王　強(qiáng)，李　旭，張旭姣，張慶芳，竇少華，金連豆，遲乃玉*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；3.大連市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，遼寧大連116025）

葡甘聚糖酶高產(chǎn)菌株Q1發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的分離純化

王強(qiáng)1，2，李旭3，張旭姣1，2，張慶芳1，2，竇少華1，2，金連豆1，2，遲乃玉1，2*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622；3.大連市生產(chǎn)力促進(jìn)中心，遼寧大連116025）

該研究以海洋來(lái)源的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Q1為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)葡甘聚糖酶產(chǎn)生菌Q1發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并將菌株Q1發(fā)酵所得上清液經(jīng)硫酸銨沉淀、透析、超濾離心和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析，得到電泳純的葡甘聚糖酶，并研究其部分酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為魔芋粉添加量0.75%、牛肉膏添加量為0.2%，蛋白胨添加量為0.4%、氯化鈉添加量0.4%、培養(yǎng)溫度26℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量5%、初始pH 7.0、裝液量100 m L/250 m L。在此條件下，葡甘聚糖酶酶活為241.61 U/m L。葡甘聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量為41.3 ku；酶最適作用底物為葡甘聚糖。

葡甘聚糖酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化；分離純化

葡甘聚糖酶（glucomannanase）是一種能將葡甘聚糖降解為葡甘低聚糖的外泌酶。葡甘聚糖是魔芋的主要成分，由甘露糖和葡萄糖單元按1.6∶1.0的摩爾比通過(guò)β-1，4-糖苷鍵相連的天然多糖高分子［1-2］。葡甘低聚糖是由葡萄糖和甘露糖組成的雜聚寡糖，最初從酵母的細(xì)胞壁中提取獲得［3］。生物酶法降解葡甘聚糖可通過(guò)兩種途徑：一種是采用微生物代謝產(chǎn)生的葡甘聚糖酶酶解；另一種是從魔芋塊莖中直接提取葡甘聚糖酶酶解。目前常采用的方法是微生物酶解葡甘聚糖，因?yàn)槊冈谖⑸镏衅毡榇嬖?，具有極佳的催化活性，可顯著提高反應(yīng)速度1×106～1×1010倍［4］，并且微生物具有分布廣、種類(lèi)齊全、易于大量制取等特點(diǎn)［5］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于葡甘聚糖酶的研究仍處于起步階段，葡甘聚糖酶產(chǎn)量低，酶活不高［6］，對(duì)葡甘聚糖酶產(chǎn)生菌篩選、分離、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究得到的產(chǎn)葡甘聚糖酶微生物大多來(lái)源于土壤［7-10］，海洋葡甘聚糖酶的研究在國(guó)內(nèi)鮮現(xiàn)。

本研究從海泥和海水樣品中篩選出一株葡甘聚糖酶高產(chǎn)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Q1，以Q1為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化Q1產(chǎn)酶條件，粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析和超濾、Sephadex G-100凝膠柱層析進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。目的是增加葡甘聚糖酶產(chǎn)量，提高酶催化效率，降低生產(chǎn)成本，為葡甘聚糖酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Q1：篩選自大連周邊海域的海泥、海水樣品，現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

保藏培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨0.1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，魔芋粉0.5%，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3主要試劑

蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；魔芋粉：大連凱美化工工程配套有限公司；葡甘聚糖：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱：上海愛(ài)朗儀器有限公司；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HD-1360超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DYY-6C電泳儀：立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司；AL-204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)：廣州市龍煜生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1培養(yǎng)方法

菌株活化：將保存于4℃條件下的斜面菌株接種到保藏培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

種子液制備：將已經(jīng)活化好的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為一級(jí)種子液；

將一級(jí)種子液以5%接種量，接種到種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，作為二級(jí)種子液。

1.3.2甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱(chēng)取100 mg無(wú)水甘露糖（105℃干燥至恒質(zhì)量），用適量蒸餾水將其溶解，并定容至100 m L。取25 m L具塞試管10支，分別加入質(zhì)量濃度1 mg/m L甘露糖溶液0、0.1 m L、0.2 m L、0.3 m L、0.4 m L、0.5 m L、0.6 m L、0.7 m L、0.8 m L、0.9 m L，并加蒸餾水補(bǔ)足至1.0 m L，加入3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑［11］，混合均勻。100℃水浴顯色5 min，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20 m L，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定其吸光度值。以甘露糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，OD540nm值（y）為縱坐標(biāo)繪制甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=0.561 5x，R2=0.999 1。

