崔琳琳，周一鳴，季紅斌，唐 文，周小理，*（1.上海商學(xué)院酒店管理學(xué)院，上海01499；.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海01418）

不同光質(zhì)對苦蕎萌發(fā)過程中的黃酮類化合物及其抗氧化活性的影響

崔琳琳1，2，周一鳴2，季紅斌2，唐 文2，周小理2，*
（1.上海商學(xué)院酒店管理學(xué)院，上海201499；2.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海201418）

本文以萌發(fā)3 d的苦蕎為實驗材料，通過紅光、黃光、綠光、白光、藍光、紫外A（254 nm）、紫外C（365 nm）七種不同的光質(zhì)處理萌發(fā)過程中的苦蕎，研究了不同光質(zhì)對萌發(fā)苦蕎中黃酮類化合物、抗氧化活性以及與黃酮合成和降解有關(guān)酶類的影響。實驗結(jié)果表明：經(jīng)紫外、藍光、白光、綠光、黃光和紅光處理均可顯著地增加苦蕎芽中總黃酮和蘆丁的含量（與暗處理比較），不同處理之間有顯著性差異（p＜0.05）。C段紫外（UV-C）處理后，苦蕎芽中總黃酮和蘆丁含量最高，與對照相比分別提高了30.1%、40.9%，藍光處理其次。同時，經(jīng)光處理后，苦蕎芽中黃酮類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）和察爾酮異構(gòu)酶（CHI）活性均顯著升高，與總黃酮和蘆丁含量呈現(xiàn)正相關(guān)。此外，苦蕎萌發(fā)過程中，光處理可增加苦蕎芽對DPPH自由基的清除率，最高可達35.1%，清除率與總黃酮含量呈正相關(guān)，表明光處理可以通過增加苦蕎芽中黃酮類物質(zhì)含量進而提高苦蕎的抗氧化活性。

苦蕎，萌發(fā)，光質(zhì)，黃酮類化合物，抗氧化

蕎麥屬雙子葉禾谷類作物［1］，主要分為甜蕎麥和苦蕎兩種［2］。苦蕎麥營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、膳食纖維、各類礦質(zhì)元素和人體必需的氨基酸，與其他一些糧食作物相比，具有獨特的營養(yǎng)優(yōu)勢［3］，并且廣受人們的喜愛。

光是植物生長中的重要環(huán)境因素，除了能夠控制光合作用外，還影響植物中諸多生物類活性物質(zhì)（如黃酮）的積累［4］，因此，利用調(diào)節(jié)光質(zhì)以提高產(chǎn)量或品質(zhì)已引起人們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在大豆秧苗生長過程中，黑暗和光照處理后大豆秧苗體內(nèi)，異黃酮的分布和含量均有明顯區(qū)別，光照可以顯著性地促進異黃酮的積累［5］。錢麗華［6］、李波等［7］研究發(fā)現(xiàn)：光照能夠誘導(dǎo)植物組織中黃酮類化合物的積累，光照條件下黃酮類化合物的含量是黑暗中的1.5～2倍［8］。同時，光對黃酮類化合物的影響同光質(zhì)也有一定的關(guān)系，王麗娟［9］、樊艷平等［10］發(fā)現(xiàn)在不同光膜的條件下，藍光最有利于類黃酮積累，紅光相對于綠光、黃光、中性光來說對類黃酮物質(zhì)的影響最小。Khatami［11］發(fā)現(xiàn)在圓葉錦葵細胞培養(yǎng)中，紫外可以顯著地增加圓葉錦葵細胞中黃酮和花青素含量。在低高原地區(qū)，報春花中的類黃酮含量在一定范圍內(nèi)隨UV-B輻射強度增加而增加［12］。Tsurunaga等［13］研究了不同色光對苦蕎萌發(fā)過程中的蘆丁和花青素的影響，結(jié)果表明白光、紅光、綠光、藍光、UV-A和UV-B均顯著性地增加了苦蕎中蘆丁含量。此外，在黃酮合成代謝過程中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和查爾酮異構(gòu)酶（CHI）是其合成的關(guān)鍵酶，其活性的也受光的影響。李元等［14］研究發(fā)現(xiàn)同一水稻在不同強度UV-B的輻射下，對水稻中PAL活性的影響不同，在一定范圍內(nèi)增加UV-B強度有利于增加水稻中PAL活性。花菜在冷藏的過程中，暴露于光中可提高其PAL活性［15］。王海偉等［16］在探究光照條件對不同粒色小麥籽粒花青素合成與積累的影響中發(fā)現(xiàn)未遮光處理的有色小麥，其不同時期籽粒花青素含量變化與PAL和CHI活性變化趨于一致，且呈顯著正相關(guān)，表明CHI與PAL是有色小麥籽?；ㄇ嗨睾铣傻年P(guān)鍵酶。

