楊銘　王勇　段金良

[摘要]目的：探討程序冷凍法冷凍精子在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）中的臨床結(jié)局及安全性。方法：回顧分析在本中心進(jìn)行IVF-ET治療的不孕夫婦的372個(gè)周期，分為4個(gè)組：用程序冷凍法冷凍精子行常規(guī)IVF共76個(gè)周期（A組），程序冷凍法冷凍精子行ICSI共92個(gè)周期（B組），同期新鮮精液行常規(guī)IVF周期97例（C組），新鮮精液行ICSI周期107例（D組），分別比較A組與C組、B組與D組的正常受精率、異常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率和畸形率。結(jié)果：與新鮮精液IVF-ET組相比較，程序冷凍法冷凍精子常規(guī)IVF組及ICSI組的正常受精率、異常受精率、卵裂率、妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率和畸形率等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）：但冷凍精子行ICSI組與新鮮精子行ICSI比較，優(yōu)質(zhì)胚胎率低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：用程序冷凍法冷凍精子助孕可以獲得與新鮮精子相似的結(jié)局，是一種較為安全可靠的精液保存方法，可用于IVF—ET術(shù)前精液冷凍保存。

[關(guān)鍵詞]程序冷凍法；精子冷凍；體外受精-胚胎移植

[中圖分類號(hào)]11697 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

精子冷凍作為一種常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于不孕癥的治療當(dāng)中。精液的預(yù)先冷凍可以減少取精困難的患者取卵日當(dāng)天的取精壓力，為取卵日當(dāng)天因?yàn)樘厥庠驘o法來醫(yī)院取精的男性患者提供方便，同時(shí)也可以保存患者在經(jīng)皮副睪穿刺取精（PESA）或睪丸穿刺取精（TESA）手術(shù)中獲得的精子，亦可以對(duì)有需要的患者（接觸毒物、放射性及癌癥放化療等）進(jìn)行生育率保存。如何提高精子冷凍技術(shù)水平、減少精子冷凍損傷與保持冷凍精子的正常功能是我們?cè)诠ぷ髦兄档藐P(guān)注的問題。而程序冷凍法是目前精子冷凍中較為常用的方法之一。本文回顧性分析了2009年1月至2013年10月在本中心進(jìn)行體外受精一胚胎移植（IVF-ET）的372個(gè)周期，探討程序冷凍法冷凍精子對(duì)IVF和ICSI臨床效果和安全性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

隨機(jī)選取2009年1月至2013年10月在我院生殖中心進(jìn)行不孕癥治療的患者共計(jì)372個(gè)周期，排除夫婦雙方染色體異常、女方卵巢反應(yīng)不良、子宮內(nèi)膜異位癥。根據(jù)是否冷凍和受精方式不同分為四組：用程序化冷凍法冷凍的夫精行常規(guī)1VF治療76個(gè)周期（A組）；用程序化冷凍法冷凍的夫精行ICSI治療的共92個(gè)周期（B組）；同期用鮮精常規(guī)行IVF-ET的97個(gè)周期（C組）；用鮮精常規(guī)行ICSI的107個(gè)周期（D組）。ICSI指證是：（1）嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥；（2）既往體外受精-胚胎移植周期（IVF-ET）受精率低（<30%）；（3）精子頂體反應(yīng)異常。患者在我中心進(jìn)行精子冷凍保存并簽訂知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 精液冷凍 男方清潔雙手后，手淫取精，將精液留取于無菌容器內(nèi)。精液液化后用梯度離心法300g×15min離心，吸取離心管底部精子沉淀，加入3mL ART-1006精子洗滌液（Quinn s，美國），200g×10min離心洗滌2次，留取精子沉淀0.2mL，緩慢添加精子冷凍液ART-8020（SAGE，美國）1：1，邊滴邊攪拌，將充分混勻的精子分裝入麥管中，放入程序冷凍儀CL-8800（CRYOLOGIC，澳大利亞）中運(yùn)行冷凍程序，完成冷凍后放入液氮中冷凍保存。