1.3.3葡甘聚糖酶酶活測(cè)定方法［12］

0.9m L 0.4%葡甘聚糖底物中，加入適當(dāng)稀釋的酶液0.1 m L，30℃水浴10 m in，立即放入100℃水浴5 m in，終止反應(yīng)，然后加入2.0 m L DNS試劑，100℃顯色5 m in，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至20 m L，于波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線及酶活公式計(jì)算酶活。葡甘聚糖酶活定義：在上述反應(yīng)條件下，葡甘聚糖底物每分鐘釋放1 μmol甘露糖的酶量為1個(gè)酶活單位（U）［13］。相對(duì)酶活為樣品酶活與同組最高酶活之比。

1.3.4發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）不同碳源對(duì)酶活的影響

分別選用0.5%的不同碳源（魔芋粉、可溶性淀粉、蔗糖、瓜爾豆膠、比目糖、木聚糖），將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)，下同。

（2）魔芋粉添加量對(duì)酶活的影響

以魔芋粉為碳源，改變培養(yǎng)基中魔芋粉添加量（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%），將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

（3）不同氮源對(duì)酶活的影響

以復(fù)合氮（牛肉膏+蛋白胨、酵母膏+蛋白胨、氯化銨+蛋白胨、氯化銨+硝酸鈉）作為氮源，將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

（4）牛肉膏與蛋白胨配比對(duì)酶活的影響

改變牛肉膏與蛋白胨配比（0.1%∶0.4%、0.1%∶0.3%、0.1%∶0.2%、0.2%∶0.4%、0.2%∶0.3%、0.3%∶0.3%、0.3%∶0.4%、0.1%∶0.1%），將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

（5）氯化鈉添加量對(duì)酶活的影響

氯化鈉添加量分別為（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

（6）初始pH對(duì)酶活的影響

初始pH分別設(shè)置為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

（7）培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響

在24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、37℃的恒溫?fù)u床中，將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r/min振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

（8）轉(zhuǎn)速對(duì)酶活的影響

在不同轉(zhuǎn)速（130 r/m in、140 r/m in、150 r/m in、160 r/m in、170 r/min）恒溫?fù)u床中，將二級(jí)種子液以5%接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

（9）裝液量對(duì)酶活的影響

分別按不同裝液量（50 m L/250 m L、75 m L/250 m L、100 m L/250 m L、125 m L/250 m L、150 m L/250 m L、175 m L/ 250 m L）裝入發(fā)酵培養(yǎng)基，將二級(jí)種子液以5%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)55h后測(cè)定酶活。

（10）接種量對(duì)酶活的影響

分別設(shè)置不同接種量（3%、4%、5%、6%、7%）的發(fā)酵培養(yǎng)基，26℃、160 r/m in振蕩培養(yǎng)55 h后測(cè)定酶活。

1.3.5酶的分離純化

（1）粗酶液制備

將菌株Q1二級(jí)種子液以5%接種量接種到裝液量為100 m L/250 m L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，26℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)55 h，發(fā)酵液經(jīng)4℃、6 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

（2）硫酸銨沉淀

參照硫酸銨鹽析溶解度表，向粗酶液中加入硫酸銨固體，使硫酸銨飽和度分別為30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%，置于4℃冰箱中過(guò)夜，10 000 r/min離心20 min，沉淀分別用1 m L磷酸緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行溶解。取每個(gè)飽和度的上清和沉淀分別測(cè)定酶活，并繪制鹽析曲線。

（3）透析和超濾

將鹽析得到的樣品裝入預(yù)先處理好的透析袋（截留分子質(zhì)量14 000 u）中，4℃條件下透析，期間更換透析液，直至透析液中檢測(cè)無(wú)SO42-為止；將完成透析的樣品轉(zhuǎn)移到10 ku超濾管中，4℃、4 000 r/min離心10 min，測(cè)定酶活。

