包京姍，韓鳳波，畢　博*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

D-101大孔吸附樹(shù)脂純化玉米須總黃酮工藝研究

包京姍1，韓鳳波2，畢博2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林132101）

通過(guò)超聲波提取玉米須總黃酮，采用D-101大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化，得到最佳工藝參數(shù)：5 g大孔吸附樹(shù)脂，玉米須總黃酮上樣液質(zhì)量濃度7 mg/m L，體積1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH=3，體積分?jǐn)?shù)60%乙醇洗脫，洗脫體積5 BV，流速1.0 m L/m in。在此條件下，玉米須總黃酮的純度由41.35%提高到69.20%。

D-101大孔吸附樹(shù)脂；玉米須；總黃酮；純化

玉米須（Stigma maydis）為禾本科植物玉蜀屬植物玉米（Zea mays L.）的花柱與柱頭［1］。其味淡、性平，歸陽(yáng)明經(jīng)，現(xiàn)代藥理研究證明，玉米須有顯著的利尿、降血糖、降壓、抑菌、抗癌、增強(qiáng)免疫等功效，用于治療腎炎、膽結(jié)石、糖尿病、黃疸、乳糜血尿、麻疹、血崩等癥，玉米須在民間常用于藥茶、藥膳中，作為糖尿病、高血壓的輔助治療藥物［2-5］。劉璐等［6-7］研究表明玉米須總黃酮具有抗氧化活性；王燕［8］研究結(jié)果顯示玉米須總黃酮對(duì)四氯化碳誘使肝損傷的保護(hù)作用；景怡等［9］研究顯示：玉米須總黃酮可有效降低糖尿病高脂血癥大鼠血糖及血脂水平，提高抗氧化能力。黃曉巍等［10］研究玉米須總黃酮能減降低糖尿病合并心肌缺血大鼠血清中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LD）、糖化血紅蛋白（haemoglobin Alc，HbAlc）含量，達(dá)到治療糖尿病的效果，可見(jiàn)玉米須具有開(kāi)發(fā)前景。

黃酮類(lèi)化合物是玉米須中主要成分之一，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取玉米須總黃酮，大孔樹(shù)脂分離純化，考察純化率。通過(guò)考察D-101上樣液pH值、上樣濃度、洗脫劑濃度、洗脫體積、流速［11-13］，確定優(yōu)化分離純化工藝，研究結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用玉米須提供一定的理論參考和指導(dǎo)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

玉米須采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田；D-101大孔樹(shù)脂：河北祥泰藍(lán)星精細(xì)化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、HCl、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等（均為分析純）：北京化工廠。

1.2儀器與設(shè)備

AUW 120D電子天平：日本島津公司；SY-180超聲波清洗器：上海寧商超聲儀有限公司；EYEAL N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化公司；U-2900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本日立有限公司；TS-100C恒溫?fù)u床：上海善志儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品液制備

鮮玉米須去雜，60℃干燥至質(zhì)量恒定。取體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，料液比1∶30（g∶m L），超聲溫度60℃，超聲時(shí)間30 m in，超聲功率400 W［14-17］條件下超聲提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至棕褐色浸膏，石油醚萃取，重復(fù)至石油醚層無(wú)色，取脫脂后水層，用乙酸乙酯萃取，重復(fù)上述操作3次。合并乙酸乙酯萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀，60℃恒溫烘干，得玉米須總黃酮粗提物。

1.3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定以及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱(chēng)取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.25 mg置于25 m L的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇定容，制得質(zhì)量濃度0.21 mg/m L的對(duì)照品溶液。取蘆丁對(duì)照品溶液1 m L，置于10 m L容量瓶中并加入5%NaNO20.3 m L搖勻，放置6 m in后，再加入0.3 m L 10%Al（NO3）3，搖勻，靜置6 min后再加入3 m L 1 mol/L NaOH，混勻，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇定容至刻度，放置15 min。取體積分?jǐn)?shù)50%乙醇1 m L同上操作作為空白對(duì)照溶液。在波長(zhǎng)200～800 nm的范圍內(nèi)掃描吸收曲線。結(jié)果表明，在波長(zhǎng)506 nm處吸光度值達(dá)到最大。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1.0 m L、1.5 m L、2.0 m L、2.5 m L、3.0 m L、3.5 m L、4.0 m L分別放置于10 m L容量瓶中，按上述總黃酮檢測(cè)方法，在波長(zhǎng)506 nm處測(cè)定其吸光度值，以蘆丁質(zhì)量濃度-吸光度值作圖，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3玉米須總黃酮含量測(cè)定

精密稱(chēng)取玉米須總黃酮粗提物0.594 4 g，置于10 m L容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇定容，取1 m L溶液在波長(zhǎng)506 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)，稀釋適宜倍數(shù)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算玉米須總黃酮的含量。玉米須中總黃酮純度計(jì)算公式如下：

式中：C為測(cè)出的吸光度值對(duì)應(yīng)的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品的體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4大孔樹(shù)脂吸附率測(cè)定

