理措施，并設(shè)定了閾值。如歐盟等國實施強制性的轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽制度，歐盟和俄羅斯設(shè)定的閾值為0.9％［2，3］，日本和中國臺灣為5.0％［4，5］，韓國為3.0％［6］等；美國和加拿大實施自愿性的轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽制度；我國目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實施無閾值的強制性標(biāo)識制度［7］。為了促進標(biāo)識管理制度的順利實施，與之相對應(yīng)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品精準定量檢測方法的研制至關(guān)重要。

目前食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測方法多采用實時熒光PCR方法［8-11］，是通過標(biāo)準物質(zhì)制備的標(biāo)準曲線對未知樣品進行定量分析的方法［12］。然而，該方法由于影響因素較多，如標(biāo)準物質(zhì)和樣品間背景不同，標(biāo)準曲線線性范圍有限，低拷貝DNA擴增可重復(fù)性差等，常造成定量結(jié)果準確性差，偏差大［13-16］。

數(shù)字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）是近年來在實時熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的微量DNA 分子定量檢測新技術(shù)。dPCR是將PCR體系分配到足夠小的反應(yīng)單元中，實現(xiàn)每個反應(yīng)單元只有單個模板分子進行PCR擴增，再采用泊松分布原理，根據(jù)陽性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計算目標(biāo)分子拷貝數(shù)，實現(xiàn)絕對定量［17-19］。該方法降低了標(biāo)準曲線對測量結(jié)果產(chǎn)生影響等問題，降低了基體效應(yīng)，實現(xiàn)了PCR 擴增的樣品分離，消除了本底信號的影響，提高了低拷貝DNA的擴增靈敏度［20］。相比實時熒光PCR，數(shù)字PCR具有更好的測量獨立性，且無需任何校準物，具有更高的特異性、靈敏度、精確性和穩(wěn)定性。

轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系由拜耳公司研發(fā)，由于在基因組上重組bar基因從而耐受草銨磷除草劑。目前該水稻品系已在6個國家獲得了種植、食用、飼用等不同方面的批準［21］。但我國迄今還未對境外任何轉(zhuǎn)基因水稻品系頒發(fā)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書。因此在水稻進境檢測中，口岸重點關(guān)注我國未批準品系的檢測監(jiān)管，包括LL62品系。為此，本研究基于外源插入片段和水稻基因組DNA的3'端旁側(cè)序列，建立了轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性微滴式數(shù)字PCR定量檢測方法。

1　材料與方法

1.1材料

轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays L.）Bt11、MON98140、NK603和MON810品系，轉(zhuǎn)基因棉花（Gossypium）T304-40、GHB119和281-24-236×3006-210-23品系標(biāo)準物質(zhì)購于歐盟聯(lián)合研究中心標(biāo)準物質(zhì)與測量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）。轉(zhuǎn)基因棉花MON88913、MON531、MON15985和 MON1445品系，轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max）GTS40-3-2和MON89788品系以及轉(zhuǎn)基因水稻（Oryza sativa）LL62品系（0306-I5）標(biāo)準物質(zhì)購于美國油脂化學(xué)家協(xié)會（American Oil Chemists' Society，AOCS）。轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、KF6和KMD以及非轉(zhuǎn)基因水稻、棉花、大豆、玉米樣品由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院提供或本實驗室儲備。

1.2方法

1.2.1DNA提取 所有轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因植物材料均根據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒（Cat：#DP305-02，TianGen，北京）的操作方法進行基因組DNA提取。利用微量分光光度計（GE公司Nanovue Plus，美國）測定提取DNA溶液的濃度并通過測定A260/A280和A260/A230值來衡量提取的基因組DNA質(zhì)量。DNA稀釋至10 ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2混合樣品制備 為了驗證建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62 品系特異性微滴數(shù)字PCR定量檢測方法的精確度和準確度，本研究分別制備了含有10％、1％和0.1％ 3個百分比含量的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系成分混合樣品，標(biāo)記為S1、S2和S3。制備過程為：首先分別吸取20 μL 100％的LL62 DNA標(biāo)準溶液（10 ng/μL）和180 μL非轉(zhuǎn)基因水稻DNA溶液（10 ng/μL）置于1.5 mL離心管中，使用渦旋震蕩儀將其充分混合均勻，制成10.0％混合樣品S1；然后分別吸取10 μL混合樣品S1和90 μL非轉(zhuǎn)基因水稻DNA溶液（10 ng/μL）置于1.5 mL離心管中，使用渦旋震蕩儀將其充分混勻，得到1.0％混合樣品S2；最后分別吸取10 μL混合樣品S2和90 μL非轉(zhuǎn)基因水稻DNA溶液（10 ng/μL）置于1.5 mL離心管中，充分混勻后得到0.1％混合樣品S3。

