王志超，韓 菲，朱秀玲，楊惠琴，趙勁松，魯亞平△

不同光周期對不同季節(jié)無蹼壁虎室旁核精氨酸催產(chǎn)素表達的影響*

王志超1，2，韓 菲1，朱秀玲3，楊惠琴1，趙勁松3，魯亞平1△

（1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ，蕪湖241000；2.塔里木大學(xué)動物科技學(xué)院 ，新疆 阿拉木843300；3.皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室 ，安徽蕪湖241000）

目的:比較不同光周期、季節(jié)、溫度對精氨酸催產(chǎn)素（AVT）在無蹼壁虎室旁核（PVN）晝夜表達的影響。方法 :將216條雄性成體無蹼壁虎分為活動期組和打破冬眠組，每組再分為3個光周期組 ，每組晝夜分6個時間點取樣 ，分別對AVT免疫組化陽性細胞在PVN的分布進行觀察和統(tǒng)計。結(jié)果:不同光周期下，AVT陽性細胞數(shù)在無蹼壁虎PVN均呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律變化，但變化的時相和幅度均有區(qū)別。結(jié)論 :AVT可能作為PVN輸出和整合信號參與調(diào)控?zé)o蹼壁虎的晝夜節(jié)律。

無蹼壁虎；晝夜節(jié)律；精氨酸催產(chǎn)素；室旁核

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.004

生物體的許多生化、生理和行為指標都呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性波動。研究顯示，晝夜節(jié)律多是受一種內(nèi)源性的“振蕩器”或“生物鐘”驅(qū)動。晝夜節(jié)律鐘通過中樞系統(tǒng)和外周系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)使機體晝夜節(jié)律保持與環(huán)境同步，這對于生物體對環(huán)境的適應(yīng)、健康和疾病都非常重要［1］。在哺乳動物，通常認為視交叉上核（SCN）是中樞系統(tǒng)中的核心成分，下丘腦室旁核（paraventricular nucleus，PVN）是介導(dǎo)光周期現(xiàn)象不可或缺的成分；而在爬行動物，多認為松果體是中樞系統(tǒng)中的核心成分［2］，PVN在介導(dǎo)光周期現(xiàn)象中的作用尚不清楚。

目前普遍認為精氨酸加壓素（arginine vasopressin，AVP）為哺乳動物生物鐘系統(tǒng)的重要而穩(wěn)定的輸出信號和整合信號［3］，不同光周期下在SCN的表達均呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性。精氨酸催產(chǎn)素（arginine vasotocin，AVT）作為AVP在爬行動物的同源物，在爬行動物下丘腦PVN是否呈現(xiàn)節(jié)律性表達尚未見報道。無蹼壁虎（Gekko swinhonis）在我國廣泛分布 ，近年來被廣泛用作實驗動物用于行為學(xué)、生理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的研究。本研究試圖比較不同光周期、季節(jié)、溫度對AVT在無蹼壁虎PVN晝夜表達的影響，進一步探討爬行動物晝夜節(jié)律的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

無蹼壁虎雄性成體（全長110～120 mm），購買于山東省濟南九頂山特種動物養(yǎng)殖公司，實驗室面包蟲喂養(yǎng)，水、食物自由攝取。

1.2 實驗分組

7月份購入的壁虎，選擇108條作為活動期組（AC）。AC組再分為DL（Dark:18:00-6:00，暗室內(nèi)黑厚窗簾布遮光；Light:6:00-18:00，350以上流明強光燈懸于2.2m左右處）、DD（Dark-Dark:18:00-6:00-18:00）、LL（Light-Light:18:00-6:00-18:00）三組，每組36只，設(shè)定溫度平均為（25±3）℃，兩周后，各組分別在7:00，11:00，15:00，19:00，23:00，3:00各取6只斷頭取腦。12月份購入的壁虎，選擇108條作為打破冬眠期組（IH）。IH組同樣分DL、DD、LL三個光周期組，每組36只，設(shè)定溫度平均為（15±3）℃，兩周后，各組分別在7:00，11:00，15:00，19:00，23:00，3:00各取6只斷頭取腦。所有腦組織迅速固定于新配制的4%多聚甲醛磷酸緩沖液（PBS PH 7.4）中 ，過夜后梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片（6 μm）。

