張梓涵，王　晨，竇迎春，劉　婭（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

耐有機(jī)溶劑脂肪酶菌株的篩選及其耐受特性初探

張梓涵，王晨，竇迎春，劉婭*
（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

以篩選獲得的新疆釀酒葡萄內(nèi)生菌為出發(fā)菌株，首先采用含有橄欖油乳化劑及羅丹明B的平板初篩，再分別以體積分?jǐn)?shù)1%正庚烷和1%甲苯為篩選壓力進(jìn)行復(fù)篩，從中得到1株耐有機(jī)溶劑脂肪酶菌株M-CY1，經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定為Penicillium asturianum。該菌遺傳穩(wěn)定性良好，菌種的酶活性與菌絲的生長量呈正相關(guān)，多種有機(jī)溶劑對(duì)該菌產(chǎn)脂肪酶活具有促進(jìn)作用，其中二甲苯作用最為明顯，酶活為4.99U/m L，相對(duì)酶活達(dá)143.76%。

葡萄；內(nèi)生菌；耐有機(jī)溶劑脂肪酶；篩選；鑒定

非水相酶學(xué)是發(fā)展至今不足20年的一個(gè)酶催化新興領(lǐng)域，這讓一些傳統(tǒng)方法難以合成的新型化合物及外消旋體拆分等得以實(shí)現(xiàn)，已超出了油-水界面上進(jìn)行水解反應(yīng)的范圍，能催化各種合成反應(yīng)的進(jìn)行，如酯合成、手性化合物拆分、高聚物合成、肽合成、油脂改性、含油廢棄物的生物修復(fù)處理等［1-4］。但選用有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)的一個(gè)重要障礙是脂肪酶在有機(jī)相中容易發(fā)生結(jié)構(gòu)重排而降解失活［1，5］，因此如何使用脂肪酶在有機(jī)相中仍能較好發(fā)揮作用，便成為發(fā)展非水相酶學(xué)的重要問題。當(dāng)前，尋找能夠耐受有機(jī)溶劑的脂肪酶成為非水相酶學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。由于微生物是當(dāng)前工業(yè)用脂肪酶的重要來源，而脂肪酶在微生物界分布十分廣泛［6-9］，迄今為止國內(nèi)外已有諸多學(xué)者對(duì)耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及有機(jī)溶劑耐受性進(jìn)行了研究，如Bacillus sphaericus205y［10］，Pseudomonas sp.S5［11］等。植物內(nèi)生菌是潛力巨大的生物催化劑寶庫，植物內(nèi)環(huán)境微生態(tài)的特殊性使其內(nèi)生菌所產(chǎn)脂肪酶也有具有特殊性質(zhì)的可能性，國內(nèi)外已有學(xué)者從樹木葉部、根、棕櫚果實(shí)、橄欖樹等植物中篩選獲得了耐甲醇、乙醇、苯、丙酮、正己烷、二甲苯等有機(jī)溶劑的內(nèi)生細(xì)菌和真菌［12-13］。目前，微生物產(chǎn)生的耐有機(jī)溶劑脂肪酶已用于有機(jī)相中多種化學(xué)反應(yīng)的催化。但由于需要催化的化學(xué)方應(yīng)類型多、產(chǎn)物浮躁，現(xiàn)有的耐有機(jī)溶劑脂肪酶源不能滿足工業(yè)上的多樣化需求，因此有必要尋找更多、更高效的耐有機(jī)溶劑微生物。鑒于新疆釀酒葡萄品種優(yōu)良，地域特色明顯，生物多樣性豐富，本實(shí)驗(yàn)利用已有的新疆釀酒葡萄內(nèi)生菌，從中進(jìn)行耐有機(jī)溶劑脂肪酶菌株篩選，并對(duì)其耐有機(jī)溶劑的特性進(jìn)行初步的研究，從而為耐有機(jī)溶劑脂肪酶的分離純化及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1料與試劑

1.1.1種來源

課題組實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，源自新疆釀酒葡萄，共73株，包括內(nèi)生細(xì)菌、霉菌、酵母菌和放線菌。

1.1.2養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：用于內(nèi)生真菌的活化［14］。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：用于內(nèi)生細(xì)菌的活化［15］。高氏一號(hào)培養(yǎng)基：用于內(nèi)生放線菌的活化［15］。

液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，定容至1 L，pH值為7.0，121℃滅菌20m in［15］。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl10 g，NH4Cl0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.1 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15～20 g，加蒸餾水1 L，121℃滅菌20min［15］。

初篩平板培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基高壓滅菌后，靜置至溫度為60℃左右時(shí)每l00m L加入含0.2%羅丹明B的聚乙烯醇橄欖油乳化液12m L［15］。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基高壓滅菌后，靜置至溫度為25℃左右時(shí)每100m L加入1m L過濾滅菌的甲苯或正庚烷［15］。

