冉海燕，江　龍

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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·文獻(xiàn)綜述·

AM真菌離體雙重培養(yǎng)研究進(jìn)展

冉海燕，江龍*

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

AM真菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用“菌肥”以及重金屬污染修復(fù)上占據(jù)重要地位。AM真菌的生理生化及遺傳特性決定了AM真菌的利用方式。離體雙重培養(yǎng)法是目前研究AM真菌生物學(xué)功能特性的高效便利的途徑，利用AM真菌與植物離體轉(zhuǎn)型根進(jìn)行共生培養(yǎng)探究AM真菌的生長(zhǎng)發(fā)育過程，為未來利用AM真菌孢子生產(chǎn)AM真菌接種劑提供理論參考。本文綜述了近年來國(guó)內(nèi)外AM真菌離體雙重培養(yǎng)的研究進(jìn)展，針對(duì)目前AM真菌純培養(yǎng)存在的問題題提出了相關(guān)建議。

AM真菌；離體雙重培養(yǎng)；研究進(jìn)展

叢枝菌根真菌(AM真菌)與植物根系的共生是自然界最廣泛的共生關(guān)系,它能與80%的陸生植物形成互惠共生體，土壤中AM真菌孢子萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲通過侵染宿主植物根系形成泡囊-叢枝結(jié)構(gòu)，促進(jìn)宿主植物從土壤中吸收植物所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)AM真菌也將從宿主植物中獲取幫助完成自身生長(zhǎng)發(fā)育周期所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。1885年，德國(guó)植物生理學(xué)和森林學(xué)家Frank 首創(chuàng)“菌根”(Fungus-root 即Mycorrhiza) 這一術(shù)語(yǔ)，掀起了生物學(xué)界科研人員對(duì)這一類特殊的有益微生物的研究熱潮。AM真菌能促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)吸收，提高植物的產(chǎn)量與質(zhì)量，接種AM真菌可明顯的提高茶樹葉片中N、P、K等含量，可溶性糖、蛋白質(zhì)含量也有所提高，同時(shí)茶葉中茶多酚、氨基酸等物質(zhì)含量提高，降低了氨酚比[2]；自然條件下接種Glomusversiforme促進(jìn)了柑橘過時(shí)組織的發(fā)育，果實(shí)中VC含量、酚含量、黃酮含量、礦物質(zhì)含量等均較未接種的有所提高[3]。AM真菌除了能促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)吸收，提高植物的產(chǎn)量與質(zhì)量，在重金屬污染修復(fù)上發(fā)揮重要的作用[4]，在鎘污染地黑麥草根圍接種AM真菌可緩解鎘對(duì)黑麥草的毒害作用，對(duì)黑麥草根系鎘毒害緩解更為明顯[5]；根內(nèi)球囊霉能顯著降低紫云英莖和根內(nèi)鑭含量，減少鑭對(duì)紫云英的毒害[6]；接種摩西球囊霉能夠有效緩解鎘、銅、砷對(duì)金雞菊和蜈蚣草的毒害等[7]。AM真菌促進(jìn)植物對(duì)土壤中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，提高植物的抗逆性以及環(huán)境修復(fù)上的重要作用，所以AM真菌在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用前景[8]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，AM真菌的作用并未充分發(fā)揮，主要原因在于需要大量的AM真菌孢子，目前規(guī)模化生產(chǎn)AM真菌接種劑的方法仍不成熟[9]，因此開展AM真菌的生理、遺傳特性的研究，最終實(shí)現(xiàn)AM真菌接種劑作為安全高效菌肥是AM真菌研究的重要方向[10]。