1.3 免疫組織化學(xué)

切片脫蠟至水，置3%H2O2 PBS液中30min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；微波抗原修復(fù)2×10min；5%正常羊血清（Vector公司）孵育20min封閉非特異性反應(yīng)；一抗兔抗AVP （Truus公司 ，1∶400）37℃孵育1 h后于4℃冰箱過夜；二抗羊抗兔（Vector公司，1∶200），37℃溫育1 h；ABC復(fù)合物（Vector公司ABC kit，1∶200）37℃孵育1 h；DAB顯色；蘇木素染液復(fù)染。陰性對照片以0.01mol/L PBS代替一抗進行孵育，其余步驟同上。

1.4 陽性細胞計數(shù)

壁虎下丘腦連續(xù)切片，AVT免疫組織化學(xué)染色，觀察確定室旁核前后各一張切片:陽性細胞數(shù)為5±1個，然后在這兩張切片之間等間隔取5張切片進行計數(shù)，以估算室旁核AVT陽性細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

Nikon E800u顯微鏡觀察、拍照。Metamorph生物圖像分析軟件（Universal Imaging Corp.，美國）定量分析相關(guān)形態(tài)學(xué)參數(shù)，人工統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。統(tǒng)計數(shù)值用均數(shù)±標準差（±s）表示，SPSS 17.0進行ANOVA分析并作圖。

2 結(jié)果

AVT免疫陽性細胞主要分布在無蹼壁虎下丘腦的視上核（SON）和PVN（圖1，見彩圖頁Ⅱ），在下丘腦外側(cè)區(qū)、前腦外側(cè)束、室周核等處可見零散的分布。統(tǒng)計表明，無蹼壁虎視上核AVT免疫陽性細胞數(shù)目在不同時間點無明顯變化。

2.1 AC組和IH組室旁核AVT陽性細胞的晝夜節(jié)律性變化

在DL、DD、LL不同光周期下，AC組和IH組無蹼壁虎室旁核在不同時間點AVT陽性細胞數(shù)統(tǒng)計見表1，均呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性變化（AC組:分別為F=25.209，P＜0.01；F= 177.282，P＜0.01；F=62.671，P＜0.01；IH組:分別為F= 20.188，P＜0.01；F=136.494，P＜0.01；F=45.914，P＜0.01）。

Tab.1 AVT-ir cells in the PVN of Gekko swinhonis during different photoperiods in AC group and IH group（±s）

Tab.1 AVT-ir cells in the PVN of Gekko swinhonis during different photoperiods in AC group and IH group（±s）

AC:Active group；IH:Interfered hibernation group；DL:Dark-Light，11∶00 as a comparison reference；DD:Dark-Dark，19∶00 as a comparison reference；LL:Light-Light，15∶00 as a comparison reference*P＜0.05

Group　Time points　7:00 　11:00 　15:00 　19:00 　23:00 　03:00 AC　DL　137.0±7.5*　94.0±18.4　107.0±3.6　124.0±5.8*　143.0±6.3*　127.0±4.2*DD　76.0±9.4*　129.0±6.4*　170.0±10.3*　200.0±8.3　93.0±7.3*　132.0±8.4*LL　78.0±9.7*　130.0±9.9　138.0±7.6　143.0±8.7　88.0±9.7*　92.0±7.2*IH　DL　107.0±5.8*　70.0±7.9　95.0±8.9*　100.0±6.4*　105.0±5.5*　92.0±9.1*DD　87.0±5.0*　120.0±5.8*　142.0±6.2*　171.0±8.9　86.0±7.6*　123.0±6.9*LL　58.0±9.6*　113.0±9.8*　148.0±9.8　106.0±12.1*　94.0±10.9*　98.0±11.1*