1.2.3引物和探針設(shè)計及篩選 在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系的外源插入基因和基因組DNA鄰接區(qū)序列信息，得到3'端旁側(cè)序列（GenBank號為NC_008399.2）。由于數(shù)字PCR擴增對引物和探針的特殊要求，如擴增效率高、熒光信號強、本底低等，采用PrimerExpress2.0軟件設(shè)計轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系以及水稻內(nèi)標(biāo)準基因SPS的特異性引物和探針序列，以混合樣品S1（10.0％）DNA為模板，分別對多套轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性檢測體系進行測試，對比其反應(yīng)效率的高低、微滴生成的穩(wěn)定性等因素，篩選適宜的引物和探針，并與歐盟發(fā)布的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性檢測方法［19］進行比較。同時對水稻內(nèi)源標(biāo)準基因SPS的擴增體系也進行了篩選。引物及探針由上海輝睿生物科技有限公司合成并純化，引物和探針序列見表1。

表1　本研究使用的檢測引物、探針序列

1.2.4微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系及條件 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中1×ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）（美國Bio-Rad公司，Cat#186-3024）10 μL；上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL；探針（10 μmol/L）0.75 μL；超純水4.25 μL；DNA模板2 μL。

配制反應(yīng)混合液，并充分混勻后加入微滴發(fā)生板（美國Bio-Rad公司，Cat：#951020362），使用微滴發(fā)生器將反應(yīng)混合液制成約 2×104個微滴。為防止微滴破裂，用排槍緩慢吸取微滴轉(zhuǎn)移入96 孔PCR反應(yīng)板中進行PCR。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 1 min，40 個循環(huán)；98℃ 10 min。將反應(yīng)后的96孔板放入微滴分析儀（美國Bio-Rad公司）進行熒光測定和數(shù)據(jù)讀取，后采用Quantasoft分析軟件（美國Bio-Rad公司）計算微滴生成的個數(shù)，并計算出陽性微滴數(shù)，換算得到樣品濃度（拷貝/μL PCR產(chǎn)物）。

1.2.5特異性實驗 采用22種轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因植物材料，包括常規(guī)水稻、棉花、大豆和玉米樣品，轉(zhuǎn)基因水稻LL62、KMD、KF6和TT51-1品系，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2和MON89788品系，轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、MON98140、NK603和MON810品系以及轉(zhuǎn)基因棉花T304-40、GHB119、281-24-236×3006-210-23、MON88913、MON531、MON1445 和MON15985品系基因組DNA為模板，進行PCR擴增。每個樣品重復(fù)2次，采用微滴式數(shù)字PCR方法進行檢測，測試建立方法的特異性。

1.2.6可重復(fù)性實驗 為測試建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系微滴式數(shù)字PCR檢測方法的可重復(fù)性，取含有10％轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系的樣品DNA溶液（100 ng/μL），用0.1×TE（Tris-HCl，EDTA·Na，pH 8.0）緩沖液連續(xù)梯度稀釋至6個濃度：50、10、2、0.4、0.08和0.001 6 ng/μL，即121 000、24 200、4 840、968、193.6和38.72拷貝/μL水稻基因組DNA（根據(jù)1 ng≈2 420拷貝水稻單倍體基因組DNA計算［20］），分別擴增LL62品系特異性序列和內(nèi)源標(biāo)準基因SPS，每個濃度每個目標(biāo)設(shè)置3次平行重復(fù)，實驗共重復(fù)3次，共得到9個數(shù)值。然后分別計算標(biāo)準偏差（standard deviation，SD）和相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation，RSD）來判斷方法的可重復(fù)性。