AM真菌的研究涵蓋了菌根的形態(tài)、分類、多樣性、生物學(xué)功能等多方面，其中一個(gè)研究重點(diǎn)就是利用植物根段或是植物離體轉(zhuǎn)型根作為寄主進(jìn)行AM真菌的離體純培養(yǎng)，獲得大量純凈孢子。AM真菌活體專性共生的特性限定了AM真菌不能進(jìn)行純培養(yǎng)，離體雙重培養(yǎng)是一種安全高效的方法，主要利用植物根系或植物轉(zhuǎn)型根系來建立與AM真菌的共生體系，在共生體系中，希望AM真菌可以完成生活史，并大量產(chǎn)孢。在植物根系或植物轉(zhuǎn)型根系這兩種共生體系中，由植物根系建立的共生體系存在生長(zhǎng)緩慢，需要添加外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等不利因素；利用土壤細(xì)菌發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)植物體進(jìn)行轉(zhuǎn)化得到的植物Ri-TDNA轉(zhuǎn)型根，具有在無(wú)激素MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，存活時(shí)間久，同時(shí)能保持良好的遺傳特性，是AM真菌雙重培養(yǎng)過程中理想的宿主材料[11]。叢枝菌根真菌的離體純培養(yǎng)從20世紀(jì)60年代興起以來，從培養(yǎng)條件、遺傳因素等方面進(jìn)行了積極的探索，到目前為止，在人工培養(yǎng)條件下能夠建立AM真菌與植物根器官或是植物轉(zhuǎn)型根的共生體系，遺憾的是不能獲得大量新一代的AM真菌孢子[12]，即不能達(dá)到用新生的次生孢子進(jìn)行二次侵染的效果。AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育過程的相關(guān)理論知識(shí)相對(duì)較為缺乏，尤其是在其遺傳方面知識(shí)的嚴(yán)重缺乏導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)研究過程中沒有更多明確的思路，只能逐步探索。本文綜述了AM真菌離體雙重培養(yǎng)研究的發(fā)展、研究現(xiàn)狀和未來的研究方向，希望能通過植物生理與分子生物學(xué)手段找出AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育過程中的關(guān)鍵物質(zhì)，清晰透徹地闡明AM真菌遺傳特性[13]，提高AM真菌次生孢子的產(chǎn)率及成熟率，最終實(shí)現(xiàn)AM真菌接種劑的規(guī)模化生產(chǎn)。

1　AM真菌雙重培養(yǎng)的提出

AM真菌的擴(kuò)繁方法主要有活體盆栽法、培養(yǎng)基培養(yǎng)法、玻璃珠分室培養(yǎng)法、AM真菌與植物根器官培養(yǎng)法、AM真菌與植物Ri-TDNA轉(zhuǎn)型根離體單孢培養(yǎng)法等，活體盆栽法仍是目前獲得AM真菌接種劑的常用且最為簡(jiǎn)單有效的方法，該方法具有獲取方便的優(yōu)點(diǎn)，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，繁殖體少等缺點(diǎn)[16]。培養(yǎng)基培養(yǎng)法較盆栽法復(fù)雜且只能獲得極少量純度較高的接種物。離體雙重培養(yǎng)法是一種安全、高效的培養(yǎng)方法，該方法是在無(wú)菌的人工培養(yǎng)基上接種萌發(fā)的AM真菌孢子以及寄主材料，AM真菌菌絲侵入根系內(nèi)部建立共生體，從根系獲取營(yíng)養(yǎng)來保證AM真菌的生長(zhǎng)發(fā)育，完成生活史。

AM真菌是土壤中的一種活體寄主有益微生物，不能獨(dú)立生存，適宜條件下AM真菌孢子能夠萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，在沒有寄主存在的情況下，菌絲生長(zhǎng)20天左右就停止生長(zhǎng)[14]。究其原因：在脫離寄主后AM真菌不能獨(dú)立完成新的細(xì)胞核DNA的合成，AM真菌孢子萌發(fā)菌絲需要侵入活體植物組織獲取更多的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)保證核DNA的繼續(xù)復(fù)制[15]。正是AM真菌專性活體寄主的特性限制了AM離體純培養(yǎng)，只能在寄主存在的條件下完成生長(zhǎng)發(fā)育的全過程，為此，科學(xué)家們做了大量AM真菌雙重培養(yǎng)的相關(guān)研究。AM真菌與植物離體雙重培養(yǎng)經(jīng)歷了兩個(gè)主要階段：AM真菌與植物離體根段共培養(yǎng)，AM真菌與植物轉(zhuǎn)型根共培養(yǎng)。AM真菌與植物根段的培養(yǎng)存在植物根段在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，需要添加外源生長(zhǎng)物質(zhì)等缺陷最終被否定；植物轉(zhuǎn)型根則能在無(wú)激素培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)，且存活時(shí)間久，對(duì)于需要長(zhǎng)期觀察AM真菌的生長(zhǎng)發(fā)育過程來說，植物轉(zhuǎn)型根則是最佳的宿主。

目前，已建立了AM真菌與宿主植物轉(zhuǎn)型根的雙重培養(yǎng)共生體系，但成熟孢子的數(shù)量及次生孢子的發(fā)育狀況仍不能達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用的要求。主要是未能找出AM真菌與宿主識(shí)別的關(guān)鍵信號(hào)物質(zhì)，對(duì)影響AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育的內(nèi)外因素認(rèn)識(shí)模糊，對(duì)AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育后期次生孢子形成及成熟缺乏了解。值得高興的是，利用AM真菌與植物轉(zhuǎn)型根建立了雙重培養(yǎng)共生體系，在進(jìn)行共生培養(yǎng)過程中，可實(shí)時(shí)觀察AM真菌的形態(tài)變化及生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程，同時(shí)也能獲得少量純凈AM真菌成熟孢子，為獲得純凈的AM真菌接種劑帶來了希望，但用此法生產(chǎn)AM真菌接種劑還尚待時(shí)日。