1.2.2 精液解凍 采用快速復(fù)溫法，從液氮罐中取出裝有冷凍精液的麥管，直接放入37℃水中復(fù)溫10min，加入3mL ART-1006精子洗滌液（Quinn s，美國），200g×10min離心洗滌2次，體外獲能2h后，行常規(guī)IVF或ICSI。

1.2.3 促排卯方案及卵子收集 選擇有助孕指征的患者，根據(jù)患者的情況選擇常規(guī)的長(zhǎng)方案、短方案或?yàn)槲⒋碳し桨赋怕?，?dāng)主導(dǎo)卵泡≥18mm或2個(gè)主導(dǎo)卵泡≥17mm時(shí)，當(dāng)晚肌注hCG（麗珠）10000IU后36h在B超下經(jīng)陰道取卵，在體視顯微鏡下檢出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs），于5%SPS的揀卵液反復(fù)沖洗后，放入含10%SPS的受精液中37℃、5%C02和95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后備用。

1.2.4 受精方法 根據(jù)男方精液情況選擇行常規(guī)IVF或ICSI。常規(guī)IVF：取卵后將卵子放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～6h，按每個(gè)卵子10萬條的比例加入洗滌好備用的精子進(jìn)行體外受精。ICSI：取卵后將卵子放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～6h，選取MⅡ期卵子注射之前準(zhǔn)備好的精子。

1.2.5 受精、卵裂、胚胎觀察和妊娠診斷 受精后16～20 h后觀察卵子受精情況，取卵后第2d或第5d進(jìn)行胚胎觀察與移植，移植胚胎數(shù)不超過3個(gè)。移植2周后，檢驗(yàn)血hCG了解是否妊娠，第35d行超聲檢查，見到孕囊并有心管搏動(dòng)為臨床妊娠。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，率的比較采用x²檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

本研究對(duì)268個(gè)周期的程序法冷凍精子進(jìn)行了回顧性分析，比較了程序法冷凍的精子與新鮮精子行常規(guī)IVF及ICSI的臨床效果，結(jié)果顯示各組患者年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

與新鮮精子IVF組相比較，冷凍精子IVF組的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率、畸形率等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但冷凍精子IVF組受精率低于新鮮精子IVF組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

冷凍精子ICSI組受精率、正常受精率、卵裂率、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、多胎率、畸形率等方面與新鮮精子ICSI組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但優(yōu)質(zhì)胚胎率低于新鮮精子ICSI組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P<0.05）。見表3。

3 討論

精子的冷凍保存是指在超低溫的環(huán)境下（-196℃）維持精子活性的方法。精子的冷凍技術(shù)經(jīng)過200多年的不斷發(fā)展和完善，目前已經(jīng)成為人類輔助生殖技術(shù)中的重要組成部分。冷凍精子應(yīng)用的領(lǐng)域主要有：（1）幫助放化療患者、日常接觸有毒有害物質(zhì)工作及將要進(jìn)行結(jié)扎術(shù)的男性保存其生育力。（2）在輔助生殖治療中，提前冷凍可能在取卵日取精失敗的患者的精子，待取卵日解凍。冷凍無精癥患者通過活檢穿刺取得精子，避免下次取精失敗。（3）建立人類精子庫，為患有無精癥或嚴(yán)重遺傳病的不孕夫婦提供健康精子進(jìn)行供精人工受精或供精體外受精治療。

人類精子經(jīng)過和冷凍保護(hù)劑的混合、冷凍降溫、超低溫儲(chǔ)存和解凍復(fù)溫等過程，受到物理化學(xué)等一些列效應(yīng)作用，使精子功能不可避免的受到影響。程序冷凍法是目前精液冷凍中比較成熟的一種冷凍方法。通過程序化冷凍儀預(yù)先設(shè)定的程序可以使精子在一個(gè)恒定的速度下分步降溫：將處理好的精子加入冷凍保護(hù)劑中，放入程序冷凍儀中，通過泵入的液氮蒸氣，先以-1.5℃/min后以-6℃/min，從-20℃降到-80℃，最后投入到-196℃的液氮中保存。這種方法的優(yōu)點(diǎn)使精子細(xì)胞逐步適應(yīng)低溫環(huán)境，較為穩(wěn)定，可減少冷休克的發(fā)生，減少了人為因素的影響，缺點(diǎn)是耗時(shí)較長(zhǎng)。