（4）Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析

將凝膠柱、蛋白檢測(cè)儀、自動(dòng)收集器和電腦正確連接，保持蛋白檢測(cè)儀T值為100；待基線平衡以后，將超濾后的濃縮酶液2m L加入SephadexG-100凝膠柱（Ф1.6 cm×60 cm）中，使洗脫速度保持在0.3 m L/min；調(diào)節(jié)自動(dòng)收集器，使每個(gè)試管的收集時(shí)間為4 m in，根據(jù)顯示器上的洗脫峰，收集相應(yīng)試管洗脫液，測(cè)定酶活。

1.3.6部分酶學(xué)性質(zhì)

（1）最適作用底物

在酶最適作用條件下，分別以0.4%的淀粉、葡甘聚糖、瓜爾豆膠、魔芋粉作為底物，測(cè)定酶活，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）相對(duì)分子質(zhì)量確定

通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylam ide gel electrophoresis，SDSPAGE）確定葡甘聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量。電泳條件為：12%分離膠濃度，5%濃縮膠濃度，30 mA恒流電泳2.5 h，考馬斯亮藍(lán)R-250染色1 h，乙醇醋酸脫色6 h，期間需要更換脫色液，直至凝膠變透明，出現(xiàn)清晰的條帶。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1不同碳源對(duì)酶活的影響

由圖1可知，當(dāng)用魔芋粉作為碳源時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活達(dá)到100%，瓜爾豆膠次之為69%，而以可溶性淀粉、蔗糖、木聚糖、比目糖作為碳源時(shí)，相對(duì)酶活幾乎為零。因此，該菌產(chǎn)生的葡甘聚糖酶為一種魔芋粉特異性誘導(dǎo)酶［15］，故選擇魔芋粉為最適碳源。

圖1　碳源種類(lèi)對(duì)酶活的影響Fig.1 Effect of carbon source types on enzym e activity

2.1.2魔芋粉添加量對(duì)酶活的影響

魔芋粉主要成分是葡甘聚糖，葡甘聚糖具有凝膠性，濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致葡甘聚糖成為凝膠小球，不利于菌株Q1利用，影響酶的合成，而魔芋粉濃度過(guò)低則不利于酶的大量合成。由圖2可知，當(dāng)魔芋粉添加量為0.75%時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到100%；魔芋粉添加量為0.25%、0.50%、1.00%時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活均不足80%，由于不同研究中使用的魔芋粉黏度以及純度各不相同，且不同菌株利用魔芋粉的能力有差別［16-17］。因此，選擇魔芋粉最適添加量為0.75%。

圖2　魔芋粉添加量對(duì)酶活的影響Fig.2 Effec t of konjaku flour addition on enzym e activity

2.1.3復(fù)合氮源對(duì)酶活的影響

本研究中適合菌株Q1產(chǎn)酶的氮源組合為復(fù)合氮源，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中牛肉膏與蛋白胨添加量分別為0.1%與0.3%，酵母膏與蛋白胨的添加量分別為0.1%與0.3%，氯化銨與蛋白胨的添加量分別為0.1%與0.3%，氯化銨與硝酸鈉的添加量分別為0.1%與0.3%。由圖3可知，以牛肉膏與蛋白胨為復(fù)合氮源時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活達(dá)到100%；酵母膏與蛋白胨為復(fù)合氮源時(shí)，相對(duì)酶活次之，為79%，氯化銨與蛋白胨作為復(fù)合氮源時(shí)，相對(duì)酶活最低，僅為67%。因此，選擇牛肉膏與蛋白胨復(fù)合氮源為最適氮源。

圖3　復(fù)合氮源種類(lèi)對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of com pound nitrogen source types on enzym e ac tivity

2.1.4牛肉膏與蛋白胨配比對(duì)酶活的影響

由圖4可知，當(dāng)牛肉膏與蛋白胨配比為0.2%∶0.4%時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活達(dá)到100%；當(dāng)牛肉膏與蛋白胨配比分別為0.1%∶0.4%、0.1%∶0.3%、0.1%∶0.2%時(shí)，相對(duì)酶活均不足60%；當(dāng)牛肉膏與蛋白胨質(zhì)量比分別為0.2%∶0.3%、0.1%∶0.1%、0.3%∶0.4%、0.3%∶0.3%時(shí)，相對(duì)酶活也呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明氮源濃度過(guò)低不利于酶的大量合成，氮源濃度過(guò)高對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定抑制作用，影響酶的合成［18］。因此，當(dāng)牛肉膏與蛋白胨的配比為0.2%∶0.4%時(shí)，最適合菌體生長(zhǎng)。