綜上所述，光質(zhì)可以顯著性地改變苗的生長以及苗中生物類活性物質(zhì)的含量。本文重點研究了不同光質(zhì)對萌發(fā)苦蕎中黃酮類化合物含量，包括影響黃酮類化合物合成與降解的相關(guān)酶類的變化，以及對其抗氧化能力的影響，為有效提高苦蕎的營養(yǎng)價值提供理論性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎（黑豐一號） 購自山西左云；乙二胺四乙酸（EDTA）、巰基乙醇、甘油、0.2 mol/L醋酸緩沖液（pH5.0） 國藥集團化學(xué)試劑上海分公司，AR級；L-苯丙氨酸 上海楷洋生物技術(shù)有限公司，BR級；蘆丁 Sigma-Aldrich，純度＞99%；槲皮素 Sigma-Aldrich，純度＞99%。

UV2600紫外可見光分光光度計、LC-20A高效液相色譜（包含SIL-20A自動進樣器，SPD-M20A檢測器 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；3-18K高速冷凍離心機 Sigma公司；SPX-300 IC微電腦人工氣候箱 上海博迅實業(yè)有限公司；FW-200A傾斜式高速萬能粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；有色塑料膜（紅，黃，藍，綠，透明） 市售；GL-9406型紫外燈 海門市其林貝爾。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎萌發(fā)處理 選種→清洗→浸種→光處理→催芽培養(yǎng)→定時采收。

選取飽滿的苦蕎籽粒，用潔凈水洗凈籽粒表面塵土，再用2%次氯酸鈉浸泡消毒5 min，最后用去離子水洗凈。消毒后種子在30℃條件下，清水浸泡6 h，再沖洗2～3次，25～30℃下進行催芽，每間隔10 h淘洗一次，24 h后種子中可見有白色芽露出時鋪種。將種子鋪于放置有紗網(wǎng)的白磁盤中，置于30℃人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)。從鋪種時算起，連續(xù)培養(yǎng)3 d后取樣。并將苦蕎芽去殼放入-80℃冰箱里冷凍保存。

1.2.2 光質(zhì)處理 在萌發(fā)過程中，每天分別用紅、黃、藍、綠、透明色膜以及紫外燈（紫外A、紫外C）7種不同光質(zhì)處理萌發(fā)的苦蕎1 h，以黑暗作為對照。萌發(fā)3 d后將籽粒脫殼后冷凍干燥粉碎，4℃下保存?zhèn)溆谩嶒炛貜?fù)三次。

1.2.3 萌發(fā)苦蕎中黃酮類化合物提取及測定 將萌發(fā)苦蕎去皮經(jīng)真空冷凍干燥后研磨成粉。稱取1 g干粉，用50 mL、70%的乙醇溶液于70℃水浴下振蕩提取6 h，將提取液于3000 r/min離心10 min，取上層清液于4℃下保存?zhèn)溆谩｜S酮類化合物含量測定參照賓婕［17］的方法略有修改。色譜條件：反相C18柱（4.6 mm×150 mm），流動相為乙腈和磷酸（5%，v/v）為流動相，檢測波長256 nm，流速為1 mL/min測定蘆丁含量，流速為0.8 mL/min測定槲皮素含量。所有的樣品用0.22 μm濾膜過濾之后進樣，進樣量為10 μL。用純度比較高（＞99%）的蘆丁和槲皮素做標(biāo)品，每個樣品重復(fù)測量3次取平均值。

1.2.4 萌發(fā)苦蕎抗氧化活性的測定 采用DPPH自由基清除法［18］。

1.2.5 酶的提取與測定

1.2.5.1 粗酶液的提?。?9］取去殼鮮芽樣品1 g于冰浴中，加10 mL的0.1 mol/L的硼酸硼砂緩沖液（pH8.8，內(nèi)含1 mmol/L的EDTA，5 mmol/L的巰基乙醇，1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），1%的甘油），研磨成勻漿；12000 r/min，4℃冷凍離心20 min；取上清液（即為粗酶液）立即使用或者-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活力的測定 參考文獻［20］，在290 nm處測定吸光度，并計算酶活。每個樣品重復(fù)測量3次取平均值。