2　AM真菌離體雙重培養(yǎng)的現(xiàn)狀

2.1AM真菌與植物根器官雙重培養(yǎng)

AM真菌與植物離體根段雙重培養(yǎng)是AM真菌離體培養(yǎng)的早期階段，此方法在組織培養(yǎng)條件下將植物根段作為寄主與AM真菌孢子共培養(yǎng)，共生關(guān)系建立后AM真菌也能完成生活史，植物根段作為寄主材料存在植物離體根段在無(wú)激素的培養(yǎng)基上存活時(shí)間不長(zhǎng)，而且根段生長(zhǎng)速度較為緩慢，難以滿足AM真菌完成整個(gè)生活史所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等弊端[16]。

1975年Mosse和Hepper首次將番茄和紅三葉草的根段與Glomusmosseae建立成功共生關(guān)系，遺憾的是未能產(chǎn)生新生孢子；1984年，Miller-Widman 和Watrud在改良的培養(yǎng)基上建立了番茄離體根段與Gigaspora雙重培養(yǎng)關(guān)系，且獲得了次生球狀巨孢囊霉孢子；Mossea等人利用Glomus真菌孢子在改良的懷特培養(yǎng)基上建立AM真菌與苜蓿根的共生體系[17]；Mosse and Hepper建立番茄及紅三葉草與摩西球囊霉AM真菌的共生體系[18]；邵菊芳等人在改良的White培養(yǎng)基上建立了Gigasporamargarita孢子與白三葉草離體根系雙重培養(yǎng)并獲得次生孢子[19]；目前為止至少有27個(gè)AM真菌株系與植物根器官建立共生關(guān)系，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1(轉(zhuǎn)引 Nishi Mathur & Anil Vyas，2007)。

表1　AM真菌-植物離體根系列表

2.2AM真菌與植物離體轉(zhuǎn)型根雙重培養(yǎng)

AM真菌與植物離體根段共培養(yǎng)產(chǎn)生次生孢子的研究成功后，對(duì)AM真菌雙重培養(yǎng)的研究越來越多，相繼取得了一定的成果。利用植物根段作為宿主存在生長(zhǎng)緩慢，需外源物質(zhì)，存活時(shí)間短等缺陷，但AM真菌與植物根段能夠建立共生關(guān)系為AM真菌與植物轉(zhuǎn)型根建立雙重培養(yǎng)體系奠定了基礎(chǔ)。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物獲得植物離體轉(zhuǎn)型根，毛狀根能夠在無(wú)激素培養(yǎng)基快速生長(zhǎng)，同時(shí)存活時(shí)間較植物根段長(zhǎng)，研究者利用植物離體轉(zhuǎn)型根作為AM真菌離體培養(yǎng)的寄主材料。1987年， Mugnier和Mosse首次成功建立了Convolvulussepium毛狀根與Glomusmosseae的共生關(guān)系，遺憾的是未能產(chǎn)孢，之后利用毛狀根與AM真菌孢子建立共生關(guān)系的報(bào)道逐漸增多。對(duì)于不同種屬植物以及不同種屬關(guān)系的AM真菌共生關(guān)系的研究結(jié)果不盡相同，這可能與植物和AM真菌本身的生理特性存在差異有關(guān)。以下是國(guó)內(nèi)外近十年來AM真菌與植物轉(zhuǎn)型根系雙重培養(yǎng)結(jié)果見表2。

表2　AM真菌與植物轉(zhuǎn)型根建立雙重培養(yǎng)體系

3　存在的問題

利用AM真菌孢子萌發(fā)的菌絲與植物離體轉(zhuǎn)型根進(jìn)行共生培養(yǎng)是能快速獲得大量真菌孢子的有效方法，也是最能直觀體現(xiàn)AM真菌生長(zhǎng)發(fā)育過程的最佳方法。目前利用離體雙重培養(yǎng)技術(shù)僅能夠獲得少量純凈的次生孢子； AM真菌的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，可觀察從孢子萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，菌絲侵入根段到產(chǎn)生次生孢子的過程，但對(duì)整個(gè)過程卻不能清晰具體地闡述。AM真菌的離體純培養(yǎng)仍處于探索階段，AM真菌與植物離體轉(zhuǎn)型根建立的雙重培養(yǎng)體系中的孢子產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足AM真菌商品接種劑的要求，以下問題亟待完善。

