王麗萍，李 祥，師春蘭，彭西峰（.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安700；.九江學(xué)院，江西九江33005）

葡萄糖醛酸制備工藝中的糖化及發(fā)酵條件研究

王麗萍1，李 祥1，師春蘭1，彭西峰2
（1.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安710021；2.九江學(xué)院，江西九江332005）

以氧化淀粉為原料，采用酶解和發(fā)酵工藝來制備葡萄糖醛酸，以糖化液和發(fā)酵液中葡萄糖醛酸含量為評價指標(biāo)，研究了葡萄糖醛酸制備工藝中的糖化條件、發(fā)酵條件。結(jié)果表明：糖化的最佳條件為：75 g氧化淀粉中加入2 mL糖化酶，在溫度為55℃下反應(yīng)12 h時，糖化液中的葡萄糖醛酸最高達(dá)7.79%；發(fā)酵的最佳條件為：25 mL糖化液中加2.0 g酵母粉，在35℃的水浴中發(fā)酵4 d時發(fā)酵液中的葡萄糖醛酸含量最高達(dá)28.03%。該研究為高含量葡萄糖醛酸的制備及其變性淀粉的應(yīng)用提供了理論指導(dǎo)。

氧化淀粉，糖化，發(fā)酵，葡萄糖醛酸

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氧化淀粉 自制；氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、四硼酸鈉、3，5-二硝基水楊酸、丙三醇、葡萄糖、間羥基聯(lián)苯、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品 均為分析純，購于西安化學(xué)試劑公司；安琪釀酒活性干酵母 購于安琪酵母股份有限公司；淀粉酶（20000 U·mL-1）、糖化酶（10000 U·mL-1） 均購于開封東大化工有限責(zé)任公司。

D60-2F型電動攪拌機(jī) 杭州儀表電機(jī)廠；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PB-10型酸度計 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；7230 G型分光光度計 上?？萍純x器有限公司制造；NDJ-5S型數(shù)字旋轉(zhuǎn)粘度計 上海地學(xué)儀器研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖醛酸的測定

1.2.1.1 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取0.1 g葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，加水定容，配制1.00 mg/mL的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液。取上述標(biāo)準(zhǔn)液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分別置于10 mL的具塞試管中，在冰水浴中加入5 mL四硼酸鈉/硫酸溶液，搖勻，在沸水浴中加熱5 min后冷卻，將試管置于冰水浴中，用微量移液器加入1.5 mg/mL的間羥基聯(lián)苯100 μL，蓋上塞子搖勻，以1 mL蒸餾水做空白，在520 nm處測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖醛酸的質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 糖化液、發(fā)酵液中葡萄糖醛酸含量的測定取糖化液、發(fā)酵液各0.5 mL，稀釋500倍，吸取1 mL置于10 mL具塞試管中，按上述方法處理，在520 nm處測定糖化液、發(fā)酵液的吸光度，再根據(jù)葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得出糖化液、發(fā)酵液中葡萄糖醛酸的含量。

1.2.2 時間因素：疾病從開始到進(jìn)展惡化或緩解是一個動態(tài)的過程，每一階段有不同的表現(xiàn)。而醫(yī)務(wù)人員可能在疾病的某個階段接觸患者，因此并沒有機(jī)會了解疾病的全過程。在某個時間節(jié)點(diǎn)，有些重要的有診斷意義的證據(jù)可能尚未出現(xiàn)或已經(jīng)消失。例如哮喘的病情有明顯的可逆性和可變性，1例青年學(xué)生患哮喘，急性發(fā)作時氣急明顯且有驚恐煩躁等精神癥狀。在發(fā)作后到醫(yī)院檢查，兩肺未聞羅音，肺功能檢查正常。一度誤診為“神經(jīng)官能癥”。

1.2.2 糖化階段實驗條件的確定

1.2.2.1 糖化溫度對葡萄糖醛酸含量的影響 分別稱取75.0 g的氧化淀粉五份，加150 mL水調(diào)制成淀粉乳，置于250 mL三口瓶中，用NaOH調(diào)節(jié)體系pH6.5，分別加入12 mL α-淀粉酶，在85℃下水解1 h后，各加入糖化酶2 mL，再調(diào)節(jié)pH4.5，按編號依次在40、45、50、55、60℃下糖化12 h，研究糖化溫度對葡萄糖醛酸含量的影響。

1.2.2.2 糖化酶添加量對葡萄糖醛酸含量的影響分別稱取75.0 g的氧化淀粉五份，加150 mL水調(diào)制成淀粉乳，置于250 mL三口瓶中，用NaOH調(diào)節(jié)體系pH6.5，分別加入12 mL α-淀粉酶，在85℃下水解1 h后，調(diào)節(jié)pH4.5，按編號分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的糖化酶，置于55℃水浴中反應(yīng)12 h，研究糖化酶加量對葡萄糖醛酸含量的影響。