1.1.3學(xué)試劑

對(duì)硝基棕櫚酸苯酯（p-nitrophenylpalmitate，p-NPP）：美國Sigma公司；橄欖油：上海嘉里食品工業(yè)有限公司；羅丹明B（Rhodamine B，Rh B）：生工生物工程（上海）有限公司；聚乙烯醇（polyvinylalcohol，PVA）：上海國藥集團(tuán)；乙腈、二氯甲烷、異丙醇：天津市福晨化學(xué)試劑廠；甲醇：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；液體石蠟：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2器與設(shè)備

LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；722可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-JCV超凈臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZXSD-1160生化培養(yǎng)箱、ZHWY-111B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；MOTIC B SERIES生物顯微鏡：麥克奧迪集團(tuán)公司；FA1004電子天平：上海精科天平儀器廠；HHS-216恒溫水浴槽：常州國華電器有限公司。

1.3法

1.3.1有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

將活化后的菌株分別接種到含有橄欖油乳化液及羅丹明B的初篩平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。產(chǎn)脂肪酶的菌株周圍在紫外燈照射下會(huì)有紅色的熒光圈。以菌落直徑與熒光圈直徑之比為篩選依據(jù)［16］，選擇比值大，即脂肪酶高產(chǎn)菌株作為復(fù)篩菌株，將其轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上備用。對(duì)于紫外燈下有紅色熒光圈的菌落，再分別以1%的正庚烷和1%的甲苯為篩選壓力，添加于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，細(xì)菌培養(yǎng)24 h、霉菌培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液5 000 r/min離心10min，取上清液測(cè)酶活力。

1.3.2肪酶活力檢測(cè)

酸堿滴定法［17］。在實(shí)驗(yàn)溫度和pH條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1μmol脂肪酸的脂肪酶的量定義為1個(gè)活力單位，以U表示。本實(shí)驗(yàn)將1%正庚烷加入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)得的脂肪酶活力為參照，以1%其他不同有機(jī)溶劑發(fā)酵培養(yǎng)后測(cè)得的酶活力為相對(duì)酶活。

取100m L錐形瓶向其中加入4m L 0.05mol/L的pH值為7.5的磷酸緩沖液和5m L橄欖油乳化液，置于45℃水浴中保溫5m in，然后加lm L粗酶液，在45℃水浴中振蕩10m in，取出立即加入15m L的無水乙醇，加入3滴酚酞指示劑，用0.05mol/L NaOH滴定溶液至呈粉紅色?？瞻讓?duì)照是加入1m L滅活過的酶液（滅活方法為100℃水浴15min），其余操作都相同，測(cè)得菌株酶活力。每次測(cè)定重復(fù)3次，得平均值。酶活力計(jì)算公式如下：

式中：V為滴定樣液消耗的NaOH體積，mL；V0為滴定空白樣消耗的NaOH體積，m L；t為反應(yīng)時(shí)間，m in；n：酶液體積，m L；M為滴定用的NaOH溶液的濃度，mol/m L。

1.3.3標(biāo)菌株的鑒定

采用載玻片培養(yǎng)法觀察菌株顯微形態(tài)，通過菌落形態(tài)和顯微特性的觀察初步鑒定耐有機(jī)脂肪酶菌株，再通過26SrDNA ITS區(qū)序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，在GenBank中進(jìn)行局部序列排比檢索基本工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）比較搜索，同時(shí)下載同源性序列，目標(biāo)菌株序列提交GenBank，提取同源性高的序列并使用Phylip（Version3.68）軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定待測(cè)菌株與庫中已有記錄間的親緣關(guān)系。

1.3.4效菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在PDA培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，30℃培養(yǎng)72 h，檢測(cè)其產(chǎn)脂肪酶的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5效菌株生長量、酶活與時(shí)間的關(guān)系

高效菌株在含有1%的正庚烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每隔12 h測(cè)其酶活和OD405nm值，分析菌體生長與產(chǎn)酶的關(guān)系。

1.3.6標(biāo)菌株對(duì)有機(jī)溶劑的耐受規(guī)律研究

分別將正庚烷、乙腈、正丁醇、甲醇、乙醇、二氯甲烷、異丁醇、丙酮、石油醚、二甲苯、苯、正己烷、液體石蠟、異丙醇等14種有機(jī)溶劑以1%比例加入無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，進(jìn)行目標(biāo)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)其產(chǎn)脂肪酶活力及相對(duì)酶活，考察目標(biāo)菌株對(duì)有機(jī)溶劑的耐受規(guī)律。