2.2 在DL光周期下AC組與IH組無蹼壁虎室旁核AVT陽性細胞晝夜節(jié)律性比較

DL光周期下，AC組和IH組陽性細胞數(shù)分別在23∶00和7∶00達最大值（bonferroni test，P＜0.001），又分別在7∶00和23∶00出現(xiàn)另一個高峰，而最小值則均出現(xiàn)在11∶00。如圖2所示，AC組和IH組在DL光周期下曲線趨勢基本一致。所不同的是AC組曲線整體在IH組之上，AC組標準差XDL= 122.22，SDL=19.28；IH組XDL=94.83，SDL=14.17，獨立樣本方差檢驗顯示 P＜0.01，兩組間差異顯著。

2.3 在DD光周期下AC組與IH組無蹼壁虎室旁核AVT陽性細胞晝夜節(jié)律性比較

DD光周期下，AC組和IH組陽性細胞數(shù)在19∶00時均達最大值（bonferroni test，P＜0.001），分別在7∶00和23∶00達最小值，23∶00和7∶00左右分別出現(xiàn)一個低谷。如圖3所示，在DD光周期下AC組和IH組曲線趨勢基本一致。統(tǒng)計顯示，AC組標準差XDD=133.39，SDD=43.35；IH組XDD=121.40，SDD=30.90，獨立樣本方差檢驗顯示 P=0.182＞0.05，兩組間差異并不顯著。

Fig.2 Comparison of circadian changes of AVP-ir cells in the PVN of Gekko swinhonis during DL photoperiod between AC group and IH group

Fig.3 Comparison of circadian changes of AVP-ir cells in the PVN of Gekko swinhonis during DD photoperiod between AC group and IH group

2.4 在LL光周期下AC組與IH組無蹼壁虎室旁核AVP陽性細胞晝夜節(jié)律性比較

LL光周期下，AC組和IH組陽性細胞數(shù)分別在19∶00和15∶00達最大值（Bonferroni test，P＜0.01），均在7∶00達最小值。如圖4所示，在LL光周期下AC組和IH組曲線變化趨勢也基本一致。統(tǒng)計分析表明AC組標準差XLL=111.45，SLL=27.78；IH組XLL=102.58，SLL=28.78，獨立樣本方差檢驗顯示 P=0.188＞0.05，兩組間差異也不顯著。

3 討論

目前認為晝夜生物鐘機制可從振蕩器 （Oscillator）、信號輸入和信號輸出等角度加以研究。在確定振蕩器主控成分時 ，“振蕩器成分的數(shù)量和活動必定呈晝夜節(jié)律振蕩，且這種振蕩也可被授時因子導(dǎo)引”是其重要的準則。

Fig.4 Comparison of circadian changes of AVP-ir cells in the PVN of Gekko swinhonis during LL photoperiod between AC group and IH group

研究顯示，實驗性雙側(cè)毀損SCN可使哺乳動物一系列生理行為和活動的晝夜節(jié)律完全喪失［4］。大多數(shù)學(xué)者認為，SCN的AVP神經(jīng)元是哺乳動物內(nèi)源性起搏神經(jīng)元，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)機能的穩(wěn)定和機體晝夜生物節(jié)律的穩(wěn)定具有重要作用。然而，如同其它非哺乳類脊椎動物一樣，爬行動物SCN結(jié)構(gòu)是否存在目前仍然倍受爭議。一方面，脊椎動物腦區(qū)的解剖與命名沒有統(tǒng)一的標準，使得目前腦區(qū)的解剖學(xué)名稱混亂，另一方面目前尚沒有SCN特異性標記物。在大壁虎（Gekko gecko），該核團曾被描述為室周視前區(qū)（PPA）或下丘腦室周核（PH）或PVN。在哺乳動物，AVP陽性細胞在胚胎期13 d最先出現(xiàn)在間腦的第三腦室兩側(cè)，出生后1 d出現(xiàn)在SON，出生后3天開始出現(xiàn)在PVN，出生后15～20 d才開始出現(xiàn)在SCN［5］。鳥類胚胎發(fā)育研究也顯示，下丘腦AVT能神經(jīng)元最先出現(xiàn)在第三腦室的室周區(qū)，隨后向背側(cè)遷移形成室周核（室旁核），再向腹側(cè)遷移形成外側(cè)視上核和中央視上核（相當(dāng)于SCN）［6］。這提示下丘腦中SCN在系統(tǒng)發(fā)生上較晚。我們的尼氏染色顯示，無蹼壁虎在視交叉的上方、第三腦室腹側(cè)的視前區(qū)與下丘腦的過渡區(qū)并未發(fā)現(xiàn)明顯的SCN結(jié)構(gòu)，僅在視交叉上方第三腦室腹側(cè)可見一個較大的核團（PVN），AVT免疫陽性細胞主要分布在該核團的背內(nèi)側(cè)（圖1），結(jié)合其位置及纖維投射特點分析，提示無蹼壁虎腦區(qū)可能尚未分化形成真正的SCN，即無蹼壁虎的PVN可能具有哺乳動物PVN和SCN的雙重功能。