圖4　牛肉膏與蛋白胨質(zhì)量比對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of beef extract and peptone m ass ratio on enzyme activity

2.1.5氯化鈉添加量對(duì)酶活的影響

圖5　氯化鈉添加量對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of sodium chloride addition on enzyme activity

由圖5可知，氯化鈉添加量在0.1%～0.4%時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活呈上升趨勢(shì)，氯化鈉添加量為0.4%時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到100%，氯化鈉添加量＞0.4%時(shí)，相對(duì)酶活呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于菌株產(chǎn)酶，適量氯化鈉對(duì)Q1產(chǎn)酶有促進(jìn)作用。因此，氯化鈉最適添加量為0.4%。

2.1.6初始pH對(duì)酶活的影響

菌株生長(zhǎng)需要適合的pH，產(chǎn)物合成也需要適宜的pH［19］。由圖6可知，初始pH值為7.0時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到100%；初始pH值為6.0時(shí)，Q1產(chǎn)酶相對(duì)酶活達(dá)到80%，pH 5.0、pH 8.0、pH 9.0時(shí)，相對(duì)酶活不高，均在60%左右，說(shuō)明該菌具有一定的耐酸性。因此，菌株發(fā)酵最適初始pH值為7.0。

圖6　初始pH對(duì)酶活的影響Fig.6 Effec t of initial pH on enzym e ac tivity

2.1.7培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響

由圖7可知，在26℃時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活為100%，此后，隨著溫度的升高，相對(duì)酶活越來(lái)越低，說(shuō)明菌株Q1是低溫菌，高溫條件會(huì)影響其生長(zhǎng)，進(jìn)而影響其產(chǎn)酶。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)溫度低于熊郃等［20-21］研究所得的培養(yǎng)溫度，可能是因?yàn)榫闝1是從海洋樣品中篩選得來(lái)，海洋環(huán)境溫度較低。因此，最適培養(yǎng)溫度為26℃。

圖7　培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of culture tem perature on enzyme activity

2.1.8轉(zhuǎn)速對(duì)酶活的影響

轉(zhuǎn)速主要調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程中的通氧量，轉(zhuǎn)速過(guò)低，通氣量小，發(fā)酵液溶氧不夠，不利于菌體生長(zhǎng)繁殖及酶的合成；轉(zhuǎn)速過(guò)快，會(huì)導(dǎo)致菌體自溶［22］。由圖8可知，轉(zhuǎn)速在130～160 r/min之間時(shí)，相對(duì)酶活逐漸增加；轉(zhuǎn)速為160 r/m in時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到100%；轉(zhuǎn)速＞160 r/min時(shí)，相對(duì)酶活開(kāi)始下降。因此，最適轉(zhuǎn)速為160 r/m in。

圖8　轉(zhuǎn)速對(duì)酶活的影響Fig.8 Effec t of rotate speed on enzym e activity

2.1.9裝液量對(duì)酶活的影響

由圖9可知，裝液量為100 m L/250 m L時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活達(dá)到100%；裝液量為50～75 m L/250 m L時(shí)，相對(duì)酶活為70%左右，說(shuō)明此時(shí)溶氧量相對(duì)適宜，對(duì)菌體產(chǎn)酶有較好的促進(jìn)作用。裝液量為100～175 m L/250 m L時(shí)，酶活呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)溶氧量較少，影響菌株產(chǎn)酶。因此，最適裝液量為100 m L/250 m L。

圖9　裝液量對(duì)酶活的影響Fig.9 Effect of liquid volume on enzyme activity

2.1.10接種量對(duì)酶活的影響

圖10　接種量對(duì)酶活的影響Fig.10 Effect of inoculum on enzyme activity

由圖10可知，當(dāng)接種量為3%～4%時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活較低，均不足60%；接種量為5%時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到100%，之后隨著接種量的增加，相對(duì)酶活反而下降，由于通氣量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等因素的限制，所以發(fā)酵液中的菌體數(shù)量不宜過(guò)多。因此，最適接種量為5%。