1.2.7準確度、精確度測定 將含有不同比例轉(zhuǎn)基因水稻LL62成分的混合樣品S1（10％）、S2（1％）、S3（0.1％）的DNA，用微滴式數(shù)字PCR定量方法分別擴增LL62品系特異性序列和內(nèi)源標(biāo)準基因SPS，每個樣品重復(fù)測定3次，整個實驗重復(fù)3次。根據(jù)內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)計算轉(zhuǎn)基因含量，并計算測定值與真實值間的偏差（bias）、各平行重復(fù)之間的標(biāo)準偏差（SD）、相對標(biāo)準偏差（RSD）判定定量的準確度和精確度。

通過數(shù)字PCR儀運行后自動給出的內(nèi)源標(biāo)準基因SPS拷貝數(shù)（copies/μL）和LL62品系特異性序列的拷貝數(shù)（copies/μL），按照下列公式計算樣品中轉(zhuǎn)基因水稻LL62的相對含量［25］。

2　結(jié)果

2.1核酸提取結(jié)果

所有提取的植物基因組DNA經(jīng)微量分光光度計測定，DNA濃度在100-200 ng/μL之間，OD260/OD280值在1.8-2.0之間。結(jié)果表明，所提取的基因組DNA符合進一步定量檢測的要求。

2.2引物探針檢測體系比較

微滴生成是影響微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）擴增的關(guān)鍵步驟，只有微滴數(shù)大于10 000時，DNA分子的分布才能符合泊松分布的統(tǒng)計學(xué)原理，系統(tǒng)才可以對陽性和陰性微滴進行有效計數(shù)。首先對歐盟發(fā)布的方法和本實驗設(shè)計的方法進行擴增效果比對。兩個方法的上下游引物一致，但探針序列不同，分別為LL62-P1和LL62-P2。采用LL62-P1探針的測試結(jié)果表明生成的微滴數(shù)處于15 264-18 319之間，采用LL62-P2探針測試生成的微滴數(shù)處于15 833-18 964之間，均大于10 000，滿足ddPCR微滴的分析要求。ddPCR擴增形成的微滴如圖1所示。由圖1-A可見，采用LL62-P1進行的ddPCR反應(yīng)中，本底熒光值達到7 851.8-8 331.8，區(qū)間較寬，而陽性擴增獲得的熒光值介于14 197-14 488之間，陽性熒光擴增值與本底間差異約為6 000，差異偏小，陽性微滴和陰性微滴區(qū)分界限不明晰，對微滴的計數(shù)有一定影響；采用LL62-P2實施的反應(yīng)中，ddPCR本底熒光值介于3 514.5-3 556.1之間，變化范圍較小，且較LL62-P1擴增的本底熒光均值低4 500左右，生成的陽性微滴熒光值處于12 336-12 563之間，二者差異達到9 000左右，陽性微滴和陰性微滴界限分明，系統(tǒng)可更準確判讀出陽性微滴和陰性微滴數(shù)目（圖1-B）。因此，確定采用本實驗設(shè)計的LL62-P2擴增體系進一步進行轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系ddPCR定量檢測方法建立。

2.3特異性實驗

采用20個常見轉(zhuǎn)基因植物和常規(guī)植物基因組DNA為模板，對建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系數(shù)字PCR定量檢測方法的特異性進行測試。當(dāng)以真核生物18S rRNA引物/探針進行PCR擴增時，所有植物來源材料基因組DNA均有陽性微滴生成，微滴數(shù)在12 023-14 792之間，而陰性對照和空白對照無陽性微滴生成，表明提取的 DNA 適于用作微滴數(shù)字PCR 擴增。當(dāng)以水稻內(nèi)源基因SPS引物/探針進行PCR擴增時，只有以水稻材料來源的基因組DNA有陽性微滴生成，其他植物來源材料則無陽性微滴生成。當(dāng)以LL62品系特異性引物/探針進行PCR擴增時，只有LL62品系樣品有陽性微滴生成，而其他轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因植物樣品則沒有產(chǎn)生陽性微滴（表2）。因此，設(shè)計的水稻內(nèi)源SPS和 LL62 品系特異性擴增體系特異性好，可以進一步用于微滴式數(shù)字PCR定量檢測轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系。