1.2.5.3 查爾酮異構(gòu)酶（CHI）酶活力的測定 參考文獻［21］，在381 nm處測定吸光度，并計算酶活。每個樣品重復(fù)測量3次取平均值。

1.2.5.4 粗酶液中蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍（G-250）法測定。

1.2.5.5 酶比活力的計算 酶比活力=酶活單位（U）/蛋白（mg）

1.2.6 蘆丁降解酶（RDEs）的提?。?2］與測定 稱取1.0 g冷凍干燥后苦蕎芽粉，加入5 mL提取緩沖液，于冰浴下充分研磨后放入4℃冰箱保存3 h，12000 r/min，4℃冷凍離心20 min，上清液即為RDE粗酶提取液，立即使用或保存于4℃冰箱備用。

RDEs酶活性的測定方法參照Morishita［22］和Chen［23］的方法。每個樣品重復(fù)測量三次取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（One Way ANOVA），以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并運用Origin 9.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁與槲皮素的色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.3分析程序，得到蘆丁和槲皮素標(biāo)品的HPLC圖（圖1）。以峰面積為縱坐標(biāo)，蘆丁或槲皮素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出蘆丁或槲皮素的線性回歸方程（表1），結(jié)果表明該方法的回歸系數(shù)較高，可滿足后續(xù)實驗的精度要求。

表1 蘆丁與槲皮素線性回歸方程Table1 The standard regression line equation of rutine and quercetin

圖1 苦蕎HPLC圖Fig.1 HPLC chromatography of Tartary buckwheat

2.2 光質(zhì)對萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的影響

圖2為不同光質(zhì)對萌發(fā)苦蕎中黃酮類化合物含量的影響，由圖2可以看出，相對于黑暗來說，經(jīng)紫外、藍光、白光、綠光、黃光和紅光處理均可顯著地增加苦蕎芽中總黃酮含量，不同光質(zhì)處理之間也均有顯著性差異（綠光與黃光處理除外）。其中，C區(qū)紫外（UV-C，254 nm）處理后，苦蕎芽中總黃酮含量最高，達到35.13 mg/g干重，與對照相比提高了30.1%，其次分別為白光、藍光、綠光、黃光、A區(qū)紫外（UV-A，365 nm）和紅光，其中紅光對萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的影響最小，綠光與黃光處理之間無顯著性差異。此結(jié)論與徐茂名、王麗娟等［9，24］的結(jié)果類似。同時，在光譜中，紅光、黃光、綠光、藍光、紫外的波長是依次減小，據(jù)此可以認為波長越短，越有利于像黃酮這類次級代謝產(chǎn)物的積累。

圖2 光對萌發(fā)苦蕎中總黃酮含量的影響（3 d）Fig.2 Effect of different light quality on total flavonoids content in tatray buckwheat sprouts（3 d）

2.3 光質(zhì)對蘆丁、槲皮素含量以及抗氧化活性的影響

蘆丁是苦蕎中最重要的黃酮類物質(zhì)，由表2可知，與對照（黑暗）相比，紅光、黃光、藍光、綠光、白光、紫外A、紫外C都可以顯著促進蘆丁的積累。其中，C區(qū)紫外（UV-C，254 nm）對蘆丁的影響最大，3 d內(nèi)使苦蕎芽中蘆丁提高了40.9%，紅光影響最弱（提高了12.3%），其余依次為白光、藍光、UV-A、黃光和綠光，分別提高了24.7%、23.7%、23.4%、19.2%、18.8%。此外，光處理對苦蕎芽中槲皮素、蘆丁含量影響不同，綠光處理對槲皮素含量的影響最大，達到5.59mg/g（干重），提高了20.7%。其次是UV-C處理，提高了10.6%，達到5.14 mg/g（干重）。而紅光、黃光、白光、藍光處理對槲皮素含量的影響與對照無顯著性差異。同時，蘆丁與槲皮素作為苦蕎黃酮類物質(zhì)中的主要組分，光處理分別改變了蘆丁或槲皮素組分在總黃酮中的比例，但二者總量在總黃酮提取物中的比例未見顯著性地增加（從85.5%增加到87.0%）。與對照相比，光處理均提高萌發(fā)苦蕎清除DPPH自由基能力，各處理間存在顯著性差異。UV-C處理的清除DPPH自由基能力最強，相對于對照提高了35.1%。