2.2酶的分離純化

2.2.1硫酸銨鹽析曲線

從圖11可知，當(dāng)硫酸銨的飽和度達(dá)到45%的時(shí)候，沉淀中開(kāi)始測(cè)得葡甘聚糖酶酶活，而上清液中的葡甘聚糖酶酶活開(kāi)始下降，當(dāng)硫酸銨的飽和度達(dá)到75%的時(shí)候，上清液中幾乎沒(méi)有葡甘聚糖酶的活性，而沉淀中的葡甘聚糖酶酶活達(dá)到最高，因此可以確定硫酸銨分段鹽析沉淀葡甘聚糖酶的范圍為45%～75%。

圖11　硫酸銨鹽析曲線Fig.11 Curve of ammonium sulfate salting-out

2.2.2Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析

由圖12可知，超濾后的酶液經(jīng)過(guò)Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析，出現(xiàn)5個(gè)蛋白吸收峰，但經(jīng)過(guò)酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，僅在16#～34#管的收集液中有葡甘聚糖酶活性。將收集的葡甘聚糖酶液保存于4℃冰箱中，進(jìn)行后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的研究。

圖12　Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析Fig.12 Gel filtration chrom atogram of Sephadex G-100

2.2.3酶部分性質(zhì)

（1）酶最適作用底物

魔芋粉和瓜爾豆膠的主要成分都是葡甘聚糖，但葡甘聚糖含量不同，導(dǎo)致葡甘聚糖酶對(duì)其水解程度不同。由圖13可知，以葡甘聚糖作用底物時(shí)，葡甘聚糖酶相對(duì)酶活達(dá)到100%，魔芋粉次之為83%，可溶性淀粉作為底物時(shí)，相對(duì)酶活最低，僅為8%，故葡甘聚糖酶最適作用底物為葡甘聚糖。

圖13　酶最適作用底物Fig.13 The optimum substra te of glucomannanase

（2）相對(duì)分子質(zhì)量

將粗酶液、鹽析酶液和純化后的葡甘聚糖酶取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖14所示，根據(jù)分子量和相對(duì)遷移率的關(guān)系，計(jì)算出葡甘聚糖酶的分子質(zhì)量為41.3 ku。

圖14　SDS-PAGE電泳圖Fig.14 Electrophoretogram of SDS-PAGE

3　結(jié)論

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了海洋來(lái)源的枯草芽孢桿菌Q1的發(fā)酵條件，目的是獲得更高活性的葡甘聚糖酶，并對(duì)葡甘聚糖酶進(jìn)行分離純化，研究其部分酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，優(yōu)化發(fā)酵條件為：魔芋粉添加量0.75%、牛肉膏與蛋白胨添加量分別為0.2%與0.4%，氯化鈉添加量0.4%、培養(yǎng)溫度26℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量5%、初始pH 7.0、裝液量100 m L/250 m L。酶最適作用底物為葡甘聚糖；酶的相對(duì)分子質(zhì)量為41.3 ku。發(fā)酵條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，測(cè)得Q1產(chǎn)葡甘聚糖酶酶活為241.61 U/m L。

［1］RATCLIFFE I，WILLIAMS P A，VIEBKE C，et al.Physicochemical characterization of konjac glucomannan［J］.Biomacromolecules，2005，6（4）：1977-1986.

［2］鐘燕，索化夷.魔芋葡甘聚糖的功能及在食品領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.中國(guó)釀造，2014，33（8）：6-9.

［3］李春松，戴晉軍，李彪.酵母細(xì)胞壁多糖對(duì)免疫功能的作用機(jī)制［J］.飼料研究，2012（2）：22-23.

［4］STEWART K K，EBEL R E.Chemical measurements in biological systems［M］.Beijing：W iley-Interscience，2000：32-33.

［5］董桂清.產(chǎn)葡甘聚糖酶菌株的篩選及酶的分離純化［D］.南寧：廣西大學(xué)碩士論文，2007.

［6］周海燕，楊三東，周大寨，等.發(fā)酵生產(chǎn)魔芋葡甘聚糖酶［J］.中國(guó)生物工程雜志，2005，25（3）：65-68.