表2　建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系數(shù)字PCR檢測方法特異性檢測結(jié)果

2.4可重復(fù)性實驗

定量PCR反應(yīng)的重復(fù)性反映所建立的數(shù)字PCR定量體系的穩(wěn)定性和可靠性。為此，本實驗取6個濃度的10％含量轉(zhuǎn)基因水稻LL62樣品DNA溶液（50、10、2、0.4、0.08 和 0.016 ng/μL）進行數(shù)字PCR反應(yīng)。根據(jù)軟件計算的陽性微滴數(shù)分析方法的可重復(fù)性。結(jié)果（表3）顯示，3次重復(fù)擴增生成微滴數(shù)的SD值介于1.00-264.49之間，RSD值介于0.60％-11.11％之間，DNA模板濃度越高，RSD值越小，RSD值均在可接受范圍內(nèi)（小于25％）［26］。因此，建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系ddPCR定量檢測方法微滴生成穩(wěn)定，可重復(fù)性好。

表 3 建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系數(shù)字PCR定量檢測方法可重復(fù)性測試

2.5定量的準確度、精確度實驗

配制3個百分比含量混合樣品S1（10.0％）、S2 （1.0％）和S3（0.1％），對混合樣品中LL62轉(zhuǎn)基因水稻成分的含量進行了定量測試。結(jié)果如表4所示，3個混合樣品S1（10.0％）、S2（1.0％）和S3（0.1％）的百分比含量測定值分別為11.23％、1.09％和0.09％；測定值與真實值之間的偏差（bias）分別為0.12、0.09 和0.10；每個混合樣品的3次重復(fù)之間的標(biāo)準偏差（SD）值介于0.01-0.02，相對標(biāo)準偏差（RSD）值介于0.09％-10.31％，均在可接受的范圍之內(nèi)，而且偏差較小。結(jié)果表明，建立的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性微滴式數(shù)字定量PCR檢測方法具有較好的特異性、可重復(fù)性、準確度和精確度，能夠有效的對混合樣品中LL62轉(zhuǎn)基因成分進行定性和定量檢測分析。

表4　轉(zhuǎn)基因水稻LL62盲樣測試結(jié)果

3　討論

近年來，隨著轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)識閾值制度和低水平混雜（low level presence，LLP）政策受到各國的關(guān)注，政策的實施很大程度上依靠轉(zhuǎn)基因成分的精準定量。目前對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的定量檢測方法一直采用基于標(biāo)準曲線的相對定量，但由于技術(shù)的固有問題，很難達到較高的精確度，尤其是轉(zhuǎn)基因成分含量低于1％水平時。近年發(fā)展起來的數(shù)字PCR定量檢測技術(shù)，雖然也是基于實時熒光PCR擴增，但由于擴增是在足夠小的僅容納一個反應(yīng)的微單元中進行，因此極大降低了反應(yīng)間的相互抑制，提高了反應(yīng)效率。

目前食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測方法多采用實時熒光PCR方法。如王渭霞等［9］建立了轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號定量檢測方法；汪秀秀等［22］建立了轉(zhuǎn)基因棉花GHB119品系特異性定量檢測方法；蘇長青等［27］建立了Bt63 實時熒光定量方法；吳永彬等［28］建立了轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2、玉米 NK603、油菜 RT73和水稻 TT51-1的定量檢測方法等。而這些方法定量下限多在0.5％及以上，有些方法定量下限雖能低至0.1％，但多基于質(zhì)粒標(biāo)準分子的定量結(jié)果為依據(jù)而非植物材料，因此檢測下限的局限性也使方法的應(yīng)用受到了限制。

與實時熒光PCR定量檢測方法相比，由于數(shù)字PCR是在足夠小的反應(yīng)單元中進行實時熒光PCR擴增，降低了反應(yīng)間的相互影響和相互抑制，可重復(fù)性好，穩(wěn)定性高；而且數(shù)字PCR方法采用直接計數(shù)的方法實現(xiàn)絕對定量，使定量結(jié)果更加準確，定量下限可低至0.1％或以下，而且由于數(shù)字PCR無需制備標(biāo)準曲線，節(jié)省人力物力。數(shù)字PCR方法的應(yīng)用對應(yīng)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品閾值制度和低水平混雜措施的實施更加有利。