表2 不同光質(zhì)對蘆丁、槲皮素含量以及DPPH影響Table2 Effect of different light quality on rutin content，quercetin content and DPPH

苦蕎抗氧化能力體現(xiàn)主要是通過蘆丁清除自由基來實現(xiàn)的［25］，蘆丁含量的高低直接影響DPPH自由基清除能力，光處理對萌發(fā)苦蕎清除DPPH自由基能力的影響如表3所示?？傸S酮含量和蘆丁含量分別與DPPH清除率呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.836和0.808。由此可知，光處理提高萌發(fā)苦蕎清除DPPH自由基能力是通過增加總黃酮含量和蘆丁含量實現(xiàn)的。

表3 總黃酮含量、蘆丁含量、槲皮素含量和DPPH清除率的相關(guān)性分析Table3 The correlation coefficient of total flavonioids，rutin，quercetin content and DPPH radical scavenging activity

2.4 光質(zhì)對黃酮合成以及降解有關(guān)酶的影響

PAL是苯丙烷類代謝的第一個酶，當(dāng)PAL酶活力升高，便伴隨著植物中黃酮類化合物的增加。另外，植物中PAL酶活力與黃酮合成中的其他酶也具有一定的聯(lián)系。PAL是典型的胞內(nèi)誘導(dǎo)酶，該酶受植物不同發(fā)育階段的內(nèi)部因素和外部生長環(huán)境兩個因素共同調(diào)控，對外部環(huán)境因子較敏感，其表達具有植物組織和發(fā)育時間特異性。光對苦蕎芽中PAL酶活性的影響如表4所示。不同光質(zhì)處理均能顯著地增加苦蕎芽中PAL酶的比活力（與暗處理比較），從134.99 U/mg蛋白上升到153.46 U/mg蛋白，均與對照差異顯著。紫外和藍光處理后，酶活性較高。PAL酶比活力的變化趨勢與總黃酮含量的變化趨勢基本一致，具有一定的相關(guān)性。結(jié)果表明：光照處理可提高黃酮類物質(zhì)合成的第一個關(guān)鍵酶PAL的活性，使物質(zhì)合成的代謝流向黃酮類次級代謝轉(zhuǎn)向，進而提高苦蕎芽中總黃酮含量。

CHI是加速非黃酮類物質(zhì)向具有生物活性的黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化的酶，對黃酮類活性物質(zhì)的代謝量具有重要意義。植物生長的外源性刺激對CHI酶的表達也有一定的影響，如溫度與金屬離子對植物中花色素苷的影響就是通過CHI酶的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的。光對苦蕎芽中CHI酶活性的影響如表4所示。不同光質(zhì)處理均能顯著地增加苦蕎芽中CHI酶的比活力（與暗處理比較），且各光處理之間具有顯著性差異。紫外、白光和藍光處理后酶活性較高，可達到對照處理的2～4倍。

RDEs是一種高活性的蘆丁分解代謝酶，是蘆丁代謝的關(guān)鍵酶之一，它將蘆丁水解為槲皮素。該酶具有嚴格的底物特異性，即其僅對蘆丁具有催化降解作用，易受外源性刺激，而影響到植物中的蘆丁含量。光對苦蕎芽中RDEs酶活性的影響如表4所示。光處理RDEs活性變化不大，其中，綠光處理對苦蕎芽中RDEs酶的比活力影響較大，藍光影響較小，而黃光、綠光和紫外處理之間沒有顯著性差異。同時，光照處理對槲皮素含量影響較小，蘆丁含量未下降，因此，經(jīng)光照處理后，蘆丁轉(zhuǎn)化成槲皮素的量很小。

綜上所述，不同光質(zhì)處理對苦蕎芽中PAL和CHI酶的比活力均有促進作用，說明光刺激黃酮類生物合成是因為提高了與其相關(guān)酶的活力。

表4 不同光質(zhì)對PAL、CHI、RDEs酶活力影響Table4 Effect of different light quality on the activity of PAL，CHI and RDEs