將目標(biāo)菌株在含有不同濃度的二甲苯無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72 h，測(cè)定脂肪酶活，考察不同濃度的二甲苯對(duì)菌種脂肪酶活的影響規(guī)律。將目標(biāo)菌株接在含有1%的正庚烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每隔12 h測(cè)其酶活和OD405nm值，分析菌體生長與產(chǎn)酶的關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1生菌耐受有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選

以73株葡萄內(nèi)生菌為出發(fā)菌株，接種到以橄欖油乳化液為唯一碳源、羅丹明B為顯色劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株產(chǎn)脂肪酶能力的初篩，紫外光觀察發(fā)現(xiàn)GUO-4、M-CY1、C1Y1、XP201、Q-G-3-2、J-CY1、Q-G-2-1這7株菌呈現(xiàn)橙紅色熒光圈。

測(cè)量這7株菌的熒光圈直徑和菌落直徑，并計(jì)算熒光圈直徑與菌落直徑比值，結(jié)果見表1。由表1可知，M-CY1的直徑比值最大，說明其產(chǎn)脂肪酶的能力較強(qiáng)。

表1　熒光圈直徑與菌落直徑比Table 1 Ratio of fluorescent ring diameter and colony diameter

對(duì)初篩得到的7株菌分別以1%甲苯和1%正庚烷為篩選壓力在28℃、150 r/min條件下進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，脂肪酶活檢測(cè)和OD405nm值，結(jié)果如圖1所示。

圖1　不同菌株在含有甲苯（A）及正庚烷（B）的培養(yǎng)基中的生長量及脂肪酶活狀況Fig．1 Grow th and lipase activity o f differentstrains inm edium w ith methylbenzene（A）and n-heptane（B）

由圖1可知，菌株M-CY 1在甲苯和正庚烷中都具有較高的酶活性，因此選擇M-CY1為耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌目標(biāo)菌株。

2.2標(biāo)菌株的鑒定

對(duì)菌株M-CY1在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖2。由圖2可知，發(fā)現(xiàn)菌落呈近圓形，直徑約30mm，平坦分布，呈絨狀質(zhì)地，中間青灰色周圍白色，背面橙紅色，周圍泛黃。顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)其為無色的無隔菌絲，孢囊梗直立，沒有假根，多次分枝，具體菌落及顯微形態(tài)見圖2。

圖2　菌株M-CY1的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)Fig．2 Colonialand microscopicmorphology of strain M-CY1

為進(jìn)一步確定耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌M-CY1的分類學(xué)地位，對(duì)其進(jìn)行了DNA測(cè)序，結(jié)果見圖3。由圖3可知，在750～500 bp之間出現(xiàn)明顯的亮帶，說明PCR擴(kuò)增成功，滿足DNA序列測(cè)定要求。得其26S rDNA ITS區(qū)的基因全長為564 bp。對(duì)其基因序列進(jìn)行分析后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。

圖3菌株M-CY1的PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig．3 Electrophoretogram of PCR products of strain M-CY1

由圖4可知，與美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上已有的序列進(jìn)行BlAST同源性檢索，發(fā)現(xiàn)其26SrDNA ITS和Penicillium的多株菌同源性達(dá)99%，而與Penicillium asturianum最接近，即確定菌株M-CY 1為Penicillium asturianum。

圖4 菌株M-CY1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain M-CY1

2.3落產(chǎn)脂肪酶的遺傳穩(wěn)定性

將菌株M-CY1進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，測(cè)定其在甲苯和正庚烷中的脂肪酶活力，結(jié)果見表2。

表2　菌株M-CY1產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the genetic stability testof strain M-CY1 w ith organic solvents-tolerant lipases production　U/m L

由表2可知，菌株M-CY1產(chǎn)脂肪酶活性經(jīng)5代連續(xù)培養(yǎng)，酶活變化不明顯，說明菌株M-CY 1產(chǎn)生的脂肪酶具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.4效菌株M-CY1產(chǎn)脂肪酶活力與菌株生物量

圖5　菌體生物量和脂肪酶活的相關(guān)性Fig.5 Correlation of biomass and lipase activity

為了解菌株M-CY1生長和產(chǎn)酶的關(guān)系，從而在適宜時(shí)間得到脂肪酶活力較高的發(fā)酵液，對(duì)高效菌株M-CY1每隔12 h測(cè)量一次酶活力和OD405nm值，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加菌株M-CY1的產(chǎn)脂肪酶活力逐漸升高，72 h酶活力達(dá)到最高。當(dāng)超過72 h后，內(nèi)生菌產(chǎn)脂肪酶活力呈下降趨勢(shì)。OD405nm值即菌株生物量在一定的時(shí)間范圍內(nèi)呈正態(tài)，60 h之前和時(shí)間呈正比，60 h之后呈反比狀態(tài)。綜上可得，菌株的生物量與菌種的酶活性大致呈正相關(guān)。