培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)仍是主流趨勢(shì)，固體培養(yǎng)是在固體培養(yǎng)基上接種AM真菌孢子與植物轉(zhuǎn)型根建立共生關(guān)系。但有的AM真菌孢子的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，培養(yǎng)過程中難以更換培養(yǎng)基，導(dǎo)致AM真菌在完成生活史前宿主植物已衰老，不能為孢子生長(zhǎng)繼續(xù)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

培養(yǎng)裝置：目前的研究大多在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行，在培養(yǎng)過程中，由于植物需要進(jìn)行代謝過程，培養(yǎng)中在培養(yǎng)皿內(nèi)容易出現(xiàn)水珠，容易導(dǎo)致污染且影響后續(xù)的鏡檢；

培養(yǎng)條件：營(yíng)養(yǎng)情況、外界物理?xiàng)l件及遺傳因素都會(huì)影響AM真菌的生長(zhǎng)發(fā)育，目前的研究主要放在了營(yíng)養(yǎng)狀況及物理?xiàng)l件上，在遺傳因素上的研究相對(duì)較少；

理論基礎(chǔ)：AM真菌生理遺傳方面的理論知識(shí)相對(duì)較為缺乏，仍處于探索階段。

4　展望

AM真菌純培養(yǎng)能否成功是生產(chǎn)AM 真菌接種劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的前提，生理學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合來開展AM真菌的離體純培養(yǎng)研究是一種必然的趨勢(shì)。AM真菌的離體雙重培養(yǎng)主要是在固體培養(yǎng)基上接種AM真菌孢子與植物轉(zhuǎn)型根，建立共生關(guān)系幫助AM真菌完成生活史。信號(hào)物質(zhì)是建立共生關(guān)系的紐帶，是后期培養(yǎng)過程中能否獲得次生孢子的關(guān)鍵，當(dāng)前的研究只能觀察生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程，并不能清晰透徹的闡明AM真菌的生理遺傳特性。AM真菌的雙重培養(yǎng)處在一個(gè)封閉的空間里，培養(yǎng)結(jié)束后若利用GC-MC分析技術(shù)來檢測(cè)容器里的物質(zhì)成分及其變化，或許能找出促進(jìn)共生關(guān)系建立的信號(hào)物質(zhì)。AM真菌純培養(yǎng)仍處于瓶頸階段，分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)將會(huì)是研究AM真菌遺傳特性的有效途徑，劉潤(rùn)進(jìn)等人(2009)針對(duì)未來AM真菌的研究方向時(shí)提出：“必須加強(qiáng)AM真菌與植物共生關(guān)系基因表達(dá)的分子生物學(xué)研究，探索新的方法，完善并規(guī)范相應(yīng)的菌根技術(shù)”。我們期待在分子生物學(xué)及高新科技的推動(dòng)下，弄清AM真菌的生理遺傳特性，通過設(shè)計(jì)一套合理的培養(yǎng)裝置獲得大量純凈的AM真菌孢子，為工業(yè)化生產(chǎn)AM真菌接種劑提供切實(shí)有效的方法。

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[37]馬偉.叢枝菌根真菌共培養(yǎng)體系的建立及多胺對(duì)其生長(zhǎng)效應(yīng)的研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[38]Anshul Puri，Alok Adholeya. A new system using Solanum tuberosum for the co-cultivation of Glomus intraradices and its potential for mass producing spores of arbuscular mycorrhizal fungi[J].Symbiosis，2013(59):87-97.

The research progress of AM fungi in vitro dual culture

RANHai-yan,JIANGLong*

(Collegeoflifescience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Arbuscularmycorrhizae(AM) has play an important role in repairing the heavy metal pollution and producing the bacterial manure. The utilization of AM fungi was depended on the physiology and biochemistry or hereditary character of it. The vitro dual culture is a high-efficiency and convenient approach to study the biological function of AM. Using AM fungi spore and Ri-TDNA transformed roots to explore the growth and development of it that can present some theoretic conference about using AM fungi to product fungicide in the future. Some currently research progresses were summarized in here and related suggestions were proposed to the cultivation of AM in the future based on some issues which have encountered.

Arbuscularmycorrhizae; vitro dual culture; research progress

2016-03-10；

2016-04-05

貴州省社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合SY字2011-3085)；教育部重點(diǎn)項(xiàng)目(2011-167)；貴陽(yáng)市社發(fā)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(筑科合同 2011103-51)；貴州省煙草公司遵義分公司科技項(xiàng)目(遵煙技 2012-07號(hào))。

江龍(1970-)，男，博士，教授，主要研究方向：植物生理學(xué)、菌根生物學(xué)；E-mail:jianglonggy@sina.com。

R283.6

A

1008-0457(2016)02-0062-06國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.012