目前國內(nèi)外采用數(shù)字PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因成分含量進行定量的研究還剛剛起步。Corbisier等［15］比較了數(shù)字PCR和實時熒光PCR兩種技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系定量檢測上的優(yōu)劣，認為數(shù)字PCR具有計量特性，在定量上有更大的優(yōu)勢。Burns等［29］采用經(jīng)驗證的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因成分檢測的qPCR反應(yīng)體系，評估了dPCR技術(shù)的絕對檢測限和定量限，并表明dPCR 可以更精確地測量拷貝數(shù)。另外，基于數(shù)字PCR技術(shù)，國內(nèi)外專家學(xué)者也進行了單細胞基因表達、臨床診斷、生物樣品種屬鑒定和基因拷貝數(shù)分析等領(lǐng)域研究［30-33］。

數(shù)字PCR作為更精確和更靈敏的DNA定量檢測新技術(shù)，實現(xiàn)了單分子DNA的絕對定量，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量分析提供了新的技術(shù)手段，也為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中低含量成分的檢測指出了一個新的潛在發(fā)展方向。我們期望在不遠的將來，這項技術(shù)的發(fā)展在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面發(fā)揮更大的作用。

4　結(jié)論

本研究基于3'端旁側(cè)序列，建立了轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性數(shù)字PCR定量檢測方法。對方法的適用性鑒定結(jié)果表明，建立的數(shù)字PCR方法特異于轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系檢測；方法可重復(fù)性好，生成微滴數(shù)的RSD值介于0.60％-11.11％之間，小于歐盟定量檢測限25％的要求；準確度高，3個混合樣品（10％、1％和0.1％）測定值與真實值之間的偏差（bias）分別為0.12、0.09和0.10，相對標(biāo)準偏差（RSD）值介于0.09％-10.31％。因此，本研究建立的基因水稻LL62 品系特異性微滴數(shù)字PCR方法可以用于我國口岸農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因水稻LL62成分的定性定量分析，加強相關(guān)部門對轉(zhuǎn)基因水稻及其制品的監(jiān)控、安全評價和風(fēng)險預(yù)警，同時也為我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的順利實施提供技術(shù)支持。

［1］ Clive J. 2014年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢［J］.中國生物工程雜志， 2015， 35（1）：1-14.

［2］ European Commission. Regulation（EC）No. 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed［J］. Official Journal of the European Union， 2003， L268：1-23.

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Establishment of Precisely Quantitative Method of Genetically Modified Rice LL62 Based on Digital PCR

REN Yi-fei1，2GAO Qin2DENG Ting-ting3LI Xiang2HUANG Wen-sheng3CHEN Shun-sheng1CHEN Ying3
（1. School of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135；3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176）

In order to promote the smooth implementation of labeling policy for genetically modified（GM）products，we study an precise quantitative detection method for the GM rice LL62 that has not been approved by the Ministry of Agriculture in China，aiming at guarantee the detection and supervision of GM agricultural products in export and import. A digital PCR（dPCR）detection system were designed based on the inserted exogenous fragment of LL62 and 3' flanking sequence of DNA of rice genome，and a precisely quantitative method was established. The results showed that the designed probes presented high efficiency，the developed dPCR method was highly specific for GM rice LL62 detection. The method was highly repeated，and the relative standard deviation（RSD）values of droplets' number ranged from 0.60％-11.11％. Results of the quantification of three blind samples showed that the bias between the true value and the measured value was 0.12，0.09 and 0.10，the RSD was 0.09％-10.31％，indicating that the accuracy was high. In conclusion，the established droplet dPCR method for GM rice LL62 detection is simple and convenient with high specificity，solid repeatability and high accuracy，and is suitable for precisely and effectively quantitative analysis of ingredients of GM rice or peeled rice LL62 in agricultural products and foods.

genetically modified rice LL62；droplet digital PCR；event-specific；quantification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.011

2015-12-01

科技部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2016ZX08012001-007）

任怡菲，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程；E-mail：yuki_ryf@163.com

李想，女，博士，高級工程師，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：idealne@163.com