一般認為 ，在哺乳動物中，光信號與非光信號都可對生物鐘的調(diào)定產(chǎn)生影響［7］。當(dāng)外界明-暗環(huán)境突然變化，晝夜節(jié)律的波將發(fā)生明顯的時相遷移，這種特異反應(yīng)稱為生物鐘的重設(shè)定［7，8］。研究發(fā)現(xiàn)光信號只有在自主晝夜節(jié)律的夜間相才可以提前或延遲生物鐘的重設(shè)定［7］。我們的研究表明，與哺乳動物SCN的AVP免疫陽性細胞數(shù)變化類似，無蹼壁虎PVN的AVT免疫陽性細胞數(shù)，無論是AC組還是IH組，在DL或DD或LL光周期下，均呈現(xiàn)明顯的晝夜節(jié)律性；且在AC組和IH組的組內(nèi) ，與DD和LL光周期比較 ，在DL光周期下的時相向后延遲了4 h，波幅也較小。這也進一步印證了無蹼壁虎PVN可能具有類似哺乳動物SCN的功能。

溫度是爬行動物自由活動度重要的限制因子，也是爬行動物晝夜節(jié)律調(diào)控的一種重要的授時因子。Bons等［9］研究發(fā)現(xiàn)溫度（冷）處理可使沙蜥等爬行動物室旁核的AVT含量明顯下降。這與我們的結(jié)果基本一致。比較AC組和IH組無蹼壁虎PVN的AVT免疫陽性細胞數(shù)晝夜節(jié)律性變化可以看出，無論在DL、DD或LL光周期下，其節(jié)律變化曲線趨勢基本一致。但是在DL光周期下，AC組較IH組變化曲線整體上升，獨立樣本方差檢驗顯示兩者之間差異顯著（P＜0.01）；而在DD和LL光周期下，這種差異性不明顯（P＞0.05）。在我們的實驗中，IH組動物均于（15±3）℃下適應(yīng)了2周，較AC組溫度低了10℃左右。但溫度似乎在不同的光周期下對AVT的晝夜節(jié)律表達形成不同的影響，提示溫度可能要在光因子的協(xié)同作用下才能發(fā)揮其授時因子的作用，進而對爬行動物的晝夜節(jié)律進行調(diào)節(jié)。

垂體后葉激素是一類廣泛存在于脊椎動物各等級類群的保守性很強的激素［10］，AVT在無蹼壁虎PVN不同光周期的晝夜節(jié)律性表達，很可能在晝夜節(jié)律中起著與AVP在哺乳動物生物鐘中類似的功能，即是一種重要而穩(wěn)定的輸出信號和整合信號，參與調(diào)控爬行動物的晝夜節(jié)律。但AVT在爬行動物晝夜節(jié)律調(diào)控中的確切作用還有待進一步驗證。

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Gekko swinhonis； circadian rhythm； arginine vasotocin； paraventricular nucleus

Q955，Q416

A

1000-6834（2016）03-206-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（30470537）；重要生物資源保護與利用研究安徽省省級重點實驗室；生化與分子生物學(xué)省級重點學(xué)科；安徽高校省級自然科學(xué)研究重大項目

（ZD2008006-1）

2015-03-09

2015-11-02

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