［7］曲麗娜.β-甘露聚糖酶的發(fā)酵優(yōu)化和性質(zhì)研究［D］.濟(jì)南：齊魯工業(yè)大學(xué)碩士論文，2013.

［8］鄔建國(guó)，吳風(fēng)，劉峰，等.乳白耙菌β-葡甘聚糖酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2009，37（7）：88-90.

［9］王靜.β-甘露聚糖酶的制備與分離純化的研究［D］.南京：南京林業(yè)大學(xué)碩士論文，2012.

［10］廖婷婷，翟磊，高成華，等.一株產(chǎn)甘露聚糖酶菌株的分離鑒定及酶的純化與性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報(bào)，2011，51（11）：1520-1526.

［11］張居作，李志波，徐君飛.產(chǎn)酸性甘露聚糖酶菌株的篩選、鑒定及酶活性研究［J］.中國(guó)釀造，2014，33（11）：63-66.

［12］馮娜，趙君，趙敏.β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌DY-14的發(fā)酵條件及分離純化［J］.黑龍江醫(yī)藥，2011（3）：397-401.

［13］李江華，房俊，鄔顯章.黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶的搖瓶發(fā)酵條件［J］.江蘇食品與發(fā)酵，2002，12（4）：16-18.

［14］陳思洋.發(fā)酵法生產(chǎn)魔芋葡甘聚糖酶［D］.長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2012.

［15］許劍，孫學(xué)哲，陳強(qiáng)，等.一株產(chǎn)常溫葡甘聚糖酶的芽孢桿菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶發(fā)酵條件的研究［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2012，31（5）：422-429.

［16］周海燕.酶法生產(chǎn)魔芋葡甘低聚糖研究［D］.長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2004.

［17］陳一平，龍劍兒，廖連華，等.芽孢桿菌M 50產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的條件研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2000，40（1）：62-68.

［18］孫子羽，遲乃玉，李兵，等.響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.中國(guó)釀造，2010，29（7）：110-114.

［19］吳鵬，王知龍，吳秀.黑曲霉HS-5高產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國(guó)釀造，2015，34（3）：54-57.

［20］熊郃，干信.β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌R10發(fā)酵條件研究［J］.湖北工學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19（1）：17-19.

［21］成莉鳳，戴小陽(yáng)，馮湘沅，等.Bacillus subtilis BE-91生長(zhǎng)及其胞外表達(dá)β-甘露聚糖酶的發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（12）：2300-2307.

［22］孫倩，陳復(fù)生，丁長(zhǎng)河，等.地衣芽孢桿菌產(chǎn)堿性蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（13）：174-177.

Optimization of fermentation conditions of high glucomannanase-producing strain Q1 and separation and purification of the enzyme

WANG Qiang1，2，LI Xu3，ZHANG Xujiao1，2，ZHANG Qingfang1，2，DOU Shaohua1，2，JIN Liandou1，2，CHI Naiyu1，2*
（1.College of Life Science and Technology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.Liaoning Technology of Marine M icrobiological Engineering Research Center，Dalian 116622，China；3.Dalian Productivity Promote Center，Dalian 116025，China）

Using Bacillus subtilis Q1 from marine as original strain，the fermentation conditions of the glucomannanase-producing strain Q1 were optim ized by single factor experiments.The glucomannanase from the supernatant liquor was purified using ammonium sulfate precipitation，dialysis，ultrafiltration and gel filtration chromatogram of Sephadex G-100，and its enzymatic properties were researched.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows：konjaku flour 0.75%，beef extract 0.2%，peptone 0.4%，sodium chloride 0.4%，culture temperature 26℃，rotate speed 160 r/m in，inoculum 5%，initial pH 7.0，liquid volume 100 m l/250 m l.Under the conditions，the enzyme activity was up to 241.61 U/m l. The relative molecular mass of the glucomannanase was determ ined to be 41.3 ku.The optimum substrate of the enzyme was glucomannan.

glucomannanase；fermentation conditions；optim ization；separation and purification

TQ925

0254-5071（2016）05-0086-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．018

2016-02-23

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’項(xiàng)目（2007AA021306）

王強(qiáng)（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锩钢苿┭芯俊?/p>

遲乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锩钢苿┭芯俊?/p>