1.2.2.3 糖化時間對葡萄糖醛酸含量的影響 稱取75.0 g的氧化淀粉8份，加150 mL水調(diào)制成淀粉乳，置于250 mL三口瓶中，用NaOH調(diào)節(jié)體系pH6.5，分別加入12 mL α-淀粉酶，在85℃下水解1 h后，調(diào)節(jié)體系pH4.5，加入2.0 mL糖化酶，在55℃下按編號依次糖化6、7、8、9、10、11、12、13 h，研究糖化時間對葡萄糖醛酸含量的影響。

1.2.3 發(fā)酵階段實驗條件的確定

1.2.3.1 酵母粉的添加量對葡萄糖醛酸含量的影響稱取氧化淀粉150 g，加300 mL蒸餾水調(diào)制成淀粉乳，在85℃下加入24 mL α-淀粉酶，水解1 h后，調(diào)節(jié)體系pH4.5，加入4.0 mL糖化酶，在55℃下糖化12 h，取25 mL糖化液五份分別置于5個100 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)體系pH4.3，按編號依次加入酵母粉0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g，用棉花塞緊瓶口，在35℃水浴溫度下靜置發(fā)酵4 d，考察酵母粉加量對葡萄糖醛酸含量的影響。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度對葡萄糖醛酸含量的影響 稱取氧化淀粉150 g加水調(diào)制成淀粉乳，在85℃下加入24 mL α-淀粉酶水解1 h后，調(diào)節(jié)體系pH4.5，加入4.0 mL糖化酶，在55℃下糖化12 h，取25 mL糖化液七份分別置于7個100 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)體系pH4.3，分別加入2.0 g的酵母粉，按編號在20、25、30、32、35、40、45℃的水浴中發(fā)酵4 d，研究發(fā)酵溫度與葡萄糖醛酸含量的關(guān)系。

1.2.3.3 發(fā)酵時間對葡萄糖醛酸含量的影響 稱取氧化淀粉150 g加水調(diào)制成淀粉乳，在85℃下加入24 mL α-淀粉酶水解1 h后，調(diào)節(jié)體系pH4.5，加入4.0 mL糖化酶，在55℃下糖化12 h，取25 mL糖化液六份分別置于6個100 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)體系pH4.3，分別加入2.0 g的酵母粉，在35℃的水浴中按編號發(fā)酵2、2.5、3、3.5、4、4.5 d，研究發(fā)酵時間對葡萄糖醛酸含量的影響。

1.2.4 紅外譜圖表征 分別配制質(zhì)量濃度為1×10-2mg/mL的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、糖化液和發(fā)酵液，采用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

圖1 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucuronic acid

以葡萄糖醛酸濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1，回歸方程為：y=6.08929x+0.11286，R2=0.99966，線性關(guān)系良好。據(jù)此推導(dǎo)得到糖化液、發(fā)酵液中葡萄糖醛酸含量計算公式ω（%）=（y-0.11286）/6.08929×6.1×250/m，式中：m為所取的糖化液或者發(fā)酵液的質(zhì)量。

2.2 糖化條件的確定

2.2.1 糖化溫度對葡萄糖醛酸含量的影響 從圖2可以看出，當(dāng)?shù)陀?5℃時，隨著溫度的增加，葡萄糖醛酸含量也增加，而當(dāng)溫度超過55℃時葡萄糖醛酸含量急劇下降。糖化酶是一種外切型淀粉酶，系統(tǒng)名稱為α-1，4葡聚糖葡萄糖水解酶，除了能從淀粉分子的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵之外，也能切開α-1，6糖苷鍵［6］。一般來說，糖化酶最適作用是50～60℃，低溫下酶的活性比較低，溫度過高酶也會因為蛋白變性而失活，所以該實驗選擇55℃為糖化酶的最適溫度。

圖2 糖化溫度對葡萄糖醛酸含量的影響Fig.2 The effect of saccharifying temperature on content of glucuronic acid

2.2.2 糖化酶添加量對葡萄糖醛酸含量的影響 由圖3可以看出，在糖化酶較少時，糖化酶加量對葡萄糖醛酸的影響較大，而超過2.0 mL時葡萄糖醛酸的增加不太明顯。酶的添加量直接影響到酶促反應(yīng)的效率，但在底物一定的情況下，過量的糖化酶并不會加快糖化速率，綜合考慮糖化酶的最佳量為2.0 mL。

圖3 糖化酶添加量對葡萄糖醛酸含量的影響Fig.3 The effect of glucoamylase dose on content of glucuronic acid

2.2.3 糖化時間對葡萄糖醛酸含量的影響 從圖4可以看出，糖化酶在作用12 h時葡萄糖醛酸含量基本保持不變，糖化酶水解淀粉和較大分子的低聚糖時屬于單鏈?zhǔn)剿?，即完成一個分子的水解以后，再水解另一個分子，但水解較小分子的低聚糖時屬于多鏈?zhǔn)?，即水解一個分子幾次后脫離，再水解另一個分子。本實驗是先將氧化淀粉用α-淀粉酶作用一定的時間再用糖化酶水解，理論上，糖化酶會將淀粉單鏈試水解至完全，但實際上糖化酶水解α-1，4糖苷鍵的速度隨底物相對分子質(zhì)量的下降而降低，從圖4中可得出選擇糖化12 h為最佳時間。