2.5標(biāo)菌株對(duì)有機(jī)溶劑的耐受規(guī)律

2.5.1效菌株對(duì)多種有機(jī)溶劑的耐受性檢測(cè)

選取了14種不同種類的有機(jī)溶劑，包括烷烴、環(huán)烷烴、醇類、酮類等，以1%的比例添加于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，由于重點(diǎn)研究正庚烷對(duì)目標(biāo)菌株M-CY1的影響，因此以1%正庚烷中的脂肪酶活為對(duì)照，觀察目標(biāo)菌株M-CY1的菌體生長情況，測(cè)定脂肪酶活力，結(jié)果見表3。

表3　菌株M-CY1在有機(jī)溶劑中的生長量和脂肪酶活Table 3 Grow th and lipase activity o fstrain M-CY1 in organic solvent

由表3可知，菌株在M-CY1所給的有機(jī)溶劑中都能生長，但生長程度和酶活有所不同，苯和甲醇對(duì)該菌所產(chǎn)脂肪酶有一定抑制作用，而石油醚、二甲苯、液體石蠟和異丙醇能促進(jìn)菌體產(chǎn)脂肪酶。其中二甲苯中菌株M-CY1的脂肪酶最高，為4.99U/m L，相對(duì)酶活為143.76%。

2.5.2甲苯對(duì)高效菌株M-CY1產(chǎn)脂肪酶活力的影響

為了解二甲苯濃度對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶活力的影響，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同含量的二甲苯，測(cè)定其脂肪酶活，結(jié)果見表4。

表4　不同濃度二甲苯對(duì)脂肪酶活的影響Table 4 Effect of differen t xylene concentration on lipase ac tivity

由表4可知，隨著二甲苯含量的升高，脂肪酶活逐漸下降。這可能是由于有機(jī)溶劑直接與酶作用，破壞維持酶蛋白活性構(gòu)型的氫鍵和疏水相互作用，抑制了酶的活性。但在含量高達(dá)50%的二甲苯中，菌體仍然能夠生長，且保持一定脂肪酶活力，說明菌株對(duì)二甲苯具有較高耐受特性。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用橄欖油乳化劑為唯一碳源的羅丹明B平板法初篩從73株葡萄內(nèi)生菌中獲得了7株能夠產(chǎn)脂肪酶的菌株，并以1%的甲苯和正庚烷為篩選壓力復(fù)篩得到1株耐有機(jī)溶劑脂肪酶高效目標(biāo)菌——M-CY1。形態(tài)和分子學(xué)研究表明，M-CY 1為Penicillium asturianum，其產(chǎn)脂肪酶的遺傳性狀穩(wěn)定，且能夠耐受多種有機(jī)溶劑，在二甲苯中生長和產(chǎn)酶情況最好，酶活達(dá)4.99U/m L，且該菌所產(chǎn)脂肪酶能耐受濃度高達(dá)50%的二甲苯溶液，體現(xiàn)了較強(qiáng)的有機(jī)溶劑耐受特性。該菌所產(chǎn)脂肪酶對(duì)有機(jī)溶劑的廣譜耐受性，既為此脂肪酶在非水相介質(zhì)的靶向應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，也為生物降解由這些有機(jī)溶劑導(dǎo)致的環(huán)境污染提供了參考。

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Screening of organic solvent tolerance lipase-producing strains and tolerance property of the lipase

ZHANG Zihan，WANG Chen，DOU Yingchun，LIU Ya*
（College ofFood Science，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China）

Using the endophyte in Xinjiangw inegrapeasoriginalstrain，the strainswere screened preliminarily by oliveoilemulsifier and rhodamine B plate，and screened secondarily by selection pressure of 1%n-heptane and 1%methylbenzene.The lipase production of strain M-CY 1 w ith organic solvent tolerancewasobtained and identified as Penicillium asturianum by themorphology andmolecular biology techniques.The strain had good genetic stability.Theenzymatic activity of the strainwaspositively relatedw ith grow th ofmycelia.A variety of organic solvents for the activity of lipaseproduced from strainshad apromoting effect，and the promoting effectof xylenewas themostobvious.Theenzymeactivitywas4.99U/m l，and the relative enzyme activity reached to 143.76%.

grape；endophyte；organic solvent tolerance lipases；screen；identification

Q93

0254-5071（2016）01-0019-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．01．005

2015-11-08

國家自然科學(xué)基金（31460031）；兵團(tuán)博士資金（2014BB006）

張梓涵（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。

劉婭（1974-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。