向俊蓓，陳　強，萬　謙

(1.四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院　科研處，成都 610100；2.四川新生命干細(xì)胞科技股份有限公司　研發(fā)中心，成都 610036)

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針對代次較多的3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化法的改良

向俊蓓1，陳強2，萬謙2

(1.四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院科研處，成都 610100；2.四川新生命干細(xì)胞科技股份有限公司研發(fā)中心，成都 610036)

3T3-L1細(xì)胞; 誘導(dǎo)分化; 傳代次數(shù)

小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1在特定的誘導(dǎo)條件下，可以分化為成熟的脂肪細(xì)胞，因此，3T3-L1常被作為研究與脂肪相關(guān)疾病(肥胖、糖尿病等)的模型細(xì)胞，而誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞是開展上述研究的前提。

本實驗室的3T3-L1已被傳代10次左右，用經(jīng)典方法誘導(dǎo)時也遇到了細(xì)胞卷邊和收縮嚴(yán)重的問題。結(jié)合上述報道的內(nèi)容，我們適當(dāng)改良了經(jīng)典誘導(dǎo)方法，該方法適用于多次傳代的3T3-L1的誘導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料

小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1購自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞庫，開始本研究時已經(jīng)傳代約10次。

1.2試劑和耗材

3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松(Dex)、胰島素(Ins)、油紅、明膠和二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma；DMEM高糖培養(yǎng)液、牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗(青霉素和鏈霉素)和磷酸緩沖液PBS購自成都哈里公司；細(xì)胞培養(yǎng)用24孔板購自成都溶海公司；IBMX和Dex溶解于DMSO，分別配制成1 000×(0.5 mol/L IBMX和1×10-3mol/L Dex)母液，Ins用0.02 mol/L鹽酸配制成100×1 g/L(母液)。

1.3誘導(dǎo)3T3-L1分化的經(jīng)典方法

1.4誘導(dǎo)3T3-L1分化的改良方法

2　結(jié)果

(a)啟動分化3 d后不同條件下的大尺寸的細(xì)胞分化狀態(tài)對比

圖1(b)和圖1(c)中，箭頭所指為代表性的分化成功的成熟脂肪細(xì)胞；圖中標(biāo)尺代表100 μm。

(b)啟動分化12 d后的改良誘導(dǎo)法同時無明膠處理的分化圖

(c)啟動分化12 d后的改良誘導(dǎo)法同時有明膠處理的分化圖圖1　采用經(jīng)典誘導(dǎo)法和改良誘導(dǎo)法同時有或無明膠處理條件下的3T3-L1分化過程的比較

2.2使用明膠處理后3T3-L1分化成功率提高

圖2為油紅染色圖。由圖1(a)、圖1(c)和圖2可見，同樣使用改良的誘導(dǎo)法，使用明膠處理后，3T3-L1被成功分化為成熟脂肪細(xì)胞的比率更高。

(a)改良的誘導(dǎo)法同時無明膠條件下的3T3-L1

(b)改良的誘導(dǎo)法同時有明膠條件下的3T3-L1圖2　分化15 d后的油紅染色圖

3　討論

本研究對于小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的經(jīng)典誘導(dǎo)法進(jìn)行了改良。經(jīng)實驗驗證，改良后的誘導(dǎo)法能有效避免在誘導(dǎo)分化之初發(fā)生的細(xì)胞卷邊和嚴(yán)重收縮，同時分化成功率也獲得提高。改良方法至少對于傳代次數(shù)在10次左右的3T3-L1細(xì)胞，具有一定的實用性。

文獻(xiàn)[4-5]提到了3T3-L1細(xì)胞傳代次數(shù)對成功分化的影響，建議使用傳代次數(shù)低的細(xì)胞，但是實驗室往往有諸多現(xiàn)實的問題，馬上換用傳代次數(shù)低的3T3-L1細(xì)胞有困難。本實驗室的3T3-L1細(xì)胞就大約有10次左右的傳代，不過通過改良經(jīng)典的誘導(dǎo)法，還是成功獲得了細(xì)胞的分化。所以本研究呈現(xiàn)的改良誘導(dǎo)法對于傳代次數(shù)較多的3T3-L1細(xì)胞可以一試。

改良經(jīng)典的誘導(dǎo)方法并不是本實驗室首創(chuàng)，文獻(xiàn)[6]利用正交試驗，考察了聯(lián)合誘導(dǎo)時IBMX、Dex和Ins用量以及聯(lián)合誘導(dǎo)時間，Ins單獨誘導(dǎo)時間以及Ins用量對3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的影響，其與本文的改良方面雖有所不同，但同樣是對經(jīng)典誘導(dǎo)法進(jìn)行了改變。

4　結(jié)束語

本研究通過改良經(jīng)典的誘導(dǎo)法，對于傳代次數(shù)較多的3T3-L1細(xì)胞獲得了比較令人滿意的結(jié)果，希望對在誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞方面遇到困難的操作者有一定的參考價值。

[1]胡銳，李寶莉，趙勤，等.葛根素對3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化及胰島素抵抗模型糖代謝的影響[J].中藥藥理與臨床，2012，28( 3)：41-43.

[2]風(fēng)信子1013.3T3-L1誘導(dǎo)分化時細(xì)胞飄起來[EB/OL].[2014-08-26].http://www.dxy.cn/bbs/thread/30731437#30731437.

[3]bbs.bbioo.com.3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化問題(脂肪細(xì)胞，傳代)[EB/OL].[2014-12-21].http://www.bbioo.com/experiment/18-391959-1.html.

[4]WO xiamfei1.[求助]3T3-L1誘導(dǎo)分化遇到困難！[EB/OL].[2005-07-04].http://www.dxy.cn/bbs/topic/3744147?ppg=2.

[5]APANGHUANG.3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化[EB/OL].[2014-09-02].http://www.doc88.com/p-5873021860696.html.

[6]王友升，田元元，蔡琦瑋.前體脂肪細(xì)胞3T3-L1誘導(dǎo)分化條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)，2014，32(3)：38-42.

Modification of the Inducing Method for the Differentiation of 3T3-L1 Cells with High Frequency of Doubling Towards Mature Adipocytes

XIANG Junbei1，CHEN Qiang2，WAN Qian2

(1.Research Department，Sichuan Nursing Vocational College，Chengdu 610100，China;2.Research and Developmen Center SichuanNeo-Life Stem Cell Biotech Inc，Chendu 610036，China)

3T3-L1 cells; induced differentiation; cell doubling

2015-02-26；修改日期: 2015-03-18

四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院院級重點課題(2014010)；成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗技術(shù)重點項目(063003)；成都中醫(yī)藥大學(xué)?；痦椖?(ZRMS201248)；2014年四川省科技廳科技支撐計劃項目 (2014SZ0122)。

向俊蓓(1983-)，女，博士，講師，主要從事分子生物學(xué)方面的研究。

R331

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2016.04.09