圖4 糖化時間對葡萄糖醛酸的影響Fig.4 The effect of saccharifying time on content of glucuronic acid

2.3 發(fā)酵條件的確定

2.3.1 酵母粉的加量對葡萄糖醛酸含量的影響 從圖5可以看出，隨著酵母粉的增加，葡萄糖醛酸含量也急劇增加，當(dāng)酵母粉的加量超過2.0 g后，葡醛酸的增加量就不太明顯。酵母粉是酵母細(xì)胞沒有經(jīng)過自溶而直接壓濾干燥粉碎后的產(chǎn)物，含有大量的完整的酵母細(xì)胞［7］。糖化液中的葡萄糖經(jīng)EMP途徑形成了丙酮酸，在無氧條件下，酵母細(xì)胞中的丙酮酸脫羧酶氧化丙酮酸脫羧形成乙醛和二氧化碳，乙醛在乙醇脫氫酶的作用下又可以被NADH還原成乙醇［8］，酵母粉的添加量直接影響發(fā)酵除糖的效果。酵母粉增加，發(fā)酵液中葡萄糖量減少，而葡萄糖醛酸量相對增加，由圖5可以得出，酵母粉的最佳添加量為2.0 g。

圖5 酵母粉量對葡萄糖醛酸的影響Fig.5 The effect of yeast dosage on content of glucuronic acid

2.3.2 溫度對發(fā)酵過程的影響 從圖6可以看出，發(fā)酵液中的葡萄糖醛酸含量隨著發(fā)酵溫度的增加呈先增加后下降的趨勢，在35℃時含量最高，所以選擇酵母粉最佳發(fā)酵溫度為35℃。

圖6 發(fā)酵溫度對葡萄糖醛酸含量的影響Fig.6 The effect of fermentation temperature on glucuronic acid content

2.3.3 發(fā)酵時間對葡萄糖醛酸含量的影響 從圖7可以看出，隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，葡萄糖醛酸含量逐漸增加，到超過4 d的時候，葡醛酸含量基本保持不變。這是因為在酵母粉存在的條件下，發(fā)酵液中的葡萄糖逐漸發(fā)酵形成乙醇，在發(fā)酵液一定量的情況下，隨著葡萄糖含量的減少，葡萄糖醛酸的含量相對逐漸增加，在發(fā)酵4 d之后，葡萄糖醛酸含量變化不明顯，說明葡萄糖基本發(fā)酵除去。所以最佳發(fā)酵時間為4 d。

圖7 發(fā)酵時間對葡萄糖醛酸含量的影響Fig.7 The effect of fermentation time on content of glucuronic acid

2.3 發(fā)酵液的紅外譜圖表征及分析

圖8為葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、糖化液、發(fā)酵液的紅外譜圖，從圖8中可以看出，糖化液、發(fā)酵液和葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品在3400、1700、1100 cm-1處有明顯的吸收峰，3400 cm-1為O-H的伸縮振動峰，1700 cm-1為醛類中的C=O伸縮振動峰，說明糖化液和發(fā)酵液中均含有葡萄糖醛酸。

圖8 紅外譜圖Fig.8 FT-IR spectra

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明：在葡萄糖醛酸前期制備工藝一定的情況下，糖化酶作用的最佳條件是：75 g氧化淀粉中加入2 mL糖化酶，在溫度為55℃時反應(yīng)12 h，得到水解液的葡萄糖醛酸含量為7.79%。最佳發(fā)酵條件為：25 mL糖化液中加2.0 g酵母粉，在35℃的水浴中發(fā)酵4 d，得到的發(fā)酵液的葡萄糖醛酸含量為28.03%。本實驗在糖化酶和酵母粉的條件下，通過研究水解和發(fā)酵階段中各個單因素的影響，得到葡萄糖醛酸含量較高的水解液及其發(fā)酵液，為后續(xù)葡萄糖醛酸的制備提供了一定的理論指導(dǎo)。

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Study of saccharification and fermentation conditions in the process of glucuronic acid preparation

WANG Li-ping1，LI Xiang1，SHI Chun-lan1，PENG Xi-feng2
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021，China；2.Jiujiang College，Jiujiang 332005，China）

Using the oxidation starch as raw material，the glucuronic acid was obtained by the processes of saccharification and fermentation.The conditions of saccharifying enzyme reaction and the yeast fermentation was studied，and the glucuronic acid of saccharification liquid and fermented liquid was regarded as evaluation standard.The results showed that the optimal conditions of saccharifing were as follows：reaction at 55℃ for 12 h and amount of saccharifying enzyme was 1 mL in the 75 g of oxidation starch.The optimal conditions of fermentation were 25 mL saccharification liquid with 2.0 g yeast，temperature of 35℃ for 4 d.The research provided the theoretical guidance for the preparation of high content of glucuronic acid and the application of oxidized starch.

oxidation starch；saccharification；fermentation；glucuronic acid

TS236.9

B

1002-0306（2016）06-0260-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.045

2015－06－10

王麗萍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：389173363@qq.com。

西安市科技局項目（CXY1434（2））；未央?yún)^(qū)科技局項目（201411）；江西省自然科學(xué)基金（ZBBF60011）。