3 結(jié)論與討論

光處理是一種無殘留、無污染、簡單有效的處理方式。實驗結(jié)果表明：紫外（UV-A，UV-C）、藍光、白光、綠光、黃光和紅光處理均可顯著地增加苦蕎芽中總黃酮和蘆丁含量（與暗處理比較），其中紫外和藍光處理效果較好，但對槲皮素含量影響較小。同時，光處理能提高萌發(fā)苦蕎清除DPPH自由基能力，UV-C處理的清除DPPH自由基能力最強，相關(guān)分析表明光處理提高萌發(fā)苦蕎清除DPPH自由基能力是通過增加總黃酮含量和蘆丁含量實現(xiàn)的。

PAL和CHI作為黃酮合成關(guān)鍵酶，其活性變化跟總黃酮類物質(zhì)含量的變化有密切關(guān)系，PAL和CHI活性越高，總黃酮含量越高［21］。實驗得出，光照處理均能顯著地增加苦蕎芽中PAL、CHI酶的比活力（與暗處理比較），且PAL、CHI酶的比活力的變化趨勢與總黃酮、蘆丁含量的變化趨勢基本一致，具有一定的相關(guān)性。但是不同光照處理均對苦蕎芽中RDEs酶的比活力無影響，且各光處理之間沒有有顯著性差異。蘆丁是總黃酮中的主要組分，實驗結(jié)果表明，光照可刺激蕎麥芽中蘆丁的生物合成，但對蘆丁的降解轉(zhuǎn)化影響很小。此外，光處理后，總黃酮中蘆丁與槲皮素二者總量無明顯增加，但分別改變了蘆丁或槲皮素組分在總黃酮中的比例。

綜上所述，光處理能夠刺激萌發(fā)苦蕎中黃酮類物質(zhì)的合成，提高蕎麥的抗氧化性。本研究結(jié)果不僅為生產(chǎn)上提供了一種簡單的黃酮類合成的調(diào)控方法，也為進一步進行萌發(fā)蕎麥中黃酮類物質(zhì)的精確調(diào)控和代謝流研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)手段。因此選擇適當(dāng)?shù)拿劝l(fā)條件對提高苦蕎中黃酮類物質(zhì)的含量具有一定意義。

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Effects of light quality on flavonoids and antioxidant properties of germinated tartary buckwheat

CUI Lin-lin1，2，ZHOU Yi-ming2，JI Hong-bin2，TANG Wen2，ZHOU Xiao-li2，*
（1.Department of Hotel Management，Shanghai Business School，Shanghai 201499，China；2.School of Perfume and Aroma technology，Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418，China）

In this paper，the 3 d germinated buckwheat was used as the material.Effects of light quality（red light，yellow light，green light，white light，blue light，UV-A（356 nm）and UV-C（254 nm））on flavonoids，antioxidant properties and relative enzymes of flavonoids for treating germinated tartary buckwheat.The results indicated that total flavonoid and rutin content in buckwheat sprouts was significantly increased under the treatment of ultraviolet，blue，white，yellow and red light in the germination process（compared with the dark treatment），and there was significantly different between the different treatment（p＜0.05）.After the treatment of UV-C，total flavonoid and rutin contents in buckwheat sprout were the highest，and increased 30.1%and 40.9% compared with the control group，respectively.Moreover，activity of the key enzymes（PAL and CHI）of flavonoids metabolism in buckwheat sprout were significantly increased，and positive correlated with the contents of total flavonoid and rutin，after the treatment of light.These results demonstrated that after the buckwheat sprout treated with light，the contents of flavonoids were increased by improving the activity of key enzymes in anabolism process of flavonoids.In addition，the DPPH free radical scavenging activity of buckwheat sprout could be increased by the light treatment，and increased up to 35.1%in the process of buckwheat germination.The scavenging activity was positive correlated with the total flavonoids content，and indicated that the flavonoids content in buckwheat sprouts could be increased by the light treatment to improve the antioxidant activity of buckwheat.

tartary buckwheat；germination；light quality；flavonoids；antioxidant properties

TS201.2

A

1002-0306（2016）06-0104-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.012

2014－04－02

崔琳琳（1981-），女，碩士研究生，實驗師，研究方向：食品加工與工藝，E-mail：cuilinlin1234690@163.com。

周小理（1957-），女，大學(xué)本科，教授，研究方向：功能食品開發(fā)，食品新資源深度開發(fā)與利用，E-mail：zhouxlsit@163.com。

國家自然科學(xué)基金項目（31371761）；國家燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-08-D-2-5）；2013年上海高校實驗技術(shù)隊伍建設(shè)計劃項目。