本中心從2009年開始采用程序化冷凍法冷凍精子，冷凍精子原因主要是由于IVF術(shù)前部分男性患者為預(yù)防取卵日取精困難或男方外出無法取精等原因無法取得精液。研究顯示冷凍精子行常規(guī)IVF組的受精率低于新鮮精子行常規(guī)IVF組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這可能與精子在冷凍時(shí)容易受到冷凍損傷有關(guān)。降溫過程中細(xì)胞損傷有兩個(gè)機(jī)制，一是“胞內(nèi)冰晶損傷”，表現(xiàn)為胞內(nèi)生成冰晶，如果冰晶逐漸變大，細(xì)胞骨架和細(xì)胞器都會(huì)受到擠壓，對(duì)細(xì)胞造成不可逆的機(jī)械系損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另一個(gè)是“溶質(zhì)性損傷”，表現(xiàn)為細(xì)胞外的水分結(jié)冰，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度升高并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，由高滲引起細(xì)胞損傷。受到冷凍損傷的精子，會(huì)出現(xiàn)如：超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、頂體結(jié)構(gòu)異常、精子細(xì)胞膜完整性破壞、線粒體功能的損傷、DNA完整性損傷，從而導(dǎo)致精子活動(dòng)率降低，受精能力的下降。

本研究還顯示新鮮精子ICSI組的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于冷凍精子ICSI，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與常規(guī)IVF相比，ICSI避免了精卵細(xì)胞結(jié)合的復(fù)雜受精過程，降低了對(duì)精子活力和授精能力的需求，成為男性因素不育患者主要的治療方法。冷凍精子行ICSI過程中，注射的精子的染色體在解凍中會(huì)受到一定的損傷。Seli等研究證實(shí)，DNA受損的精子雖然保持有成功受精的能力，但會(huì)影響受精后胚胎的正常發(fā)育，導(dǎo)致胚胎在D3的評(píng)分中偏低，甚至發(fā)育停滯。結(jié)果提示ICSI作為一種侵入性的輔助治療手段，對(duì)胚胎的質(zhì)量有一定的不利影響。但臨床妊娠率卻未受到顯著影響，這說明了卵子和胚胎有著一定的DNA修復(fù)能力，可以修復(fù)部分受損害的配子。而胚胎修復(fù)精子DNA損傷能力的大小被認(rèn)為與卵母細(xì)胞的質(zhì)量和母系基因的完整性密切相關(guān)。

“試管嬰兒”出生結(jié)局一直引起國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，早期研究認(rèn)為IVF不增加后代先天畸形的危險(xiǎn)性，近來研究顯示ART子代出生缺陷發(fā)生率增加。Klemetti等研究認(rèn)為，全球通過IVF出生的兒童出生缺陷發(fā)生率可能比自然妊娠出生的兒童出生缺陷率高大約25%～30%。有研究發(fā)現(xiàn)ART的單胎兒中早產(chǎn)和低出生體質(zhì)量比自然妊娠更常見。但目前尚沒有強(qiáng)有力的證據(jù)證明解凍精子行ATR與用鮮精出生的子代結(jié)局有顯著差異。近年有研究發(fā)現(xiàn)，ICSI出生的男嬰存在出生缺陷的幾率加大，但冷凍精子ICSI是否會(huì)加劇這一缺陷的發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。本研究中四組的流產(chǎn)率、多胎率及畸形率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示程序法冷凍精子是一種較為安全可靠的冷凍方法，這與Oehninger等的研究結(jié)果類似。但由于本資料樣本例數(shù)較少，今后對(duì)于出生結(jié)局情況的進(jìn)一步研究仍需長(zhǎng)期大樣本資料的隨訪。

（收稿日期：2015-03-02）