取玉米須總黃酮上樣液6份，每份各1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH，分別加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后過(guò)濾，采用1.3.3方法測(cè)定吸光度值，重復(fù)3次，計(jì)算吸附率，其計(jì)算公式如下：

吸附率=［初始質(zhì)量濃度（mg/m L）-吸附后質(zhì)量濃度（mg/mL）］×溶液體積（mL）/樹(shù)脂質(zhì)量（g）×100%

1.3.5D-101大孔樹(shù)脂純化工藝優(yōu)化

D-101大孔樹(shù)脂，用蒸餾水充分淋洗干凈，除去表面雜質(zhì)，用無(wú)水乙醇浸泡24 h，充分泡脹后，棄無(wú)水乙醇，用蒸餾水洗滌至無(wú)醇味，以5%HCl溶液浸泡，用蒸餾水洗至中性，再以5%NaOH溶液浸泡，蒸餾水洗至中性，備用。

（1）上樣液pH值的考察：取玉米須總黃酮上樣液6份，每份各1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH=1、2、3、4、5、6，分別加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后過(guò)濾，采用1.3.3方法測(cè)定吸光度值，重復(fù)三次，計(jì)算吸附率，確定適宜pH。

（2）洗脫液濃度的考察：取玉米須總黃酮上樣液6份，各1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后，分別加入體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、75%、90%的乙醇振搖24 h，過(guò)濾，測(cè)定吸光度值，確定最佳洗脫液濃度值。

（3）上樣液質(zhì)量濃度的考察：取按照純度核算后的總黃酮提取液，稀釋成10mg/m L、9mg/m L、8mg/m L、7mg/m L、6 mg/m L、5 mg/m L（按照黃酮質(zhì)量濃度計(jì)算）的玉米須總黃酮溶液1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，加入裝有5g D-101大孔樹(shù)脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后，濾出上清液，以鹽酸-鎂粉反應(yīng)檢測(cè)，確定上樣液質(zhì)量濃度。

（4）洗脫流速的考察：取1.3.5（3）確定的上樣液濃度，調(diào)節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，13.4（2）確定的體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂柱，流速分別設(shè)為0.5 m L/m in、1.0 m L/m in、2.0 m L/m in、3.0 m L/min，收集洗脫液，測(cè)定吸光度值，確定最佳流速。

（5）洗脫液體積的考察：取1.3.5（3）確定的上樣液濃度，調(diào)節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，1.3.5（2）確定的體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂柱，流速按照1.3.5（4）確定最佳流速，分別用體積為2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV、7 BV、8 BV的洗脫液洗脫，取最后洗脫液約1 m L，計(jì)算總黃酮含量，確定最佳洗脫液體積。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，波長(zhǎng)506nm處的吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=8.605 4x-0.001 4，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 6。表明吸光度值與蘆丁質(zhì)量濃度之間線性關(guān)系良好。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2D-101大孔樹(shù)脂純化工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1上樣液pH值的考察

取玉米須總黃酮提取物以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇稀釋?zhuān)?jīng)檢測(cè)為12.492 mg/m L，吸取6份作為上樣液，每份各1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH=1、2、3、4、5、6，分別加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后過(guò)濾，采用1.3.2方法測(cè)定吸光度值，重復(fù)三次，按1.3.4（1）計(jì)算吸附率。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　不同pH值對(duì)吸光度值的影響Fig.2 Effects of d ifferent pH on absorbance value

由圖2可知，不同的pH條件對(duì)于黃酮類(lèi)存在形式有影響，且會(huì)導(dǎo)致D-101大孔樹(shù)脂對(duì)于黃酮類(lèi)成分的吸附性能改變，pH=3的吸光度值最低，被吸附的黃酮成分最多，經(jīng)過(guò)計(jì)算，吸附率達(dá)到90.3%，黃酮類(lèi)成分以更易于大孔樹(shù)脂吸附的形式存在，故確定上樣液的pH=3。

2.2.2洗脫液濃度的考察

取12.492 mg/m L的上樣液6份，各1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH=3，加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、75%、90%的乙醇振搖24 h，過(guò)濾，測(cè)定吸光度值，確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)吸光度值的影響Fig.3 Effects of different ethanol concentration on absorbance value

由圖3可知，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫樹(shù)脂，60%乙醇洗脫液吸光度值最大，故選擇體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇作為洗脫劑。

2.2.3上樣液質(zhì)量濃度的考察

取按照純度核算后的總黃酮提取液，稀釋成10 mg/m L、9 mg/m L、8 mg/m L、7 mg/m L、6 mg/m L、5 mg/m L（按照總黃酮質(zhì)量濃度計(jì)算）的玉米須總黃酮溶液1 m L，以HCl調(diào)節(jié)pH=3，加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中振搖24 h后，濾出上清液，以鹽酸-鎂粉反應(yīng)檢測(cè)，確定上樣濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　最佳上樣濃度的確定Table 1 Determination o f loading concentration

由表1可見(jiàn)，1 m L溶液含有玉米須總黃酮8 mg時(shí)，鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，顯示未完全吸附，7mg時(shí)陰性反應(yīng)顯示完全被吸附，吸附量在7～8 mg之間，為了減少損失，確定D-101大孔吸附樹(shù)脂的最佳上樣濃度以總黃酮核算為7 mg/m L。

2.2.4洗脫流速的考察

取7 mg/m L上樣液，調(diào)節(jié)pH=3，體積分?jǐn)?shù)60%乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入5 g D-101大孔樹(shù)脂柱，流速分別設(shè)為0.5 m L/min、1.0 m L/min、2.0 m L/min、3.0 m L/min，收集洗脫液，測(cè)定吸光度值，確定最佳流速，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4　不同解吸流速對(duì)吸光度值的影響Fig.4 Effects of different desorption velocity on absorbance value

由圖4可知，吸光度值隨著流速的增加反而減小，也就是洗脫率隨著流速的增加而減小，但是流速為0.5 m L/m in和1.0 m L/m in時(shí)，吸光度值沒(méi)有明顯變化。考慮到流速過(guò)慢，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程和生產(chǎn)效率，所以確定1.0 m L/min作為最佳流速。

2.2.5洗脫液體積的考察

圖5　不同洗脫體積對(duì)于吸光度值的影響Fig.5 Effects of different elution volume on absorbance value

以上述優(yōu)化條件，取7 mg/m L上樣液，調(diào)節(jié)pH=3，體積分?jǐn)?shù)60%乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入裝有5 g D-101大孔樹(shù)脂柱，流速分別設(shè)為1.0 m L/min，分別用體積為2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV、7 BV、8 BV的洗脫液洗脫，取最后洗脫液約1 m L，測(cè)定總黃酮含量，考察洗脫程度，確定最佳洗脫液體積，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨著洗脫液體積增多，總黃酮含量逐漸減少，當(dāng)洗脫液體積從5 BV增加到7 BV時(shí)，黃酮含量幾乎為0，說(shuō)明在洗脫體積5 BV條件下洗脫基本完全。為減小浪費(fèi)，故選擇洗脫液體積為5 BV。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

確定的純化工藝為：按5 g D101大孔吸附樹(shù)脂計(jì)算，取質(zhì)量濃度為7 mg/m L的玉米須總黃酮溶液（以玉米須總黃酮計(jì)）1 m L，用HCl調(diào)節(jié)pH=3，以5 BV體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇洗脫，流速1.0 m L/min，可以達(dá)到純化目的。按照確定工藝的四倍放大，進(jìn)一步考察工藝的穩(wěn)定性，取處理好的D-101大孔樹(shù)脂20 g，按照確定的最佳工藝純化，烘干洗脫液至質(zhì)量恒定，測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算純度，重復(fù)3次，考察工藝穩(wěn)定性，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　驗(yàn)證試驗(yàn)及穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 2 Results o f verification test and stability test

由表2可知，在優(yōu)化的工藝條件下，通過(guò)D-101大孔樹(shù)脂對(duì)玉米須總黃酮進(jìn)行純化，玉米須總黃酮純度由41.35%提高到69.20%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果結(jié)果顯示：三次平行試驗(yàn)RSD偏差小，條件比較穩(wěn)定，工藝可行。

3　結(jié)論

玉米須提取后，經(jīng)石油醚脫脂，乙酸乙酯初步純化后，D-101型大孔吸附樹(shù)脂可以用于玉米須總黃酮的分離純化。確定了純化最佳工藝參數(shù)為：玉米須總黃酮提取液上樣液質(zhì)量濃度為7 mg/m L（以玉米須總黃酮計(jì)），用HCl調(diào)節(jié)pH=3，以5 BV體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇洗脫，流速1.0 m L/m in，可以達(dá)到純化玉米須總黃酮的目的，純化后玉米須總黃酮的純度由41.35%提高到了69.20%。D-101型大孔吸附樹(shù)脂作為純化手段現(xiàn)已普遍應(yīng)用到大生產(chǎn)中，本研究結(jié)果簡(jiǎn)便易行，純度有所提高，達(dá)到69.20%，分離量大，條件可控，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Purification process of total flavonoid from Stigma maydis by D-101 macroporous adsorption resins

BAO Jingshan1，HAN Fengbo2，BI Bo2*
（1.College of Traditional Medicine，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Jilin Agricultural Science and Techno logy University，Jilin 132101，China）

Total flavonoids were extracted from Stigma maydis by ultrasonic extraction，and then they were separated and purified by D-101 macroporous adsorption resin.The optimal extraction condition was that D-101 macroporous adsorption resin 5 g，samples concentration 7.0 mg/m l，volume 1 m l，then adjust to pH 3 w ith HCl，elute w ith concentration 60%ethanol，w ith elute colume 5 BV and velocity 1.0 m l/min.The purification degree of total flavonoids in S.maydis increased from 41.35%to 69.20%.

D-101 macroporous adsorption resin；Stigma maydis；total flavonoids；purification

R284．2

0254-5071（2016）05-0171-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．036

2015-11-21

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科培育資助項(xiàng)目（吉農(nóng)院合字2014第z016號(hào)）

包京姍（1982-），女，實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参锾崛∨c分離。

畢博（1982-），男，講師，博士，研究方向?yàn)樗幱弥参锾崛?、分離、分析。